肖夏,胡藝春,楊麗,邢廣宇,汪成忠

(1 江蘇三維園藝有限公司,江蘇 昆山 215016;2蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,江蘇 蘇州 215008)

土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用,在土壤養(yǎng)分循環(huán)利用、植物生長發(fā)育、植物抗逆性及維持根系平衡方面具有十分重要的作用。對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性的探究,可以了解植物根際土壤生態(tài)的平衡和穩(wěn)定[1-3]。已有研究表明,土壤微生物對(duì)季節(jié)、海拔及土壤深度方面都具有獨(dú)特的物種結(jié)構(gòu)和分布格局[4-6]。土壤深度被認(rèn)為是土壤性質(zhì)的生態(tài)過濾器,沿著土壤剖面形成高度異質(zhì)性的梯度環(huán)境,影響土壤微生物群落的多樣性、組成和功能[1]。由于深層土壤受到地上的干擾較低,其土壤微生物的結(jié)構(gòu)和組成更能反映土壤原本的微生物,但目前對(duì)底層土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)及功能研究仍滯后于表層土壤[7]。此外,深層土壤儲(chǔ)存了大量的微生物,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,對(duì)深層土壤微生物的探究有利于闡釋植物連作障礙的發(fā)生機(jī)制[4]。

油用牡丹是我國十分重要的一種經(jīng)濟(jì)兼觀賞花卉,具有壽命長、產(chǎn)量高、結(jié)實(shí)能力強(qiáng)的特點(diǎn),目前在中國南方廣泛種植[8]。鳳丹(Paeoniaostii)是我國廣泛種植的油用牡丹品種,其種子含有豐富的不飽和脂肪酸和白藜蘆醇等物質(zhì),在食品和藥品領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值[9]。但因耕地不足及需求量的增加,油用牡丹通常連年種植,開花量和產(chǎn)籽量降低,病蟲害發(fā)生嚴(yán)重,再植后出現(xiàn)生長緩慢、生長勢差、根系不發(fā)達(dá)的情況,連作障礙已成為制約鳳丹種植的主要因素之一[10-12]。郭麗麗等探究了鳳丹不同種植時(shí)間根際細(xì)菌群落的多樣性變化,以及不同種植模式下鳳丹根際微生物群落機(jī)構(gòu)及多樣性,而關(guān)于油用牡丹土壤根際微生物群落組成和結(jié)構(gòu)分布格局尚不明晰[13-14]。本試驗(yàn)采用Mesiq高通量測序技術(shù),對(duì)安徽銅陵牡丹園不同深度土壤的鳳丹根際細(xì)菌群落組成及結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,闡明在不同土壤深度下鳳丹根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成規(guī)律及分布格局,為后續(xù)深入研究鳳丹土壤微生物環(huán)境奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究地位于安徽省銅陵市(E 118°01′13.39″,N 30°52′14.28″),為亞熱帶季風(fēng)氣候,全年溫暖濕潤,濕度較大,雨熱同季,無霜期較長。年平均降水量為1 384.7 mm,蒸發(fā)量1 280 mm。年平均氣溫16.2 ℃,極端高溫41 ℃,極端低溫為-11.9 ℃,無霜期年平均為230 d,全年日照為2 000～2 050 h,土壤以黃紅壤土和黃褐土為主。

1.2 試驗(yàn)材料

供試土壤取自鳳凰山牡丹園,面積15 hm2。在園區(qū)選擇位置一致、耕作管理一致、長勢良好的8年生鳳丹3株,以其植株30～40 cm 為半徑的范圍內(nèi),去除表面的枯枝落葉后,利用土壤采樣器采集深度為0～20 cm(記作A)、20～40 cm(記作B)和40～60 cm(記作C)的土樣。取樣時(shí),從挖掘出的土壤中,輕輕取出鳳丹根系,將根系上松散土壤除去,之后將附著在根系2 mm范圍內(nèi)的土壤收集起來作為根際土壤,之后將土壤分別裝入無菌牛皮紙袋、做好標(biāo)記,放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室,用無菌2 mm的土壤篩去除其他雜質(zhì)后,4 ℃保存,每處理3次重復(fù),共9個(gè)土壤樣品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 土壤微生物基因組 DNA 提取及質(zhì)量檢測 土壤基因組DNA使用Power soil extraction kit-12888(USA) 試劑盒,提取方法參照說明書。提取出的土壤微生物總DNA采用Nanodrop檢測 DNA 樣品純度和濃度;土壤DNA 樣品置于-80 ℃保存。

1.3.2 PCR擴(kuò)增細(xì)菌 對(duì)土壤細(xì)菌采用16S rRNA 基因 V3-V4 可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,引物序列為341 F (5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805 R (5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCC AGACTACHGGGTATCTAATCC-3′)。擴(kuò)增體系為25 μL:包含10 g DNA,12.5 μL PCR reaction mix,1 μL 正向引物341 F,1 μL 反向引物805 R,用去離子水補(bǔ)齊25 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?包括95 ℃ 5 min,35個(gè)循環(huán)(95 ℃ 1 min,52 ℃ 1 min,72 ℃ 10 min)。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物用Tiangen Gel Clean KIT 試劑盒進(jìn)行純化。PCR純化產(chǎn)物采用Qubit 2.0進(jìn)行定量,符合測序濃度要求,檢測合格后,采用Illumina MiSeq對(duì) 16S rRNA 基因序列的 V3-V4 區(qū)進(jìn)行高通量測序,測序由上海美吉生物醫(yī)學(xué)有限公司完成。

1.3.3 信息分析流程 首先刪除原始序列中的錯(cuò)配序列和低質(zhì)量序列,得到可用序列;然后采用PEAR軟件對(duì)雙端序列進(jìn)行序列拼接,拼接采用默認(rèn)算法;采用CD-HIT軟件依據(jù)97%的置信范圍進(jìn)行聚類,聚類后獲得OTU (Operational taxonomic unit)表。采用Silva數(shù)據(jù)庫對(duì)獲得的OTU序列進(jìn)行比對(duì)。依據(jù)最小序列數(shù)對(duì)所有樣品進(jìn)行抽平,然后使用抽平后的OTU表進(jìn)行α和β多樣性、群落組成、heatmap分析,分析均采用R語言的“micro-eco”包實(shí)現(xiàn)。PCoA基于OTU水平采用R語言的“micro-eco”包完成,采用Bray-Curtis距離矩陣。Heatmap圖選擇科水平,選取豐度排名前25科水平繪制熱圖。PERMANOVA采用R語言的“Vegan”軟件包實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同土層鳳丹根際細(xì)菌OTU

不同土壤深度中的鳳丹根際細(xì)菌群落,見圖1。

圖1 不同土壤深度鳳丹根際細(xì)菌群落韋恩圖Figure 1 Venn diagram of rhizosphere bacterial community in P.ostii at different soil layers

由圖1可知,不同土壤深度鳳丹的9個(gè)根際土壤樣品中共獲得3 588個(gè)細(xì)菌OTUs,分屬于20門,60綱、100目、110科、98屬。OTUs 數(shù)目均介于750～900之間。0～20、20～40、40～60 cm鳳丹根際土壤樣品分別獲得 2 842、2 520、2 419個(gè)細(xì)菌OTUs,OTUs數(shù)目均一化較高。其中,3種土壤深度共有根際細(xì)菌OTU數(shù)目為1 563個(gè),占總數(shù)的43.56%;0～20 cm的根際細(xì)菌特有OTU數(shù)目為592個(gè),占總數(shù)的16.50%;20～40 cm的根際細(xì)菌特有OTU數(shù)目為233個(gè),占總數(shù)的6.49%;40～60 cm的根際細(xì)菌特有OTU數(shù)目為133個(gè),占總數(shù)的3.71%。這表明不同土壤深度間鳳丹根際細(xì)菌組成存在一定的差異,且隨著土壤深度的增加根際細(xì)菌種類數(shù)目逐漸減少。

2.2 不同土壤深度中鳳丹根際細(xì)菌物種的豐度聚類

基于最大似然法,對(duì)科水平不同土壤深度的細(xì)菌進(jìn)行豐度聚類分析結(jié)果,見圖2。

圖2 不同土壤深度鳳丹根際細(xì)菌物種豐度科水平上的聚類分析Figure 2 Cluster analysis at the family level of species abundance in the rhizosphere of P. ostii at different soil layers

由圖2可知,經(jīng)聚類結(jié)果表明,0～20 cm土壤深度的根際細(xì)菌聚為1類,20～40 cm和40～60 cm的根際細(xì)菌聚為1類。這說明20～40 cm和40～60 cm的根際細(xì)菌在科水平物種組成比較接近,而與0～20 cm的根際細(xì)菌科結(jié)構(gòu)差異較明顯。這表明隨著土壤深度的增加,根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生變化。PERMANOVA結(jié)果表明,不同土壤深度細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)顯著改變(P<0.05)。

2.3 不同土壤深度中鳳丹根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成

不同土壤深度鳳丹根際細(xì)菌門水平的組成特征,見圖3。

圖3 鳳丹根際細(xì)菌門水平上的組成特征Figure 3 Composition characteristics at the level of rhizosphere bacterial phyla of P.ostii

由圖3可知,研究的3種土壤深度鳳丹根際優(yōu)勢細(xì)菌門主要是酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)以及硝化螺旋菌門(Nitrospirae)等,其中酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和綠彎菌門(Chloroflexi)四者豐度之和高達(dá)60%以上。其中,酸桿菌門(Acidobacteria)豐度隨著土壤深度的增加而增加,在0～20 cm土層中占比18.7%,在40～60 cm土層中酸桿菌門豐度達(dá)到34.5%。而厚壁菌門(Firmicutes)豐度則隨著土壤深度的增加而降低,在0～20 cm土層中占比16.0%,而在20～40、40～60 cm土層中占比僅有1.0%。放線菌門(Actinobacteria)豐度則是在20～40 cm土壤深度最高,占比為34.8%,在0～20 cm土層中僅占比6.5%,在 40～60 cm土層為20.7%。

不同土壤深度鳳丹根際細(xì)菌綱水平的組成特征,見圖4。

圖4 不同深度土層鳳丹根際細(xì)菌綱水平上的群落結(jié)構(gòu)特征Figure 4 Characteristics of community structure at the level of rhizosphere bacteria class in different soil layers of P.ostii

由圖4可知,不同土壤深度中鳳丹根際優(yōu)勢細(xì)菌綱主要是酸桿菌綱(Acidobacteria)、放線菌綱(Actinobacteria)、α-變形桿菌綱(Alphaproteobacteria)以及芽單胞菌綱(Bacilli)。其中,導(dǎo)致3種土層差異的主要細(xì)菌綱是酸桿菌綱(Acidobacteria)、放線細(xì)菌綱(Actinobacteria)以及芽胞桿菌綱(Bacilli)。其中,酸桿菌綱(Acidobacteria)在0～20 cm和20～40 cm土層中豐度分別達(dá)到18.7%和21.8%,而在40～60 cm土層中為34.5%,是前二者占比的1.58～1.84倍。放線細(xì)菌綱(Actinobacteria)在0～20 cm土層中僅占比6.5%,在20～40、40～60 cm土層中分別達(dá)到34.8%和20.7%。芽胞桿菌綱(Bacilli)在0～20 cm土層中豐度達(dá)到9.5%,而在20～40 cm與40～60 cm土層中豐度不到1.0%。

2.4 不同土層中鳳丹根際細(xì)菌群落多樣性

不同土壤深度鳳丹根際細(xì)菌群落α多樣性,見圖5。

(a) 土壤細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)

(b) 土壤細(xì)菌趙氏指數(shù)圖5 鳳丹根際細(xì)菌α多樣性Figure 5 α-diversity of rhizosphere bacteria in P. ostii

由圖5-(a)可知,不同土壤深度鳳丹根際細(xì)菌Shannon多樣性指數(shù)無顯著性差異,表明3種土壤深度中的根際細(xì)菌群落多樣性無差異。但隨著土壤深度的增加,土壤細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)呈現(xiàn)先下降后降低的趨勢,即土壤細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)的變化規(guī)律表現(xiàn)為:40～60 cm>0～20 cm>20～40 cm。

由圖5-(b)可知,而0～20 cm與40～60 cm的Chao1指數(shù)具有顯著性差異,說明0～20 cm土層與40～60 cm土層中的根際細(xì)菌豐富度具有顯著性差異,且隨著土壤深度的增加,豐富度指數(shù)逐漸降低,0～20 cm土層顯著高于40～60 cm土層。即趙氏指數(shù)表現(xiàn)出的規(guī)律為:0～20 cm>20～40 cm>40～60 cm。

不同土壤深度鳳丹根際細(xì)菌群落β多樣性,見圖6。

圖6 不同土層鳳丹根際細(xì)菌主坐標(biāo)分析Figure 6 Analysis of principal coordinates of rhizosphere bacteria in different soil layers of P.ostii

由圖6可知,通過主坐標(biāo)分析能夠?qū)崿F(xiàn)多個(gè)樣品間的分類,更進(jìn)一步的展示樣品間物種多樣性的差異。從主坐標(biāo)分析可以看出,3種土層間同組內(nèi)樣本距離較近且集中,表明每種土層組內(nèi)樣本間根際細(xì)菌群落差異較小,而各土層組間差異較大。從整體上來看,不同土壤深度間的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著,而且20～40 cm 和40～60 cm的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)更為接近。這也說明,上層土壤(0～20 cm)與下層土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)差異顯著(P<0.05)。

3 討論

鳳丹牡丹長期種植后根際微生態(tài)環(huán)境發(fā)生改變,出現(xiàn)連作障礙[15]。楊瑞先指出鳳丹牡丹的連作障礙主要是根際微生物失調(diào)的結(jié)果[10]。本研究對(duì)不同土層鳳丹根際土壤細(xì)菌的分析表明,0 ～ 20 cm土層細(xì)菌物種數(shù)高于20～40 cm和40～60 cm,表明細(xì)菌物種豐富度隨著土層深度的加深而降低。熱圖聚類結(jié)果表明,0～20 cm土壤深度的根際細(xì)菌聚為1類,20～40 cm和40～60 cm的根際細(xì)菌聚為1類,說明0～20 cm土壤深度與20～40 cm和40～60 cm深度土壤在細(xì)菌進(jìn)化上具有一定的差異。Kim指出土壤剖面被認(rèn)為是土壤性質(zhì)的生態(tài)過濾器,隨著土壤剖面深度的改變,土壤微生物群落多樣性、組成及功能均會(huì)產(chǎn)生一定的變化[16]。本研究結(jié)果正體現(xiàn)了這一點(diǎn)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同深度土壤優(yōu)勢細(xì)菌門均為酸桿菌門、變形菌門、放線菌門和綠彎菌門,而不同土壤層次間的優(yōu)勢細(xì)菌綱主要為酸桿菌綱、放線細(xì)菌綱以及芽胞桿菌綱。從細(xì)菌綱的水平來看,酸桿菌綱、放線菌綱以及芽胞桿菌綱在不同土壤深度發(fā)生顯著改變。其中,酸桿菌門是3種土層共同的優(yōu)勢細(xì)菌門,與郭麗麗等研究相一致[13]。且土壤深度相差越大(圖3),優(yōu)勢菌豐度相差越大。有可能是長期單一種植鳳丹牡丹,其根系分泌物以及植物殘?bào)w隨著種植時(shí)間的增加而逐漸富集,改變了根際土壤微環(huán)境,導(dǎo)致根際微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[17-18]。變形菌門是細(xì)菌中最大的門,其中的許多類群可以進(jìn)行固氮作用,并能夠適應(yīng)各種復(fù)雜的環(huán)境[19]。研究表明表層土壤中養(yǎng)分含量高,土壤通氣條件好,適合富營養(yǎng)性的微生物生長,而隨著土壤深度的增加,土壤養(yǎng)分條件降低,氧氣含量減少,從而導(dǎo)致酸桿菌與放線菌微生物在表層土壤的富集[20]。本研究中,有可能由于鳳丹栽培過程中人工添加肥料等措施,導(dǎo)致表層土壤養(yǎng)分含量明顯高于下層土壤,最終造成表層土壤細(xì)菌種類高于下層土壤。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),不同土壤層次根際細(xì)菌的Shannon多樣性指數(shù)并未發(fā)生顯著改變,表明3種土壤深度根際細(xì)菌群落多樣性無差異。而0～20 cm土層與40～60 cm Chao1指數(shù)具有顯著性差異,說明0～20 cm土層與40～60 cm土層根際細(xì)菌豐富度具有顯著性差異。這表明不同土壤層次中的根際細(xì)菌的種類和均勻度改變并不明顯,但是其細(xì)菌豐度卻發(fā)生了顯著改變,這可能是因?yàn)楦H細(xì)菌的種類主要由土壤的性質(zhì)決定的,地上植被并不會(huì)影響微生物種類和分布的變化,但會(huì)對(duì)根際細(xì)菌的豐度和含量進(jìn)行調(diào)控。先前的研究結(jié)果也表明,隨著土壤深度的增加,土壤細(xì)菌的豐富度呈顯著降低的趨勢[21-22]。但是由于土壤微生物的分布原因和控制因素比較復(fù)雜,也有一些研究發(fā)現(xiàn)隨著土壤深度的改變,其土壤細(xì)菌的豐度Alpha多樣性變化并不明顯,例如Chernov等對(duì)比研究了堿土和草原栗鈣土深達(dá)150 cm的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)細(xì)菌Alpha多樣性在堿土中隨深度增加而下降,而在栗鈣土上變化不明顯。Wang對(duì)青藏高原生態(tài)系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn),酸桿菌門是土壤最主要的優(yōu)勢細(xì)菌,土壤細(xì)菌群落較其他微生物具有更明顯的垂直分布特征,且細(xì)菌多樣性與海拔高度有一定的相關(guān)性[23-24]。Van等對(duì)森林土壤微生物垂直分布的探究表明,在0～80 cm深度內(nèi)微生物豐度隨土壤深度的增加而降低[25]。因此,未來需要進(jìn)一步通過土壤理化性質(zhì)、土壤酶活性、土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能等多維度綜合試驗(yàn),以闡釋不同土壤深度鳳丹土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的分布規(guī)律及其調(diào)控機(jī)制。

4 結(jié)論

所有土壤樣品共獲得3 588個(gè)OTUs, 分屬于20門,60綱、100目、110科、98屬。不同土壤深度鳳丹根際土壤細(xì)菌主要的差異細(xì)菌門為酸桿菌門、變形菌門、放線菌門和綠彎菌門,酸桿菌門(Acidobacteria)在0～20 cm土層中占比18.7%,而在40～60 cm土層中酸桿菌門豐度達(dá)到34.5%;主要的差異細(xì)菌綱為酸桿菌綱、放線細(xì)菌綱以及芽胞桿菌綱,酸桿菌綱在0～20 cm和20～40 cm土層中豐度分別達(dá)到18.7%和21.8%,而在40～60 cm土層中為34.5%,是前二者占比的1.58～1.84倍。Alpha多樣性分析表明,土壤深度細(xì)菌群落多樣性無差異,但0～20 cm土層與40～60 cm土層細(xì)菌豐富度具有顯著性差異。Bate多樣性表明,組內(nèi)樣本間細(xì)菌群落差異較小,而各土層組間差異較大。而且根際土壤細(xì)菌科水平聚類分析結(jié)果表明,20～40 cm和40～60 cm的根際細(xì)菌在科水平物種組成比較接近,而與0～20 cm的根際細(xì)菌科結(jié)構(gòu)差異較明顯,并且隨著土壤深度的增加,土壤細(xì)菌種類和數(shù)目逐漸減少。