郝莉花，鞏凡，李存良，馮琳琳，羅莉，楊龍松

（河南省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)技術(shù)研究院，河南 鄭州 450000）

磺胺類藥物是指帶有氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物，被用于預(yù)防和治療各種細(xì)菌感染性疾病，在畜牧業(yè)和動(dòng)物疾病的治療中廣泛使用。長(zhǎng)期食用含有超過(guò)規(guī)定限量的磺胺類藥物的動(dòng)物源性食品可能導(dǎo)致泌尿系統(tǒng)和肝臟受損，過(guò)量攝入可能增加患癌風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。因此，對(duì)于動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物檢測(cè)顯得尤為重要。

目前檢測(cè)磺胺類藥物常用的方法有高效液相色譜法以及液相色譜串接質(zhì)譜法[3-5]、微生物法[6]、表面熒光免疫檢測(cè)法[7]和表面增強(qiáng)拉曼光譜法[8]等。高效液相色譜法和液相色譜串接質(zhì)譜法特異性強(qiáng)且靈敏度好[9]，但樣品前處理復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)。微生物法主要利用磺胺類有效抑制特異微生物代謝，從而測(cè)定樣品中磺胺類的殘留量，方法成本較低但靈敏度差，易受其他抗生素的干擾[6，10]。上述方法存在前處理繁瑣、檢測(cè)時(shí)間周期長(zhǎng)等缺陷，已經(jīng)不能滿足如今快速、精準(zhǔn)、簡(jiǎn)便的檢測(cè)要求。因此，開(kāi)發(fā)磺胺的快速檢測(cè)方法具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

磺胺藥物殘留的快速檢測(cè)方法包括熒光免疫層析技術(shù)、表面增強(qiáng)拉曼光譜法和原位直接電離質(zhì)譜等。熒光免疫層析技術(shù)是一種新興的膜檢測(cè)技術(shù)，其原理基于抗原抗體的特異性免疫反應(yīng)，方法操作簡(jiǎn)便但易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性，靈敏度較低。表面增強(qiáng)拉曼光譜法具有樣品前處理簡(jiǎn)單和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于農(nóng)產(chǎn)品中抗生素殘留檢測(cè)[11-12]，但同樣易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性。原位直接電離質(zhì)譜法無(wú)需復(fù)雜的樣品制備過(guò)程，可在常壓環(huán)境中實(shí)現(xiàn)原位、直接、快速的樣品分析，目前在藥物分析、代謝組學(xué)的快速篩查方面應(yīng)用廣泛[13-17]。實(shí)時(shí)直接分析(direct analysis in real time，DART) 離子源是一種非表面接觸的熱解析大氣壓電離的原位質(zhì)譜，具有簡(jiǎn)單性和靈敏性特點(diǎn)，可直接分析固體、液體和氣體[18-20]。DART 離子源具有高檢測(cè)速度和抗基質(zhì)干擾性。它不需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，可以直接電離樣品，縮短了樣品的分析周期，提高了質(zhì)譜分析通量，實(shí)現(xiàn)樣品的原位、無(wú)損、實(shí)時(shí)、直接快速分析[18]。李無(wú)雙等[21]建立了DART 串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜直接分析桑葉γ-氨基丁酸，此方法前處理快速、簡(jiǎn)單，降低了檢測(cè)成本和操作難度。此外，DART 質(zhì)譜方法還能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)乳制品的高通量和全自動(dòng)檢測(cè)，以及用于檢測(cè)火鍋底料、調(diào)味料中的罌粟殼生物堿。DART質(zhì)譜法操作簡(jiǎn)單省時(shí)，為食品安全監(jiān)測(cè)工作提供了重要的技術(shù)支持[22]。

本研究利用DART 串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜的方法快速篩查豬肉中10 種磺胺。豬肉經(jīng)過(guò)溶劑提取和簡(jiǎn)單凈化后，通過(guò)DART 源串接三重四極桿液質(zhì)儀技術(shù)進(jìn)行分析測(cè)定，以實(shí)現(xiàn)磺胺類藥物殘留的實(shí)時(shí)、快速、直接分析。本方法免去了液相色譜分離時(shí)間、簡(jiǎn)化了前處理操作步驟，適用于大量樣品中篩查磺胺類藥物，在風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)和監(jiān)督抽檢工作中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉（肌肉組織）：市售；乙腈（色譜純）：德國(guó)Merck 公司；獸藥殘留試劑盒（5982-0032/4950）、有機(jī)微孔濾膜（0.45 μm）：美國(guó)Agilent 公司；PRiME HLB 固相萃取小柱：美國(guó)waters 公司；磺胺類混標(biāo)[磺胺喹惡啉標(biāo)準(zhǔn)品（99.8 μg/mL）、磺胺氯噠嗪標(biāo)準(zhǔn)品（100.1 μg/mL）、磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品（100.0 μg/mL）、磺胺間二甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品（100.1 μg/mL）、磺胺鄰二甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品（99.9 μg/mL）、磺胺甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品（99.8 μg/mL）、磺胺二甲基嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品（100.0 μg/mL）、磺胺間甲氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品（100.1 μg/mL）、磺胺吡啶標(biāo)準(zhǔn)品（99.8 μg/mL）、磺胺噻唑標(biāo)準(zhǔn)品（100.2 μg/mL）]：天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME104E 電子天平（0.1 mg）、XA205 電子天平（0.01 mg）：METTLER TOLEDO 公司；Milli-Q 去離子水發(fā)生器：美國(guó)Millipore 公司；QL 866 漩渦混合器：海門(mén)市其林貝爾儀器制造公司；SB-25-12DT 超聲波發(fā)生器：寧波新芝生物科技有限公司；Velocity 18R Pro 離心機(jī)：澳大利亞Dynamica 公司；N-Evap 氮吹儀：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；4500 三重四極桿質(zhì)譜儀：美國(guó)AB SCIEX 公司；DART SVP 離子源：美國(guó)Ion-Sense 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

市售豬肉經(jīng)粉碎后制成豬肉樣品。

提?。悍Q取豬肉樣品2.5 g 于50 mL 塑料旋蓋離心管中，使用移液管準(zhǔn)確加入10.00 mL 乙腈，渦旋振蕩2 min 并超聲輔助提取20 min，上清液即為提取液。

凈化：凈化分為不凈化、分散固相萃取凈化和固相萃取柱凈化3 種方式。

直接提取法（不凈化）：將提取液于冷凍離心機(jī)中10 000 r/min 離心5 min。準(zhǔn)確量取2.00 mL 上清液，于氮吹儀中40 ℃氮吹至干，經(jīng)溶劑轉(zhuǎn)換后待測(cè)。

分散固相萃取凈化：將提取液加入5 g 獸藥殘留試劑盒鹽包，渦旋振蕩2 min 混勻，于冷凍離心機(jī)中10 000 r/min 離心5 min。準(zhǔn)確量取6.00 mL 上清液于內(nèi)含獸藥殘留試劑盒凈化包的10 mL 塑料旋蓋離心管中，渦旋振蕩30 s，4 000 r/min 離心10 min。準(zhǔn)確量取2.00 mL 上清液，40 ℃氮吹至干，經(jīng)溶劑轉(zhuǎn)換后待測(cè)。

固相萃取柱凈化：提取液于10 000 r/min 離心5 min。準(zhǔn)確量取5.00 mL 上清液轉(zhuǎn)移至PRiME HLB固相萃取小柱上，收集洗脫液2 mL，40 ℃氮吹至干，經(jīng)溶劑轉(zhuǎn)換后待測(cè)。

溶劑轉(zhuǎn)換：加入0.5 mL 的20%乙腈水復(fù)溶，渦旋振蕩30 s，超聲5 min 充分溶解，過(guò)0.45 μm 有機(jī)微孔濾膜，得到提取液。

1.3.2 儀器參數(shù)

儀器參數(shù)條件：預(yù)備氣體為高純度氮?dú)?，工作氣體為高純度氦氣；碰撞氣設(shè)定為Medium；氣簾氣設(shè)定為20 psi；碰撞室入口電壓10 V，出口電壓6 V；離子源溫度為250 ℃，解離工作氣體溫度350 ℃；柵網(wǎng)電極電壓200 V；隔膜泵壓力12.0 kPa；掃描模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。待測(cè)化合物定量離子對(duì)、定性離子對(duì)及碰撞能量見(jiàn)表1。

表1 待測(cè)化合物定量離子對(duì)、定性離子對(duì)及碰撞能量Table 1 Quantitative ion pair，qualifier ion pair and collision energy of the analyte compound

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混標(biāo)儲(chǔ)備液：取1 mL 磺胺類混標(biāo)于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容并混勻，配制成10 μg/mL 混標(biāo)儲(chǔ)備液。

混標(biāo)中間液：取1 mL 混標(biāo)儲(chǔ)備液于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容并混勻，配制成1 μg/mL 混標(biāo)中間液。

混標(biāo)工作液：取10、20、50、80、100 μL 混標(biāo)中間液分別用乙腈、不凈化基質(zhì)提取液、凈化包提取液、固相萃取柱提取液定容至1 mL，配制10、20、50、80、100 μg/L 混標(biāo)工作液。

1.4 數(shù)據(jù)處理

取1 mL 試樣測(cè)定，將混標(biāo)工作液分別測(cè)定定量離子相應(yīng)的豐度，以磺胺類的濃度為橫坐標(biāo)，以磺胺類定量離子豐度為縱坐標(biāo)，做線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用外標(biāo)法定量。

前處理過(guò)程總基質(zhì)效應(yīng)以基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）值評(píng)價(jià)，方法基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算參照文獻(xiàn)[23]的方法，計(jì)算公式如下。

X=B/A×100

式中：X 為前處理過(guò)程總基質(zhì)效應(yīng)，%；A 為目標(biāo)化合物在純?nèi)軇┗|(zhì)中檢測(cè)的峰面積；B 為目標(biāo)化合物在陰性樣品處理液基質(zhì)中檢測(cè)的峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理凈化效果分析

空白豬肉樣品按照方法1.3.1 得到不凈化提取液、凈化包提取液和固相萃取柱提取液。分別取100 μL 混標(biāo)中間液用溶劑（乙腈）、不凈化提取液、凈化包提取液、固相萃取柱提取液定容至1 mL，按照方法1.3.2 對(duì)上述3 種基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定4 次，最終結(jié)果以平均值計(jì)。ME 值的計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。典型的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 0.1 μg/mL 乙腈中磺胺喹惡啉色譜圖Fig.1 Chromatogram of sulfaquinoxaline in 0.1 μg/mL acetonitrile

表2 不同凈化方式的ME 值Table 2 ME value of different purification methods

研究通過(guò)ME 值反映基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)度，即基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)（ME 值＞100%）、基質(zhì)減弱效應(yīng)（ME 值＜100%）。表2 中ME 值范圍是0.19%～26.69%，為基質(zhì)減弱效應(yīng)。不凈化基質(zhì)提取液ME 值范圍為0.19%～1.35%，平均值0.74%；凈化包提取液ME 值范圍為5.45%～17.49%，平均值10.97%；固相萃取柱提取液ME 值范圍為11.02%～26.69%，平均值15.58%。通常ME 值接近100%凈化效果好[23]，通過(guò)比較ME 平均值可以看出凈化效果為固相萃取柱＞凈化包＞不凈化基質(zhì)提取液。

2.2 檢出限結(jié)果分析

空白豬肉樣品按照方法1.3.1 得到不凈化基質(zhì)提取液、固相萃取柱提取液和凈化包提取液。取10 μL 混標(biāo)中間液分別用乙腈、不凈化基質(zhì)提取液、凈化包提取液、固相萃取柱提取液定容至1 mL，配制成10 μg/kg基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照方法1.3.2 對(duì)上述3 種基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定4 次，最終結(jié)果以平均值計(jì)。另取空白基質(zhì)提取液檢測(cè)，各化合物定量離子對(duì)響應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表3。

從表3 可以看出，10 種磺胺在10 μg/kg 時(shí)均有響應(yīng)，在0 μg/kg 時(shí)，均沒(méi)有響應(yīng)。因此，上述3 種前處理凈化方法，10 種磺胺均能夠在10 μg/kg 檢出，滿足GB 31650—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》中的判定要求（磺胺類限量值為100 μg/kg），因此本方法能夠?qū)崿F(xiàn)磺胺類不合格產(chǎn)品的篩查。

2.3 線性范圍結(jié)果分析

將1.3.3 配制的混標(biāo)工作液按照方法1.3.2 測(cè)定4 次，最終結(jié)果以平均值計(jì)，同時(shí)擬合線性回歸方程并計(jì)算相關(guān)系數(shù)和精密度，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 磺胺類化合物線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 4 Linear regression equations and correlation coefficients of sulfonamide compounds

由表4 可知，在10～100 μg/L 范圍內(nèi)，不凈化基質(zhì)提取液配制混標(biāo)工作液，10 種磺胺線性相關(guān)系數(shù)R2為0.009～0.982，平均值為0.642；以固相萃取柱提取液配制混標(biāo)工作液，10 種磺胺線性相關(guān)系數(shù)R2為0.845～0.994，平均值為0.962；以凈化包提取液配制混標(biāo)工作液，10 種磺胺線性相關(guān)系數(shù)R2為0.545～0.960，平均值為0.782。由此可見(jiàn)，相關(guān)系數(shù)R2固相萃取柱提取液＞凈化包提取液＞不凈化基質(zhì)提取液，因此以固相萃取柱提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確性最高，以不凈化基質(zhì)提取液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確性最低。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)豬肉基質(zhì)的溶劑提取和簡(jiǎn)單凈化，采用DART 源串接三重四極桿質(zhì)譜儀實(shí)現(xiàn)10 種磺胺的實(shí)時(shí)快速檢測(cè)分析。

本研究比較了不凈化基質(zhì)提取液、凈化包提取液和固相萃取柱提取液中基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物檢測(cè)的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果表明，產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)類型為基質(zhì)減弱效應(yīng)，凈化效果為固相萃取柱＞凈化包＞不凈化基質(zhì)提取液。上述3 種前處理方法10 種磺胺均能夠在10 μg/kg 檢出，滿足GB 31650—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》判定要求，能夠?qū)崿F(xiàn)不合格產(chǎn)品的快速篩查。10 種磺胺在10～100 μg/L 時(shí)進(jìn)行線性回歸，相關(guān)系數(shù)為固相萃取柱提取液＞凈化包提取液＞不凈化基質(zhì)提取液，以固相萃取柱提取液配制混標(biāo)工作液時(shí)，R2平均值為0.962，線性較好，以不凈化基質(zhì)提取液配制混標(biāo)工作液和以凈化包提取液配制混標(biāo)工作液時(shí)，R2平均值分別為0.642 和0.782，線性較差。

本研究建立了一種快速檢測(cè)豬肉樣品中磺胺類藥物的方法。與GB 31658.17—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物性食品中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》中的液相色譜質(zhì)譜方法相比，該方法免去了液相色譜分離時(shí)間、簡(jiǎn)化了前處理操作步驟，操作簡(jiǎn)單快速，同樣達(dá)到了該標(biāo)準(zhǔn)中10 μg/kg 的檢出限。另一方面，經(jīng)過(guò)固相萃取柱凈化后，該方法具有較好的靈敏度和準(zhǔn)確性，可廣泛應(yīng)用于豬肉樣品中磺胺類藥物的快速篩查和準(zhǔn)確檢測(cè)。