陳曉霞，邱宇龍，李儀茜，畢景然

（大連工業(yè)大學 食品學院，遼寧 大連 116034）

隨著人們生活水平的日益提高，食品質量和安全問題越來越受到消費者的廣泛關注。目前石油衍生聚合物在食品保鮮領域得到了廣泛的開發(fā)和應用，但由于其不可回收及不可生物降解性，消費者對天然生物聚合物材質的食品保鮮膜認同度更高[1-2]。

殼聚糖（chitosan，CS）是一種天然的陽離子多糖，具有良好的成膜性、生物降解性[3]、抗氧化性和抗菌活性[4]，因此，CS 基復合膜被廣泛應用在食品保鮮方面[5]。然而，由于CS 糖苷鏈上的分子內(nèi)和分子間的網(wǎng)絡鏈間隙，導致CS 基復合膜機械性能較差，限制了CS 的實際利用[6]。纖維素是一種天然大分子多糖，由β-D-葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵連接而成，結晶度高，由纖維素I 晶型和無定形區(qū)組成。由氧化法制備的纖維素納米纖維（cellulose nanofibrils，CNF），在纖維素分子上引入了大量的羧基，具有高長徑比、高比表面積以及無定形晶體結構，能夠通過氫鍵建立牢固的納米纖維素網(wǎng)絡結構，可作為復合膜的增強填料[7]。Yadav等[8]采用共混法制備了CNF/CS 綠色復合薄膜，隨著CNF 添加量的增加，復合膜的吸濕率和水溶性都呈現(xiàn)下降趨勢，可作為食品包裝用于食品保鮮。Tang 等[9]以CNF為增強填料，制備了可降解、透明度高的CS/瓜爾膠（guar gum，GG）/CNF 納米復合膜，與純CS/GG 膜相比，CS/GG/CNF 納米復合膜的抗拉強度更大，氧氣透過率更低，是一種潛在的新型食品包裝材料。京尼平（genipin，GP） 是梔子苷經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解后的產(chǎn)物，化學結構具有羥基、羧基等多個活性基團，其毒性與人工合成的化學交聯(lián)劑相比較小[10]。京尼平作為京尼平苷的苷元衍生物，可用于多種天然生物材料的交聯(lián)，是一種優(yōu)良的天然生物交聯(lián)劑，可以與CS 分子上的伯氨基反應生成雜環(huán)胺，引發(fā)CS 分子通過短橋結構進行有序的交聯(lián)[11]。通過GP 交聯(lián)形成的大分子網(wǎng)絡結構，交聯(lián)程度高、性質穩(wěn)定、阻隔性能強。

本研究以絲瓜絡為原料，通過2，2，6，6-四甲基哌啶-氮-氧化物（2，2，6，6-tetramethyl-1-piperidinyloxy，TEMPO）氧化法制備CNF。以GP 作為交聯(lián)劑，通過在CS 中添加不同量的CNF，制備CS-GP-CNF 復合膜，采用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)TIR）及X 射線衍射（X-ray diffractometer，XRD）等技術對復合膜的結構進行表征，探究復合膜的交聯(lián)機制，并研究不同添加量的CNF 對復合膜水蒸氣透過率的影響，探討CS-GP-CNF 復合膜在雞肉冷藏保鮮中的應用效果，以期為天然食品包裝膜的制備提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絲瓜絡：天津品煜悠佳商貿(mào)有限公司；CS（生化試劑）：國藥集團化學試劑有限公司；GP（98%）、脂肪醇聚氧乙烯醚：上海麥克林生化科技股份有限公司；乙酸乙酯、乙酸、鹽酸、氫氧化鉀、次氯酸鈉、無水乙醇（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠；溴化鈉、TEMPO（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉、瓊脂粉（生物試劑）：北京奧博星生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

中草藥粉碎機（FW177）：天津市泰斯特儀器有限公司；恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S）：深圳市三莉科技有限公司；電熱鼓風干燥箱（GFL-70）：天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司；自動凱氏定氮儀（K9840）：山東海能科學儀器有限公司；透射電子顯微鏡（JEM-2100）、SEM（JSM-7800F）：日本電子株式會社；傅里葉變換紅外光譜儀（Spectrum II）：鉑金埃爾默儀器有限公司；X 射線衍射儀（XRD-7000S）：日本島津公司；真空冷凍干燥機（FD8-3）：美國Siemon 公司。

1.3 方法

1.3.1 纖維素的制備

將40 g 絲瓜絡用中草藥粉碎機粉碎，加入至10g/L的脂肪醇聚氧乙烯醚（質量濃度2%）滲透劑中，連續(xù)攪拌24 h 后，用去離子水徹底清洗樣品，之后采用乙酸乙酯萃取。在75 ℃下緩慢加入40 mL 乙酸和60 g 次氯酸鈉。過濾后的樣品在90 ℃下與400 mL 氫氧化鉀溶液（5%）混合攪拌2 h，去除半纖維素。在80 ℃下，利用400 mL 鹽酸（1%）攪拌剩余樣品2 h 后，用去離子水洗滌至中性，采用真空冷凍干燥機凍干得到纖維素粉。

1.3.2 CNF 的制備

將1 g 纖維素粉與100 mL TEMPO-NaBr 溶液（含0.1 g TEMPO 和0.016 g NaBr）混合，在30 ℃下攪拌4 h，攪拌過程中緩慢滴加0.5 mol/L NaOH 溶液，調(diào)節(jié)反應溶液至pH10。加入10 mL 無水乙醇終止反應，將反應后的產(chǎn)物用去離子水反復潤洗至中性，10 000 r/min 離心10 min，去除上層清液，將沉淀凍干即得CNF[12]。

1.3.3 CS-GP-CNF 復合膜的制備

將CS（1.5 g）溶于100 mL 1%乙酸溶液中，攪拌6 h，制得1.5% CS 溶液。隨后，將CNF 分別按CS 的0%、1%、2%、3%、6%（質量分數(shù)） 加入到CS 溶液中。攪拌20 min 后，加入終濃度為0.15 mmol/L 的GP 水溶液，攪拌30 min，制備CS-GP-CNF 交聯(lián)溶液。超聲1 h 后，將200 mL CS-GP-CNF 交聯(lián)溶液倒入模具（30 cm×25 cm）中，在40 ℃下干燥2 h，形成干燥的復合膜，樣品分別記為CS-GP-CS、CS-GP-CNF1、CS-GP-CNF2、CS-GPCNF3、CS-GP-CNF6。

1.3.4 測試與表征

1.3.4.1 透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察

將一滴用去離子水稀釋的CNF 懸浮液滴在有碳涂層的銅網(wǎng)上，然后用乙酸雙氧鈾復染2 min，并在室溫下晾干。使用TEM 觀察CNF 形貌。

1.3.4.2 FTIR 分析

使用溴化鉀壓片后對CNF 進行掃描，掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1；對CS-GP-CNF 復合膜進行掃描，掃描范圍為4 000～650 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.3.4.3 XRD 分析

XRD 譜圖掃描范圍為5°～60°，掃描速度為5°/min。結晶度計算公式如下。

Cr=（I002-Iam）/Iam

式中：Cr為結晶度，%；I002為（002）面衍射的最大強度；Iam為樣品非晶態(tài)部分散射的強度。

1.3.4.4 SEM 觀察

將CS-GP-CNF 復合膜用液氮冷凍后脆斷，噴金，利用SEM 對復合膜的橫切面進行微觀形貌分析。

1.3.4.5 水蒸氣透過率（water vapor permeability，WVP）測定

采用WVP 測試系統(tǒng)對樣品進行水蒸氣透過率的測試[13]。將CS-GP-CNF 復合膜剪成直徑60 mm 的圓形，固定在裝有20 mL 飽和NaCl 溶液的稱量瓶（相對濕度為75%）的頂部，然后放置在裝有CaCl2的干燥器（相對濕度0%）內(nèi)。每隔24 h 定期對試驗容器進行稱重，連續(xù)稱量3 d。水蒸氣透過率計算公式如下。

W=（△m×x）/（A×△t×△P）

式中：W為水蒸氣透過率，g/（s·m·Pa）；△m 為試驗前后的質量差，g；x為復合膜的平均厚度，m；A 為復合膜面積，m2；△t 為測量時間差，s；△P 為復合膜兩側的水蒸氣壓差，2 809 Pa。

1.3.5 CS-GP-CNF6在雞肉貯藏中的應用

為評價復合膜的實際應用價值，以CS-GP-CNF6復合膜為包裝材料對雞肉進行保鮮。將雞胸肉在120 ℃的高溫下油炸2 min，然后轉移至沸水中煮15 min，以模擬燒雞加工工藝。將雞肉切成2 cm×2 cm×2 cm 的小塊，用制備好的復合膜包覆雞肉，試驗組分別為CS-GPCNF6、商用聚乙烯保鮮膜和未包膜空白組。將包覆好的雞肉放于4 ℃冰箱冷藏，分別貯藏1、3、5、7、10 d 后測定樣品的菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮含量。

1）菌落總數(shù)測定：參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》進行雞肉中菌落總數(shù)的測定[14]。

2）揮發(fā)性鹽基氮含量的測定：參照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》進行雞肉中揮發(fā)性鹽基氮含量的測定[15]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行整理與分析，使用Origin 2021 軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 CNF 的性質

2.1.1 TEM 分析

CNF 的TEM 圖像見圖1。

圖1 CNF 的TEM 圖像Fig.1 TEM images of CNF

從圖1 中可以發(fā)現(xiàn)CNF 的平均寬度為（7.3±3.6）nm，平均長度為（156.3±46.9）nm。CNF 長徑比可高達21.41，因此，可作為復合膜的增強填料，以提高其阻隔性能。另外，纖維素粉經(jīng)過TEMPO 催化處理后，CNF之間存在團聚現(xiàn)象，這是由于氧化作用導致纖維素分子中大部分—OH 和—COOH 等親水性基團暴露，在分子內(nèi)及分子間形成大量氫鍵，引發(fā)團聚[16]。

2.1.2 FTIR 分析

CNF 的FTIR 圖像見圖2。

圖2 CNF 的FTIR 譜圖Fig.2 FTIR spectrum of CNF

由圖2 可知，在3 361～3 343 cm-1處出現(xiàn)較強較寬的吸收峰，這是由—OH 伸縮振動產(chǎn)生的纖維素的特征峰。在2 910 cm-1處存在的尖峰對應為C—H 的伸縮振動吸收峰，在1 649 cm-1處的特征峰是酰胺基Ⅰ的彎曲振動，1 200 ～1 000 cm-1吸收帶屬于—C—O—的伸縮振動峰，890 cm-1處對應的是纖維素C—H 的變形振動[17]。木質素對應的芳香骨架振動峰（1 510 cm-1）、C—H 伸縮振動峰（1 246 cm-1）和彎曲振動峰（828 cm-1）在CNF 圖譜中沒有顯示，說明原料中的木質素已完全通過TEMPO 氧化被去除。

2.1.3 XRD 分析

通過氧化反應制備的CNF 的XRD 結果見圖3。

圖3 CNF 的XRD 譜圖Fig.3 XRD spectrum of CNF

由圖3 可知，CNF 在2θ=15.8°、22.4°和34.42°附近處出現(xiàn)明顯的衍射峰，分別代表了纖維素I 型結晶結構的（110）、（012）以及（040）晶面。計算得到CNF 的結晶度為72.3%，這說明TEMPO 氧化可能只發(fā)生在纖維素的無定形區(qū)，對內(nèi)部晶區(qū)影響不大，因此纖維素的晶型結構得以保持。

2.2 復合膜的性質

2.2.1 SEM 分析

CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 復合膜的橫切面形貌見圖4。

圖4 CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 復合膜的橫切面形貌Fig.4 Cross-section images of CS-GP-CS and CS-GP-CNF composite films

由圖4 可知，在化學交聯(lián)劑京尼平的作用下，CS可以充分交聯(lián)，形成結構完整，表面均一、光滑、無氣泡的CS-GP-CS 復合膜。Costa 等[18]的研究表明，隨著CNF 添加量的逐漸增大，京尼平分子中的酯基（C-11）逐漸被CNF 取代，產(chǎn)生了高分子量的酸酐基團，并通過氫鍵作用形成了結節(jié)狀網(wǎng)絡結構，由此造成復合膜表面形貌的粗糙節(jié)點，其中CS-GP-CNF6復合膜的橫切面形貌明顯出現(xiàn)小型白色團聚結構。

2.2.2 FTIR 分析

CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 復合膜的FTIR 譜圖見圖5。

如圖5 所示，CS-GP-CS 復合膜的FTIR 譜圖中，在3 434 cm-1和2 854 cm-1處存在CS 分子中O-H 和C-H 基團的伸縮振動典型吸收峰。由于CS 的氨基與京尼平C-3 處的烯烴碳原子發(fā)生了親核取代反應，因此，CS-GP-CS 及CS-GP-CNF 復合膜在1 452 cm-1處均存在與C-N 的伸縮振動相關的吸收峰。同時，GP 分子C-11 上的酯基分別被CS 和CNF 取代，分別對應仲酰胺（1 637 cm-1）和酸酐（1 459 cm-1）的吸收峰，證明CSGP-CS 和CS-GP-CNF 復合膜中存在化學交聯(lián)作用。

2.2.3 晶體結構

CNF、CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 復合膜的XRD譜圖見圖6。

如圖6 所示，CS-GP-CS 復合膜的XRD 譜圖在2θ=8.18°、11.68°、18.26°處存在3 個衍射峰，在23.54°處有一個寬峰，這是典型的半晶指紋圖譜。當CNF 通過GP 與CS 交聯(lián)時，CNF 分子中的羧基被交聯(lián)劑取代。因此，交聯(lián)網(wǎng)絡體系中分子間和分子內(nèi)氫鍵的分布發(fā)生了部分改變，但其規(guī)律性并未被明顯破壞。此外，由于CNF 的典型纖維素I 結構的晶體平面與CS的衍射峰重疊，因此，CS-GP-CNF 復合膜的XRD 譜圖形狀與CS-GP-CS 相似。隨著CNF 添加量的逐漸增大，2θ=11.68°處的衍射峰逐漸增大，說明CS-GP-CNF復合膜的面間距離變小。

2.2.4 WVP 測定結果

CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 復合膜的水蒸氣透過率見表1。

表1 CS-GP-CS 和CS-GP-CNF 復合膜的水蒸氣透過率Table 1 Water vapor permeability of CS-GP-CS and CS-GPCNF films

阻隔性能是食品包裝材料防止食品腐敗的重要指標，特別是優(yōu)良的阻水特性可有效避免微生物繁殖。水蒸氣透過率可反映包裝食品與周圍大氣之間的水分交換速率。如表1 所示，由于化學交聯(lián)劑GP 的作用，CS-GP-CS 及CS-GP-CNF 復合膜的交聯(lián)結構緊密，均展現(xiàn)出較高的防潮性能。雖然CNF 表面親水位點豐富，具有較高的親水性，但CS-GP-CNF 復合膜的WVP 仍較低，如CNF 含量最高的CS-GP-CNF6復合膜的WVP 為1.14×10-11g/（s·m·Pa），遠低于玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸鈉復合膜[4.62×10-6g/（s·m·Pa）][19]。

2.2.5 CS-GP-CNF 復合膜在雞肉貯藏中的應用

2.2.5.1 菌落總數(shù)

不同包裝材料對冷藏雞肉菌落總數(shù)的影響見圖7。

圖7 不同包裝材料對冷藏雞肉菌落總數(shù)的影響Fig.7 Effect of different films on colony number of chicken during refrigerated storage

如圖7 所示，在4 ℃條件下，隨著貯藏時間的延長，各組雞肉的菌落總數(shù)不斷增加，其中，未包膜空白組雞肉的菌落總數(shù)上升速率最大，在貯藏第3 天達到（4.49±0.14）lg（CFU/mL），超過了GB/T 20558—2006《地理標志產(chǎn)品符離集燒雞》[20]中規(guī)定的菌落總數(shù)限值4.47 lg（CFU/mL）。商用聚乙烯保鮮膜雖對雞肉具有保護作用，但在第10 天時，雞肉的菌落總數(shù)達到了（5.10±0.21）lg（CFU/mL）。由于CS 良好的抑菌性[21]及復合膜的防潮特性，在貯藏第10 天時，被CS-GPCNF6復合膜包覆的雞肉菌落總數(shù)仍未超過標準限值，僅為（4.16±0.09）lg（CFU/mL），表明CS-GP-CNF6復合膜可以有效地抑制雞肉的細菌生長。

2.2.5.2 雞肉的揮發(fā)性鹽基氮含量

揮發(fā)性鹽基氮是判斷肉制品新鮮度的重要指標之一。在內(nèi)源酶和微生物的作用下，蛋白質會被降解成小分子氨和胺類，可通過凱氏定氮法測定揮發(fā)性鹽基氮含量。不同包裝材料對冷藏雞肉揮發(fā)性鹽基氮含量的影響見圖8。

由圖8 可知，新鮮雞肉的初始揮發(fā)性鹽基氮含量為（10.0±0.5）mg/100 g，各組的揮發(fā)性鹽基氮含量變化趨勢基本一致，均隨著貯藏時間的延長而升高。參照肉制品新鮮度判定標準：揮發(fā)性鹽基氮含量一級鮮度≤15.00 mg/100 g，二級鮮度≤25.00 mg/100 g[21]。未包膜空白組雞肉的揮發(fā)性鹽基氮含量在貯藏1 d 后達到18.70 mg/100 g，由一級鮮度轉為二級鮮度，且在第7天超過25.00 mg/100 g。商用聚乙烯保鮮膜包裹的雞肉樣品于貯藏第3 天轉為二級鮮度，貯藏第7 天時揮發(fā)性鹽基氮含量為25.31 mg/100 g。相比之下，CS-GPCNF6復合膜包覆雞肉的揮發(fā)性鹽基氮含量整體低于未包膜空白組和商用聚乙烯保鮮膜組。CS-GP-CNF6組雞肉的揮發(fā)性鹽基氮含量在貯藏第5 天時僅為16.20 mg/100 g，且可保障雞肉的二級鮮度直至第10天（此時雞肉揮發(fā)性鹽基氮含量為21.20 mg/100 g），表明CS-GP-CNF 復合膜具有潛在的食品保鮮能力。

3 結論

本文以絲瓜絡為原料制備了長徑比為21.41 的CNF，并以CNF 及天然多糖聚合物CS 為原料，通過GP 化學交聯(lián)，制備了表面均一、光滑、無氣泡的CSGP-CNF 復合膜。當CNF 添加量為CS 質量的6%時，所制備的CS-GP-CNF6復合膜的水蒸氣透過率僅為1.14 × 10-11g/（s·m·Pa）。以CS-GP-CNF6復合膜包覆雞肉樣品，評價其在食品保鮮領域的實際應用價值，結果顯示，在4 ℃下貯藏10 d 時，雞肉的菌落總數(shù)和揮發(fā)性鹽基氮含量分別為（4.16±0.09）lg（CFU/mL）和21.20 mg/100 g，保鮮效果明顯優(yōu)于未包膜空白組和商用聚乙烯保鮮膜組。