王婧茹，紅 華，張惠卿，王占忠，梁丹艷，劉 倩，孫 冉

超聲微泡造影劑已從微米級進入納米級（直徑約40 ～350 nm）領域，具有穩(wěn)定性更高、血液循環(huán)時間更長的優(yōu)勢。納米載體技術已可實現(xiàn)對特異性配體或抗體進行修飾， 通過組織外滲透定向到達宿主目標微環(huán)境，利用納米粒自身屬性攜帶藥物或基因并保持活性[1]，發(fā)揮分子探針的作用，與超聲造影技術結合后在精準成像的同時實現(xiàn)靶向給藥治療[2]，為臨床的診療工作提供有效的醫(yī)學手段。屬于第一代光敏劑的血卟啉單甲醚 （hematoporphyrinmono-methyl ether，HMME）基于其光敏和聲敏的雙重特點[3，4]可作為一種增效劑被包裹在超聲造影劑殼膜內(nèi)，以期在增強超聲顯像和治療效果方面起到作用。 筆者擬從制備材料的選擇、納米微泡與抗體的連接方式、反應條件及合成后的驗證方式等幾方面探索研究，制備得到攜單抗載增效劑超聲納米微泡。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑

聚乳酸羥基乙酸[poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA]（聚合比50 ∶50）（美國Acros）；（+）-生物素-N-羥基琥珀酰亞胺酯 （N-hydroxysuccinimide，NHS）98 %（ALFA，美國）；帕博利珠（pembrolizumab）單抗（MCE 試劑公司，美國）；HMME （上海笛柏化學品技術有限公司， 中國）； 鏈霉親和素 （Streptavidin and Conjugates，SA）（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中國）；全氟戊烷（perfluoropentane，PFP）（TCI 公司，日本）；鏈霉親和素-熒光素異硫氰酸酯偶聯(lián)物（Streptavidin fluorescein isothiocyanate conjugate，Streptavidin-FITC）（Sigma-Aldrich 公司，德國）；六氟化硫（博萊科公司，意大利）。

1.1.2 主要儀器

超聲細胞粉碎儀（蘇州納森超聲科技有限公司，中國）；恒溫孵育搖床（鄭州宏朗儀器設備有限公司，中國）；高速離心機（Eppendorf 公司，德國）；透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡（HITACHI，日本），動態(tài)激光散射儀（PSS 粒度儀公司，美國）；紫外可見分光光度儀（Merinton，美國）；掃描隧道顯微鏡（Nanosurf，瑞士）；激光共聚焦顯微鏡（Zeiss，德國）；超聲診斷儀（飛利浦公司，荷蘭）；恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司，中國）。

1.2 方法

1.2.1 攜單抗載增效劑超聲納米微泡的制備

1.2.1.1 載增效劑納米微泡的制備 將5 mL CHCl3加入50 mg PLGA 與4 mg HMME 的混合液中， 磁力攪拌至混勻溶解并置于冰水浴，后與16 mL 4% 聚乙稀醇（polyvinylalcohol，PVA）及400μLPFP 充分混合溶解，置于超聲細胞粉碎儀內(nèi)工作20 min（功率90 W，間隔5 s），再加入20 mL 2%異丙醇，磁力攪拌10 h，多次離心洗滌，得到載有HMME 超聲納米微泡。

1.2.1.2 鏈霉親和素修飾納米微泡 將2 mg SA 加入上述納米微泡， 先后經(jīng)過pH 6、pH 7.4 MES Buffer 及1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽[1-（3-dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC]、NHS 混合后冰水浴搖床孵育且多次離心（9 000 r/min，5 min）， 洗滌后得到的混合溶液中再次孵育離心洗滌，得到SA 化的載增效劑超聲納米微泡。

1.2.1.3 PD-1 單抗生物素化 將5 mg PD-1 單抗和5 mL pH 7.4 MES Buffer 的混合溶液與20 mg 生物素酯溶于1 mL 超純水的混合溶液中， 使PD-1 單抗與生物素酯的比例保持在1 mg ∶10 μL， 在PD-1 單抗溶液中加入生物素酯溶液后混合， 室溫搖床孵育1.5 h，4 ℃條件下在pH 7.4 MES Buffer 中透析72 h 后去除游離生物素酯。

1.2.1.4 攜PD-1 單抗載增效劑超聲納米微泡的制備上述步驟所得溶液中加入2 mg FITC-SA， 常溫搖床孵育2 h 后在pH 7.4 MES Buffer 中透析72 h，去除游離FITC-SA，與連接SA 之前制備所得納米微泡按比例相混合后再搖床孵育2 h， 多次離心洗滌， 制得攜PD-1 單抗載增效劑超聲納米微泡。

1.2.2 納米微泡的基本性質檢測和實驗表征分析

1.2.2.1 納米微泡物理性質及其表征 采用掃描電子顯微鏡觀察納米微泡大小形態(tài)、表面結構及分布特征，得到表面立體三維圖像。 透射電子顯微鏡觀察觀察納米微泡內(nèi)部精細結構， 獲得表面和內(nèi)部結構信息。動態(tài)激光散射儀分析其粒徑、穩(wěn)定性、聚合物分散指數(shù)，測定表面Zeta 電位。 紫外分光光度計測量計算HMME 的包封率。 超聲診斷儀灰階及造影模式下觀察納米微泡體外超聲顯像效果。

1.2.2.2 PD-1 單抗生物素化制備及結合驗證 在激光共聚焦顯微鏡下驗證PD-1 單抗生物素化及FITC-SA 與生物素化單抗結合，觀察并分析載增效劑及攜帶單抗納米微泡制備情況。

1.2.3 納米微泡相變及超聲顯像效果體外初步驗證

稱取納米微泡、六氟化硫、超純水3 組液體各5 mL，在室溫下進行超聲圖像對比觀察。 將裝有納米微泡溶液的乳膠手套分別放入29 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃和50 ℃幾組不同溫度狀態(tài)下的水浴鍋內(nèi)， 超聲診斷儀在灰階及造影模式下觀察幾組溶液的聲像圖變化。

1.3 統(tǒng)計學方法

計量數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布， 統(tǒng)計描述采用均數(shù)±標準差。 采用線性回歸方程對HMME 濃度與光密度的標準曲線進行繪制。 決定系數(shù)R2用來描述方程擬合優(yōu)度， 回歸方程擬合實際情況的真實度與R2接近1 的程度呈正相關。

2 結果

2.1 納米微泡制備、物理性質表征及結合驗證

2.1.1 納米微泡制備結果

運用乳化法成功制備出以PLGA 為載體、內(nèi)部加載HMME 及PFP，且用PD-1 單抗修飾其表面的攜單抗載增效劑超聲納米微泡。透射電子顯微鏡下表現(xiàn)為內(nèi)部黑色的類球形結構， 表明PFP 及HMME 被包裹于納米微泡內(nèi)核中心而非殼層內(nèi)（圖1）。

圖1 透射電子顯微鏡下攜單抗前后納米微泡為內(nèi)部黑色的類球形結構Fig.1 Images of spherical structures with black interior of nanobubbles before and after carrying monoclonal antibody under transmission electron microscope

2.1.2 穩(wěn)定性觀察

復溶后分散均勻，顏色隨稀釋濃度不同表現(xiàn)差異（圖2），短期內(nèi)4 ℃條件下可以穩(wěn)定保存。

圖2 不同稀釋倍數(shù)下的納米粒乳液外觀Fig.2 Image of appearance of nanobubbles emulsions at different dilution ratios

2.1.3 納米微泡載藥前后大小分布與Zeta 電位

掃描電子顯微鏡下納米微泡呈表面光整的類球形結構，大小較勻稱（圖3），局部可見小范圍粘連聚集現(xiàn)象。 動態(tài)激光散射儀測得納米微泡攜PD-1 單抗前后平均粒徑分別為（322.29±83.56）nm 和（330.17±75.28）nm。 表明PD-1 單抗對微球粒徑無明顯影響（圖4）， 靜置數(shù)天后復測粒徑分布未見明顯變化；納米微泡Zeta 電位是（- 2.41 ± 1.75） mV；聚合物分散指數(shù)約為0.287（圖5）。

圖4 動態(tài)激光散射儀測得納米微泡攜單抗前（A）、后（B）粒徑分布圖Fig.4 Diagrams of particle size distribution of nanobubbles carrying monoclonal antibody before(A)and after(B)by dynamic laser scattering

圖5 動態(tài)激光散射儀測得納米微泡Zeta 電位圖Fig. 5 Zeta potential diagram of nanobubbles by dynamic laser scattering

2.1.4 包封率與影響因素

HMME 投入較少時，部分微球內(nèi)核中空；投入較多時， 有部分游離狀態(tài)的HMME 存在， 當其調節(jié)為PLGA 的0.04 倍時實驗效果最佳。依據(jù)紫外分光光度計測量不同濃度HMME 與二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 配置溶液中最大吸收波長處相對應的光密度值繪制質量濃度-光密度標準曲線，由包封率計算公式（納米微球中HMME 的含量/放入HMME 總量）×100%得到納米微泡中HMME 的包封率為40.4%（圖6）。 納米微球在偏堿性環(huán)境中對HMME 包封狀態(tài)不佳，在酸性環(huán)境中與SA 結合效率較低，當調節(jié)pH=7.4 時， 可較好包封HMME 的同時高效率結合SA。 相應激發(fā)波長下納米微泡在激光共聚焦顯微鏡下表現(xiàn)為紅色熒光（圖7A、B），SA 修飾后的生物素化單抗為綠色熒光（圖7C、D），兩色疊加融合間接表明二者結合成功，攜PD-1 單抗載增效劑納米粒呈黃色熒光（圖7E、F）。

圖6 紫外分光光度計測量后繪制HMME 濃度-光密度標準曲線圖Fig.6 Standard curve of HMME concentration-optical density after measurement by ultraviolet spectrophotometer

圖7 攜單抗前后納米微泡激光共聚焦掃描圖Fig.7 Laser confocal scanning images of nanobubbles before and after carrying monoclonal antibody

2.2 納米微泡體外相變及聲像圖表現(xiàn)

2.2.1 納米微泡體外相變

實驗制備納米微泡一定溫度下體外超聲顯像均勻度不及六氟化硫微泡，但回聲更強（圖8）。 超聲灰階模式中隨溫度升高的過程中納米微泡由少許點狀等回聲逐漸轉變?yōu)檩^多的氣泡樣強回聲，最后回聲再次降低；造影模式下有相同的聲像圖改變過程，由少量增強至范圍明顯擴大，到最后減少消失。 整個變化過程中回聲由低到高、增強明顯由少到多的分界點在40 ℃左右（圖9）。

圖8 室溫恒溫狀態(tài)體外超聲灰階模式下納米微泡、六氟化硫微泡及超純水聲像圖對比Fig.8 Comparison of ultrasound images of nanobubbles，sulfur hexafluoride microbubbles and ultrapure water in vitro at room temperature by ultrasonic gray-scale mode

圖9 溫度升高過程中納米微泡聲像圖變化過程Fig.9 Ultrasonographic changes of nanobubbles during temperature rising

2.2.2 體外超聲顯像效果

納米微泡隨溫度升高發(fā)生相變形成直徑更大的微泡，增強了超聲顯像效果；溫度繼續(xù)升高達一定界值（50 ℃左右），微泡破裂融合后，超聲增強強度隨之下降。3 組液體中納米微球回聲更強但分散性欠佳的可能原因之一是因為Zeta 電位受pH 值影響，且電位絕對值的高低與納米微泡膠態(tài)分散的穩(wěn)定性呈正相關。 當納米微泡整體帶有電荷量少，Zeta 電位絕對值越低時，納米微泡越傾向于凝結或凝聚[5]；其次HMME 的疏水性也可能導致團聚的出現(xiàn)。 由此可見在納米微泡制備過程中關于材料的選擇和比例調控、溶液酸堿度的調試、反應時間的控制等各個環(huán)節(jié)都至關重要。

3 討論

超聲納米微泡造影劑基于其粒徑小、穿透力強等優(yōu)勢，結合修飾靶向配體或抗體等載體技術，易通過組織間隙被動富集于目標靶區(qū)域，實現(xiàn)較好顯像效果同時攜帶藥物和基因達到載藥治療的目的。筆者通過利用生物素-親和素復合系統(tǒng)穩(wěn)固和反應高度專一的特性，將PD-1 單抗與超聲納米微泡進行連接，制備出攜單抗超聲納米微泡。

蛋白質作為納米微泡外殼材料進入體內(nèi)后可能會發(fā)生相應的免疫反應，脂質殼膜亦會存在體循環(huán)穩(wěn)定性差、半衰期短、載藥能力不足等問題，筆者選高分子聚合物PLGA 作為微球殼膜，其成膜性、生物相容性好且無毒，以及可進行生物降解等特點，使微泡能保持較好的穩(wěn)定性，同時在通過調節(jié)聚合物比例間接調整微泡降解速率方面占據(jù)一定優(yōu)勢?；谄浒踩咝У奶匦?，可作為生物材料在超聲造影領域及臨床發(fā)揮作用。

筆者實驗HMME 被包裹于PLGA 殼膜內(nèi)表現(xiàn)為透射電子顯微鏡下的黑色類球形結構。 HMME 投入比例略低時，只被包載于部分PLGA 殼膜內(nèi)，還可見內(nèi)核中空的微球；HMME 投入比例較高時，無法全部被包裹入殼膜內(nèi)，激光共聚焦顯微鏡視野內(nèi)的紅色熒光可能有部分游離狀態(tài)的HMME 存在。 多次調試二者比例保持在1:25 左右時有較好的飽和狀態(tài)，測得HMME 的包封率約為40.4%。

筆者實驗對納米微泡進行SA 化修飾的過程選用碳二亞胺法，利用EDC/NHS 作為交聯(lián)劑可提高殼膜柔韌性[6]的特點，同時將二者作為PLGA 末端羧基的活化劑參與酰胺的合成過程，與SA 上的氨基共同結合后形成穩(wěn)定的酯鍵。

實驗過程中發(fā)現(xiàn)當納米微泡分散于MES Buffer pH 8 的偏堿性環(huán)境中，溶液的顏色狀態(tài)，以及激光共聚焦顯微鏡下的觀察和包封率檢測提示微泡中HMME 包封情況欠佳， 可能原因之一是含有PLGA末端羧基的殼膜在堿性環(huán)境中對HMME 的包封能力受到影響；當MES Buffer 呈酸性時，SA 上氨基的部分結合位點會被占用，從而降低與微泡中PLGA 末端羧基的結合效率。 重新調試MES Buffer 的酸堿度發(fā)現(xiàn)，當pH 值為7.4 時可以較好地平衡HMME 的包封狀態(tài)及SA 的結合效率。

抗體與納米微泡的連接常采用直接法和間接法，前者通過化學鍵橋接或電荷吸附，穩(wěn)定性欠佳；后者主要利用生物素-親和素復合系統(tǒng)。生物素上有與SA連接的結合位點咪唑酮環(huán)，SA 有4 個可與生物素分子結合的亞基色氨酸殘基， 二者依靠高于抗原抗體54 100 萬倍的結合力以4 ∶1 的比例發(fā)生共價反應，親和力極強。 筆者實驗被生物素化的PD-1 抗與SA化的PLGA 納米微泡基于此方式連接形成以不易受酸堿等理化因素干擾為優(yōu)勢的穩(wěn)固的PD-1 單抗-生物素-親和素系統(tǒng)[7]。

HMME 在激光共聚焦顯微鏡相應激發(fā)波長下顯現(xiàn)紅色熒光，被熒光素異硫氰酸酯FITC 標記的鏈霉親和素（FITC-SA）呈現(xiàn)綠色熒光。 選用有不同截留相對分子質量的半透膜透析袋過濾掉PD-1 單抗生物素化過程中多余未反應的生物素酯，再加入FITC-SA參與反應并過濾掉多余的FITC-SA，生物素與SA 的成功結合表現(xiàn)為激光共聚焦顯微鏡下的綠色單熒光，同時間接說明PD-1 單抗已被生物素化。 SA 上的氨基與載HMME 納米粒中PLGA 的末端羧基結后合形成穩(wěn)定的酯鍵， 雙色疊加融合最終表現(xiàn)為黃色熒光，間接表明攜PD-1 單抗載HMME 納米粒成功制備。筆者研究中FITC-SA 可同時作為實驗及驗證材料參與制備和檢驗過程，通過生物素親和素間穩(wěn)定專一的連接方式，在完成對PD-1 單抗生物素化初步驗證的同時完成攜PD-1 單抗載增效劑納米微泡的制備過程。

液態(tài)氟碳作為超聲納米造影劑內(nèi)核時具有較好的穩(wěn)定性是基于其生物學惰性[2，8]，只有達到觸發(fā)條件時可進行液氣相轉變，空化效應產(chǎn)生的大量微氣泡增大與周圍組織的聲阻抗差，達到較好的顯像效果。 全氟己烷（perfluorohexane，PFH）屬于液態(tài)氟碳常見分類之一，由于其本身具有較高的沸點，達到微球相變所需更高溫度及能量時易造成周圍組織的損傷和凝固性732 壞死。而全氟戊烷（Perfluoropentane，PFP）沸點及相變溫度均較低， 筆者實驗中40 ℃左右開始實現(xiàn)高效率顯像。

PFP 微球相變溫度高于其沸點受拉普拉斯壓力及液態(tài)氟碳微球外殼界面的表面張力等因素的影響；且由于泊松壓力的存在，相變觸發(fā)溫度的高低與微球直徑的大小呈反相關[9]，同時由于液體黏度的存在，相變發(fā)生需要滿足的前提條件之一是PFP 微球初始直徑達到某一界值[10]。筆者實驗中PFP 微球在室溫條件下保持相對穩(wěn)定的狀態(tài)，當達到閾值溫度發(fā)生相變后原尺寸會增大至5 ～6 倍[11]，微泡數(shù)量增加達峰值，超聲圖像上的灰度也到達峰值，一定范圍內(nèi)隨溫度升高進行增大、聚集、融合、破裂的系列過程，隨后回聲強度逐漸減弱，造影模式有著同樣的變化趨勢，直至相變過程完成。 此外納米微泡的組成物質及構成比例[12～15]，以及超聲輻照裝置在聲致相變時關于系統(tǒng)、圖像及探頭等技術參數(shù)如超聲波頻率、聲強的選擇均可影響相變過程。

對HMME 進行靶向修飾可使其在目標微環(huán)境中保持較高濃度，被相應光、聲源激發(fā)后，通過產(chǎn)生的光毒性或單線態(tài)氧等活性氧自由基帶來的細胞毒性[16]，在增強超聲顯像效果的同時起到靶向殺傷作用。由于HMME 本身疏水性而發(fā)生團聚對超聲顯像效果的負面影響，還需進一步探究調整納米微球各構成成分與HMME 之間的混合比例及方式，在實現(xiàn)HMME 作為增效劑的優(yōu)勢被運用的同時，改善不均勻增強的現(xiàn)象。

綜上所述，筆者通過實驗初步對攜單抗載增效劑超聲納米微泡制備的實驗條件及驗證方式進行了探索與研究，利用生物素-親和素復合系統(tǒng)高穩(wěn)定性的前提下可以保持所連接分子生物活性的優(yōu)勢，依靠單抗在體內(nèi)特異性結合相應的靶點抗原，促使靶向性的超聲納米粒到達目標微環(huán)境發(fā)揮作用，以期為靶向超聲造影劑的制備提供新思路，為后續(xù)體內(nèi)實驗及治療研究做鋪墊。

（利益沖突聲明： 所有作者均聲明不存在利益沖突）