趙 博，楊小軍，歐陽運萍，陳 濤，李 鵬

急性肺損傷指各種直接和間接致傷因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內(nèi)皮細胞損傷， 造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導致的急性低氧性呼吸功能不全，死亡率較高[1]，且目前臨床上未有特效藥物用以治療急性肺損傷，因此亟需尋求有效手段治療急性肺損傷。在急性肺損傷過程中會產(chǎn)生炎性細胞因子， 體外實驗表明一些致病因素如炎性細胞因子等可致肺血管內(nèi)皮細胞和肺泡1 型細胞凋亡[2，3]。因此，遏制肺部的炎癥反應與凋亡相關信號轉(zhuǎn)導可能是改善急性肺損傷的有效治療手段。二甲雙胍為口服類降糖藥物，其安全性已得到充分證實。 研究表明二甲雙胍可改善脂多糖（lpopolysaccharide，LPS）誘導的急性肺損傷[4]。 但是二甲雙胍對氧化應激所造成急性肺損傷的作用機制研究較少。 有報道指出二甲雙胍能夠通過p38 絲裂原活化蛋白激酶 （p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK）信號通路減輕氧化應激反應[5]。p38 MAPK 參與了多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展， 是較為關鍵的細胞內(nèi)信號通路， 近年來與慢性阻塞性肺疾病、 急性肺損傷、哮喘等常見呼吸系統(tǒng)疾病關系密切[6]。有研究顯示，遏制p38 MAPK 信號通路能夠抑制細胞凋亡進而減輕肺損傷[7]。 肺Ⅱ型上皮細胞是氧化損傷的主要靶標，具有較難分離獲取且難以在體外傳代的特點[8]。人肺泡上皮細胞A549 與Ⅱ型肺泡上皮細胞具有相似的形態(tài)及生化特性，故而筆者以人肺泡上皮細胞A549 為研究對象， 探討二甲雙胍是否通過調(diào)控p38 MAPK 信號通路表達發(fā)揮對肺泡上皮細胞炎癥反應、 增殖及凋亡的作用，為氧化應激所致肺損傷的相關研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株

人肺泡上皮細胞A549，購自賽百慷（上海）生物技術股份有限公司。

1.1.2 藥品與試劑

過氧化氫（H2O2）、二甲雙胍（純度≥98%。 上海碧云天生物技術有限公司，中國）；p38 MAPK 通路抑制劑SB 203580，p38 MAPK 通路激活劑C16-PAF（純度≥99%。 上海源葉生物科技有限公司，中國）；F-12K 培養(yǎng)液（北京索萊寶生物科技有限公司，中國）；胎牛血清（上海優(yōu)寧維生物科技有限公司，中國）；放射免疫沉淀（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、細胞計數(shù)試劑盒-8（cell count Kit-8，CCK-8）、5-乙炔基-2" 脫氧尿嘧啶核苷 （5-acetylidene-2"deoxyuracil nucleoside，EdU）細胞增殖檢測試劑盒、鼠抗人[p38 MAPK、p-p38 MAPK、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine aspartic protease，Caspase）-3、細胞周期素D1（Cyclin D1）及β-肌動蛋白（beta-actin，β-actin）一抗]、辣根過氧化物酶標記的二抗（山羊抗鼠IgG）（上海翌圣生物科技股份有限公司，中國）；酶聯(lián)免疫吸附分析 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒 （上海恒遠生物科技有限公司）；Hoechst 33258 染色試劑盒（上海愛必信生物科技有限公司，中國）。

1.1.3 主要儀器

層流超凈工作臺（型號VS-840-1。上海博迅實業(yè)有限公司， 中國）； 倒置熒光顯微鏡 （型號WMJ-9930BD。 上海豫光儀器有限公司，中國）；超純水儀（型號OSJ-UP。 博科醫(yī)療器械有限公司）；酶標儀（型號Multiskan FC。 美國Thermo 公司）；智能高速冷凍離心機（型號TG18G。 鹽城凱特實驗儀器有限公司，中國）。

1.2 方法

1.2.1 人肺泡上皮細胞A549 培養(yǎng)

于超低溫冰箱中取肺泡上皮細胞A549 凍存細胞進行復蘇后，加F-12K 培養(yǎng)液（含1%青-鏈霉素、10 %胎牛血清、5 % CO237 ℃） 培養(yǎng)， 待細胞貼壁（80 %～90%）后傳代，取第3 代（對數(shù)生長期細胞）進行實驗。

1.2.2 分組及給藥

將細胞分為對照組、H2O2組、1.25 mmol/L 二甲雙胍組、2.50 mmol/L 二甲雙胍組、5.00 mmol/L 二甲雙胍組、SB 203580 組、抑制劑組和激活劑組。 對照組細胞不做干預，H2O2組以400 μmol/L H2O2刺激A549 細胞24 h 構建體外急性肺損傷細胞模型，1.25 mmol/L 二甲雙胍組、2.50 mmol/L 二甲雙胍組、5.00 mmol/L 二甲雙胍組在H2O2組基礎上分別加入1.25、2.50、5.00 mmol/L二甲雙胍進行干預，SB 203580 組在H2O2組基礎上加入10 mmol/L p38 MAPK 通路抑制劑SB 203580 進行干預， 抑制劑組在5.00 mmol/L 二甲雙胍組基礎上加入10 mmol/L p38 MAPK 通路抑制劑SB 203580 進行干預， 激活劑組在5.00 mmol/L 二甲雙胍組基礎上加入10 μmol/L p38 MAPK 通路激活劑C16-PAF 進行干預，干預24 h（復孔×3）。 后置培養(yǎng)箱（37 ℃、體積分數(shù)5%CO2）培養(yǎng)。

1.2.3 CCK-8 法

采用CCK-8 測定人肺泡上皮細胞A549 活力。

取8 組細胞（96 孔板，2×105）加細胞懸液100 μL干預24 h。加CCK-8 溶液（10 μL）培養(yǎng)2 h，酶標儀測各孔光密度（optical density，OD）（450 nm 處）值后計算細胞活力。 細胞活力=OD（1.25 mmol/L 二甲雙胍組或2.50 mmol/L 二甲雙胍組或5.00 mmol/L 二甲雙胍組或H2O2組或SB 203580 組- 空白組）/OD （對照組-空白組）。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附分析法

采用ELISA 檢測人肺泡上皮細胞A549 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醇（malondialdehyde，MDA）和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）表達水平。

8 組細胞收集后于4 ℃、12 000 g 條件下離心（10 min） 取上清液， 按照ELISA 試劑盒說明書測定SOD、MDA 和IL-6 水平。測量各孔在450 nm 處的OD值后根據(jù)標準曲線計算相關因子表達水平。

1.2.5 EdU 法

測定人肺泡上皮細胞A549 增殖率。取8 組細胞，去除培養(yǎng)液后固定（4%多聚甲醛，0.5 mL）15 min，用牛血清白蛋白 （bovine serum albumin，BSA）（3 %，0.5 mL）洗滌3 次，洗去多余的多聚甲醛和細胞，然后用TritonX-100 （0.3 %，0.5 mL，10 min） 去除殘留BSA，再用BSA（3%，0.5 mL）洗滌3 次；每孔加200 μL Click 反應液（12 孔板）后室溫下避光孵育（30 min），用BSA（3 %，0.5 mL）洗滌3 次；加入Hoechst 處理10 min 洗滌3 次后裝片，拍照（熒光顯微鏡）、數(shù)據(jù)處理（ImageJ 軟件）。 用ImageJ 分別計算紅色細胞和藍色細胞數(shù)量，最后計算細胞增殖率，計算方法為：紅色細胞數(shù)占藍色細胞數(shù)（即總細胞）的比值。

1.2.6 Hoechst 33258 染色法

測定人肺泡上皮細胞A549 凋亡率。

將干預24h 的細胞用PBS 洗滌細胞2 次（5 分/次），加入新鮮配置4%多聚甲醛，于4 ℃固定10 min。洗滌3 次，用Hoechst 33258 染色液（5 mg/L）染色10 min，洗滌3 次，封固后熒光顯微鏡觀察，對細胞凋亡情況進行拍照。

細胞凋亡特征：核體積濃縮變小，染色不均濃染且所發(fā)熒光較強，呈亮藍色。

細胞凋亡率（%）=（凋亡細胞數(shù)/總的細胞數(shù)）×100%。

1.2.7 Western blot 法

檢測人肺泡上皮細胞A549 中Caspase-3、Cyclin D1 與p38 MAPK 信號通路相關蛋白的表達水平。

取各組4 h 的細胞，提取各組細胞蛋白質(zhì)定量后上樣，跑膠，轉(zhuǎn)膜，封閉2 h 后參照抗體說明書加入一定稀釋比例的一抗 （p38 MAPK、p-p38 MAPK、Caspase-3、Cyclin D1 及β-actin），孵育過夜（4 ℃）后，用洗滌緩沖溶液洗滌，加二抗（山羊抗鼠IgG，孵育2 h），洗滌（3 次），顯影后拍照（凝膠成像系統(tǒng)）記錄。蛋白表達量為目的蛋白的蛋白灰度值（G）占內(nèi)參蛋白（β-actin）的比值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 軟件進行統(tǒng)計分析。 計量資料表示方法為均數(shù)± 標準差表示， 多組間表示方法為單因素方差分析，符合正態(tài)分布且方差齊時，兩組間比較Dunnett’t檢驗；不符合正態(tài)分布時，采用秩和檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度二甲雙胍組、 對照組、H2O2 組、SB 203580 組人肺泡上皮細胞A549 活力比較

干預24 h 后，與對照組相比，H2O2組細胞活力顯著降低（P＜0.05）；與H2O2組比較，1.25、2.50 mmol/L二甲雙胍組細胞活力差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），5.00 mmol/L 二甲雙胍組和SB 203580 組細胞活力顯著升高（P＜0.05），因此選擇在5.00 mmol/L 二甲雙胍基礎上分別加入p38 MAPK 通路抑制劑和激活劑作為抑制劑組和激活劑組進行p38 MAPK 通路驗證。見圖1。

圖1 6 組A549 細胞的細胞活力比較Fig. 1 Comparison of cell viability histograms of A549 cells in 6 groups

2.2 6 組人肺泡上皮細胞A549 SOD、MDA 和IL-6表達水平比較

干預24 h 后，與對照組比較，H2O2組細胞MDA、IL-6 表達水平顯著升高（P＜0.05），SOD 表達水平顯著降低（P＜0.05）；與H2O2組比較，5.00 mmol/L 二甲雙胍組和SB 203580 組MDA、IL-6 表達水平顯著降低（P＜0.05），SOD 表達水平顯著升高（P＜0.05）；與5.00 mmol/L 二甲雙胍組比較， 抑制劑組MDA、IL-6表達水平進一步下降（P＜0.05），SOD 表達水平進一步上升（P＜0.05），激活劑組MDA、IL-6 表達水平上升（P＜0.05），SOD 表達水平下降（P＜0.05）。 見表1。

表1 6 組A549 細胞MDA、SOD、IL-6 表達水平比較Tab.1 Comparison of expression levels of A549 cells MDA，SOD and IL-6 in 6 groups

2.3 6 組人肺泡上皮細胞A549 的增殖率比較

干預24 h 后，與對照組比較，H2O2組細胞增殖率顯著降低 （0.27±0.03vs0.56± 0.03。t= 0.360，P＜0.05）；與H2O2組比較，5.00 mmol/L 二甲雙胍組和SB 203580 組細胞增殖率顯著升高（0.42±0.03vs0.27±0.03，0.43 ± 0.03vs0.27 ± 0.03。t= 0.241、0.257，P＜0.05）；與5.00 mmol/L 二甲雙胍組比較，抑制劑組細胞增殖率進一步上升（0.54±0.03vs0.42±0.03。t=0.192，P＜0.05）， 激活劑組細胞增殖率下降 （0.28±0.04vs0.42±0.03。t=1.225，P＜0.05）。 見圖2。

圖2 6 組A549 細胞增殖率比較EdU 增殖圖（×20，比例尺長度為100 μm）Fig.2 EdU proliferation images of A549 cells proliferation rate in 6 groups(×20，scale bar:100 μm)

2.4 6 組人肺泡上皮細胞A549 凋亡情況比較

干預24 h 后，與對照組比較，H2O2組細胞凋亡率顯著升高（68.67%±3.06%vs7.67%±1.53%。t=46.938，P＜0.05）；與H2O2組比較，5.00 mmol/L 二甲雙胍組和SB 203580 組細胞凋亡率顯著降低（38.00%±3.6 %1vs68.67 % ± 3.06 %，39.00 % ± 3.61 %vs68.67 % ± 3.06 %。t= 18.082、17.493，P＜0.05）；與5.00 mmol/L 二甲雙胍組比較， 抑制劑組細胞凋亡率進一步下降（9.00%±1.73%vs38.00%±3.61%。t=19.691，P＜0.05），激活劑組凋亡率上升（57.67%±4.51%vs38.00%±3.61%。t=9.719，P＜0.05）。 見圖3。

圖3 6 組A549 細胞的凋亡Hoechst 33258 染色圖（×20，比例尺長度為100 μm）Fig.3 Hoechst 33258 staining images of A549 apoptosis in 6 groups(×20，scale bar:100 μm)

2.5 6 組人肺泡上皮細胞A549 中Caspase-3、Cyclin D1 蛋白表達水平比較

干預24 h 后，H2O2組細胞Caspase-3 表達水平較對照組升高（0.50±0.01vs0.05±0.01。t=0.722，P＜0.05），Cyclin D1 水平較對照組降低 （0.30 ± 0.04vs0.80±0.03。t=0.802，P＜0.05）；5.00 mmol/L 二甲雙胍組和SB 203580 組Caspase-3 水平較H2O2組降低（0.11±0.02vs0.50±0.01，0.13±0.04vs0.50±0.01。t= 0.626、0.594，P＜0.05），Cyclin D1 水平較H2O2組上升（0.50±0.05vs0.30±0.04，0.50±0.02vs0.30±0.04。t=0.321、0.321，P＜0.05）； 在抑制劑組細胞中Caspase-3 水平較5.00 mmol/L 二甲雙胍組進一步下降 （0.05 ± 0.01vs0.11 ± 0.02。t= 0.096，P＜0.05），Cyclin D1 水平較5.00 mmol/L 二甲雙胍組進一步上升（0.80±0.02vs0.50±0.05。t=0.481，P＜0.05），激活劑組Caspase-3 水平上升 （0.50 ± 0.03vs0.11 ±0.02。t=0.626，P＜0.05），Cyclin D1 水平下降（0.30±0.03vs0.50±0.05。t=0.321，P＜0.05）。 見圖4。

圖4 6 組A549 細胞中Caspase-3、Cyclin D1 蛋白表達電泳圖Fig.4 Electrophoretogram of A549 cells Caspase-3 and Cyclin D1 protein expression in 6 groups

2.6 6 組人肺泡上皮細胞A549 中p38 MAPK 信號通路相關蛋白的表達水平比較

對p38 MAPK 信號通路關鍵蛋白p38 MAPK 和p-p38 MAPK 表達水平進行檢測后發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，H2O2組細胞p-p38 MAPK 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與H2O2組比較，5.00 mmol/L 二甲雙胍組和SB 203580 組p-p38 MAPK 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與5.00 mmol/L 二甲雙胍組比較，pp38 MAPK 蛋白表達水平在抑制劑組中進一步顯著降低（P＜0.05），而在激活劑組中p-p38 MAPK 表達水平上升（P＜0.05），p38 MAPK 表達水平在各組中均無顯著性變化（P＞0.05）。 圖5、表2。

表2 6 組A549 細胞中p38 MAPK 信號通路相關蛋白表達水平比較Tab.2 Comparison of A549 cells expression levels of p38 MAPK signaling pathway-related proteins in 6 groups

圖5 6 組A549 細胞中p38 MAPK 信號通路相關蛋白表達電泳圖Fig.5 Electrophoretogram of A549 cells p38 MAPK signaling pathway-related protein expression in 6 groups

3 討論

急性肺損傷作為臨床常見的危重急癥，發(fā)病時通常出現(xiàn)肺泡通透性增加、急性低氧性呼吸衰竭和肺泡水腫等癥狀[9]。 由于急性肺損傷發(fā)病機制較為復雜且尚不完全明確，目前臨床上仍有較高的病死率[10]。 機械通氣療法對癥治療急性肺損傷是唯一提高其生存率的方法，臨床多為酮康唑、抗氧化劑、營養(yǎng)素、糖皮質(zhì)激素等對癥治療方法，還未有明確有效藥物作為治療方法[11，12]。因此，探究有效藥物治療急性肺損傷具有重要意義。

二甲雙胍是臨床上已經(jīng)應用多年的雙胍類口服降糖藥，除具有降糖作用外，近年來研究發(fā)現(xiàn)其還能發(fā)揮抗炎效應及減少氧化應激損傷[13，14]。 吳柯佳[15]研究顯示二甲雙胍能夠通過腺苷酸活化蛋白激酶（adenylate activated protein kinase，AMPK） 抑制雷帕霉素靶蛋白復合體1（rapamycin target protein complex 1，mTORC1）減輕內(nèi)毒素誘導的急性肺損傷，從而發(fā)揮抗炎作用。另有研究表明二甲雙胍能夠通過激活信號通路起到對H2O2誘導的PC12 細胞損傷的保護作用[16]。 Wang Y 等[17]在LPS 誘導的急性肺損傷中的研究顯示， 二甲雙胍具有減輕肺組織的損傷的作用，但二甲雙胍作用H2O2誘導的急性肺損傷鮮有報道。 筆者研究發(fā)現(xiàn)，H2O2組處理A549 細胞后其活力明顯降低， 而5.00 mmol/L 二甲雙胍組和SB 203580 組細胞活力明顯高于H2O2組， 提示H2O2能夠降低細胞活力，5.00 mmol/L 二甲雙胍和SB 203580 則能夠促進細胞活力。 因只有5.00 mmol/L 二甲雙胍組與H2O2組相比細胞活力差異有統(tǒng)計學意義，故而筆者研究選擇該濃度進行后續(xù)實驗。結(jié)果表明經(jīng)H2O2誘導后A549細胞凋亡率、MDA、IL-6 表達、Caspase-3 表達水平上升，增殖率、SOD 和Cyclin D1 水平下降，說明H2O2能夠抑制細胞增殖、 誘導凋亡并減輕H2O2誘導的氧化損傷。 加入5.00 mmol/L 二甲雙胍和SB 203580 處理后，則顯著扭轉(zhuǎn)了這些指標的變化趨勢，證明二甲雙胍和SB 203580 可以抑制H2O2誘導的A549 細胞的凋亡、氧化損傷與炎癥反應并改善細胞增殖，這與熊存全等[18]研究結(jié)果姜黃素能夠抑制A549 細胞凋亡并對H2O2誘導的A549 細胞急性損傷具有保護作用的報道相符。 以上結(jié)果說明了二甲雙胍在H2O2誘導的A549 細胞急性損傷中通過上調(diào)Cyclin D1 水平促進細胞增殖，下調(diào)Caspase-3 水平抑制細胞凋亡、氧化損傷及炎癥反應，進而起到保護肺組織損傷的作用。

p38 MAPK 是MAPK 家族中的重要成員之一，近年來研究表明p38 MAPK 信號通路有調(diào)控急性肺損傷炎癥反應、調(diào)節(jié)細胞凋亡及內(nèi)皮通透性的作用[19，20]。Zhao Y 等[21]研究發(fā)現(xiàn)p38 MAPK 活化后能夠上調(diào)炎癥反應及凋亡蛋白Caspase-3/7 表達， 促進肺內(nèi)皮細胞的凋亡。 Grimsey NJ 等[22]發(fā)現(xiàn)p38α 自磷酸化可以調(diào)控IL-6 表達，影響內(nèi)皮細胞通透性。另有研究表明阻斷p38 MAPK 信號通路能夠減輕肺損傷[23]。 上述研究表明，p38 MAPK 信號通路與急性肺損傷及炎癥反應關系密切。王貴佐等[24]研究顯示二甲雙胍具有保護LPS 誘導的急性肺損傷的作用。 武麗濤等[25]在二甲雙胍對急性肝損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)處理后，IL-6 表達水平降低，可能是通過抑制p38 MAPK 信號通路減輕炎癥反應。 另有在LPS 所致急性肺損傷研究中顯示黃芩苷能夠通過抑制p38 MAPK 信號通路起到有效保護作用[26]。 因此，筆者為探究二甲雙胍對H2O2誘導的急性肺損傷與p38 MAPK 信號通路的調(diào)控作用，開展了相關實驗， 結(jié)果顯示，H2O2誘導后p-p38 MAPK蛋白表達顯著高于對照組， 在加入5.00 mmol/L 二甲雙胍和SB 203580 后p-p38 MAPK 蛋白表達顯著低于H2O2組，這提示可能是因為二甲雙胍和SB 203580抑制了p38 MAPK 通路的信號轉(zhuǎn)導。 在5.00 mmol/L二甲雙胍組基礎上分別加入p38 MAPK 信號通路抑制劑SB 203580 和激活劑C16-PAF 進行p38 MAPK通路進行驗證， 發(fā)現(xiàn)加入抑制劑后， 細胞凋亡率、MDA、IL-6 表達、Caspase-3、p-p38 MAPK 蛋白表達進一步降低， 增殖率、SOD 和Cyclin D1 蛋白表達水則進一步升高，而激活劑組則扭轉(zhuǎn)了這一趨勢。 提示二甲雙胍促進H2O2誘導的A549 細胞的增殖，抑制凋亡、 氧化損傷及炎癥反應， 可能是通過抑制p38 MAPK 信號通路發(fā)揮作用的。

綜上所述，筆者實驗證明二甲雙胍能夠顯著緩解H2O2誘導的人肺泡上皮細胞A549 炎癥反應，減輕氧化損傷，并通過上調(diào)Cyclin D1 促進增殖，下調(diào)Caspase-3 抑制細胞凋亡， 其作用機制可能與抑制p38 MAPK 通路的信號轉(zhuǎn)導相關。接下來可探究二甲雙胍是否通過其他信號通路發(fā)揮對H2O2誘導的急性肺損傷保護作用，為阻斷急性肺損傷的相關研究提供新的切入點。