夏 克，符來想，陳前永

骨性關節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是常見的骨關節(jié)退行性疾病，以關節(jié)軟骨變性、損傷、破壞及代償性軟骨下骨質增生、骨贅形成為特征。 軟骨細胞是關節(jié)軟骨組織中唯一的細胞類型， 參與軟骨組織功能及形態(tài)、細胞外基質代謝的調控。 軟骨細胞炎癥性損傷與OA 的發(fā)生發(fā)展密切相關[1，2]，但相關的分子機制尚不清楚，臨床上也缺乏特異性的OA 治療藥物。 近些年的分子生物學研究證實內質網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）參與多種慢性疾病的發(fā)生發(fā)展；ERS 是指內質網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失去平衡后出現(xiàn)內質網(wǎng)中錯誤折疊蛋白聚集的病理狀態(tài)， 持續(xù)激活的ERS 是細胞凋亡的上游信號、 介導促進細胞凋亡的生物學效應。軟骨細胞凋亡是造成OA 進程中軟骨細胞損傷的重要生物學因素， 相關細胞實驗證實ERS 激動劑促進軟骨細胞凋亡、 相關動物實驗證實ERS 拮抗劑改善OA 大鼠的關節(jié)軟骨退行性變及細胞凋亡[3，4]。 基于此提出假說：ERS 調控軟骨細胞凋亡參與OA 進程中軟骨骨細胞炎癥性損傷。 為驗證該假說，筆者將在白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）誘導軟骨細胞炎癥性損傷模型中觀察ERS 對細胞凋亡的調控作用，旨在為初步揭示OA 發(fā)病機制、發(fā)現(xiàn)OA 新的治療靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞株

小鼠軟骨細胞株ATDC5， 由中國武漢尚恩生物技術有限公司提供。

1.1.2 主要試劑與儀器

IL-1β（ Sigma，美國）；c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK） 拮抗劑SP600125（MCE，美國）； 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-12（cysteinyl aspartate specific proteinase 12，Caspase-12）抑制劑氟甲基酮（Z-ATAD-fluoromethylketone，Z-ATADFMK）、CCK8 法增殖檢測試劑盒（Abcam，美國）；TdT介導的dUTP 缺口末端標記（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）凋亡檢測試劑盒（熒光法）（上海碧云天生物公司， 中國）； 葡萄糖調節(jié)蛋白78 （glucose-regulated protein 78，GRP78）、C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、 磷酸化c-Jun 氨基末端激酶（phosphorylation c-Jun N-terminal kinase，p-JNK）、裂解型caspase-12（Cleaved caspase-12）、βactin 特異性一抗（CST，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組處理

將ATDC5 細胞復蘇后，在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)液、用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。分為對照組、IL-1β 組、si-NC 組、si-NC+IL-1β 組、si-CHOP+IL-1β 組、溶劑對照組、溶劑+IL-1β 組、JNK 拮抗劑+IL-1β 組、Caspase-12抑制劑+IL-1β 組。

傳代后的細胞接種在培養(yǎng)板內進行分組處理。對照組用不含藥物的培養(yǎng)液處理，IL-1β 組含有10 ng/mL IL-1β 的培養(yǎng)液處理，si-NC 組轉染NC siRNA，si-NC+IL-1β 組在含有10 ng/mL IL-1β 的培養(yǎng)液中轉染NC siRNA，si-CHOP + IL-1β 組在含有10 ng/mL IL-1β的培養(yǎng)液中轉染CHOP siRNA，溶劑對照組用含有二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）（體積分數(shù)0.1%）的培養(yǎng)液處理，溶劑+IL-1β 組用含有DMSO（體積分數(shù)0.1%） 和10 ng/mL IL-1β 的培養(yǎng)液處理，JNK拮抗劑+IL-1β 組用含有10.0 μmol/L（DMSO 的體積分數(shù)為0.1%）JNK 拮抗劑SP600125 和10 ng/mL IL-1β 的培養(yǎng)液處理，Caspase-12 抑制劑+IL-1β 組用含有2.0 μmol/L（DMSO 的體積分數(shù)為0.1 %）Caspase-12 抑制劑Z-ATAD-FMK 和10 ng/mL IL-1β 的培養(yǎng)液處理。

1.2.2 細胞增殖的檢測

將5×103個ATDC5 細胞接種96 孔培養(yǎng)板內，貼壁24 h 后按照1.2.1 節(jié)進行分組處理； 繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，在每個培養(yǎng)孔內加入10 μL CCK8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h 后將培養(yǎng)板放入酶標儀， 檢測每孔細胞在波長490 nm 的光密度（optical density，OD）490nm值。

1.2.3 細胞凋亡的檢測

將1×104個ATDC5 細胞接種24 孔培養(yǎng)板內，貼壁24 h 后按照1.2.1 節(jié)進行分組處理； 繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后棄去培養(yǎng)液， 用4%多聚甲醛溶液固定細胞后，采用試劑盒進行TUNEL 染色和4"，6- 二脒基-2-苯基吲哚 （4"，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）復染，抗熒光猝滅封片液封片后在顯微鏡高倍（×400）視野下觀察。凋亡細胞顯綠色熒光，細胞核顯藍色熒光。計算凋亡率（%）=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.2.4 蛋白表達的檢測

將5×105個ATDC5 細胞接種12 孔培養(yǎng)板內，貼壁24 h 后按照1.2.1 節(jié)進行分組處理；繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液、提取細胞蛋白，將含有20 μg 蛋白的樣本加入聚丙烯酰胺凝膠中電泳，而后將凝膠中的蛋白電轉移至硝酸纖維素膜， 將膜放入5%脫脂牛奶中、 搖床上室溫孵育1 h， 洗膜3 次后分別孵育GRP78（1 ∶500 稀釋）、CHOP（1 ∶600 稀釋）、p-JNK（1 ∶400 稀釋）、Caspase-12（1 ∶800 稀釋）及β-actin（1 ∶5 000 稀釋）的特異性一抗、4 ℃過夜。 次日洗膜3次后室溫孵育辣根過氧化物酶標記的二抗（1 ∶4 000稀釋）1 h，再次洗膜3 次，在凝膠成像系統(tǒng)中對膜上的蛋白進行顯影，以目的蛋白/β-actin 的灰度值分析蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 版本軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。 計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗， 多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01 為差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 IL-1β 組與對照組細胞增殖和凋亡水平比較

采用CCK8 法檢測細胞增殖的OD490nm水平，采用TUNEL 法檢測細胞的凋亡率。IL-1β 組ATDC5 細胞的OD490nm水平低于對照組 （0.51 ± 0.07vs1.06 ±0.12）， 細胞凋亡率高于對照組 （9.58%±1.24%vs1.35%±0.17%），差異有顯著統(tǒng)計學意義（t=8.853、14.703，P＜0.001）。

2.2 IL-1β 組與對照組ERS 標志蛋白和凋亡蛋白表達水平比較

采用Western blot 檢測ERS 標志蛋白GRP78 和ERS 凋亡蛋白CHOP、p-JNK、Cleaved caspase-12 的表達水平。IL-1β 組ATDC5 細胞中GRP78、CHOP、p-JNK、Cleaved caspase-12 的相對表達水平高于對照組， 差異有顯著統(tǒng)計學意義 （t= 9.339、17.206、11.667、10.217，P＜0.001）。 見圖1、表1。

表1 對照組與IL-1β 組ATDC5 細胞GRP78、CHOP、p-JNK、Cleaved caspase-12 表達比較Tab.1 Comparison of GRP78，CHOP，p-JNK，Cleaved caspase-12 expression in ATDC5 cells between control group and IL-1β group

圖1 對照組和IL-1β 組ATDC5 細胞中GRP78、CHOP、p-JNK、Cleaved caspase-12 的表達電泳圖Fig. 1 Electrophoretograms of GRP78， CHOP， p-JNK and Cleaved caspase-12 expression in ATDC5 cells of control group and IL-1β group

2.3 si-NC 組、si-NC + IL-1β 組、si-CHOP +IL-1β 組組間細胞增殖和凋亡水平比較

si-NC+IL-1β 組ATDC5 細胞增殖OD490nm水平低于si-NC 組，細胞凋亡率及CHOP 表達水平高于si-NC 組（t=14.378、10.001、14.536，P＜0.05）；si-CHOP+IL-1β 組ATDC5 細胞OD490nm水平高于si-NC+IL-1β 組，凋亡率及CHOP 表達水平低于si-NC+IL-1β組（t=16.250、9.395、11.757，P＜0.05）。 見圖2、表2。

圖2 si-NC 組、si-NC+IL-1β 組、si-CHOP+IL-1β 組CHOP表達電泳圖Fig. 2 Electrophoretograms of CHOP expression in si-NC group，si-NC+IL-1β group and si-CHOP+IL-1β group

2.4 溶劑對照組、溶劑+ IL-1β 組、JNK 拮抗劑+IL-1β 組組間軟骨細胞增殖和凋亡水平比較

溶劑+ IL-1β 組ATDC5 細胞增殖OD490nm水平低于溶劑對照組， 細胞凋亡率及p-JNK 的表達水平高于溶劑對照組（t=12.964、9.833、15.408，P＜0.05）；JNK 拮抗劑+ IL-1β 組ATDC5 細胞增殖OD490nm水平高于溶劑+IL-1β 組， 細胞凋亡率及p-JNK 的表達水平低于溶劑+ IL-1β 組 （t= 14.795、9.779、11.339，P＜0.05）。 見圖3、表3。

表3 溶劑對照組、溶劑+IL-1β 組、JNK 拮抗劑+IL-1β 組組間p-JNK 表達、增殖和凋亡比較Tab.3 Comparison of p-JNK expression，proliferation and apoptosis in solvent control group，solvent+IL-1β group and JNK antagonist+IL-1β group

圖3 溶劑對照組、 溶劑+IL-1β 組、JNK 拮抗劑+IL-1β 組p-JNK 表達電泳圖Fig.3 Electrophoretograms of p-JNK expression in solvent control group，solvent+IL-1β group and JNK antagonist+IL-1β group

2.5 溶劑對照組、 溶劑+ IL-1β 組、Caspase-12 抑制劑+ IL-1β 組組間細胞增殖和凋亡水平比較

溶劑+ IL-1β 組ATDC5 細胞增殖OD490nm水平低于溶劑對照組， 細胞凋亡率及Cleaved caspase-12表達水平高于溶劑對照組 （t= 11.600、11.289、15.912，P＜0.05）；Caspase-12 抑制劑+IL-1β 組ATDC5 細胞增殖OD490nm水平高于溶劑+IL-1β 組，細胞凋亡率及Cleaved caspase-12 表達水平低于溶劑+IL-1β 組（t=13.080、9.117、11.658，P＜0.05）。見圖4、表4。

表4 溶劑對照組、溶劑+IL-1β 組、Caspase-12 抑制劑+IL-1β 組組間Cleaved caspase-12 表達、增殖和凋亡比較Tab. 4 Comparison of Cleaved Caspase-12 expression， proliferation and apoptosis in solvent control group， solvent + IL-1β group and Caspase-12 inhibitor+IL-1β group

圖4 溶劑對照組、 溶劑+IL-1β 組、Caspase-12 抑制劑+IL-1β 組Cleaved caspase-12 表達電泳圖Fig. 4 Electrophoretograms of Cleaved caspase-12 expression in solvent control group， solvent + IL-1β group and Caspase-12 inhibitor+IL-1β group

3 討論

關節(jié)軟骨細胞的炎性損傷在OA 的進程中發(fā)揮重要作用，在炎性介質的作用下軟骨細胞發(fā)生過度凋亡會導致軟骨組織退行性變和破壞、 軟骨下骨贅形成。 臨床上常用的OA 治療藥物包括非甾體類藥物、軟骨營養(yǎng)和修復藥物， 但受限于OA 發(fā)病機制不明確，目前缺乏能夠抑制軟骨細胞凋亡的特異性OA 治療藥物[5，6]。多項國內外OA 相關的細胞實驗研究采用10 ng/mL IL-1β 誘導軟骨細胞炎性損傷的方式建立OA 細胞模型[7～9]，筆者也采用該方法建立OA 細胞模型， 細胞模型增殖水平降低、 凋亡率增加的變化與OA 進程中軟骨細胞凋亡的特征符合。 筆者將在該OA 細胞模型中研究軟骨細胞凋亡的調控機制。

細胞凋亡的調控途徑包括線粒體凋亡途徑、死亡受體凋亡途徑、ERS 凋亡途徑。 ERS 是新近受到越來越多關注的凋亡調控機制[10，11]。 內質網(wǎng)在細胞內負責蛋白質合成轉運、糖基化修飾、鈣離子再分布的調控；慢性炎癥、缺血缺氧、高糖等病理因素刺激會造成未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內質網(wǎng)中聚集，進而激活ERS。 適度的ERS 有助于維持細胞內蛋白質穩(wěn)定、保證細胞的適應性存活； 但是持久且強烈的ERS 不利于細胞內環(huán)境穩(wěn)定， 會造成GRP78 表達增加并通過下游信號轉導促進細胞凋亡、加重組織損傷[12～14]。 既往OA 相關的動物實驗和細胞實驗[4，15，16]、筆者研究的細胞實驗均證實OA 軟骨組織及軟骨細胞中內質網(wǎng)標志基因GRP78 的表達水平均明顯增加，OA 進程中存在ERS 的過度激活。 已有研究證實ERS 激動劑對軟骨細胞的凋亡具有促進作用，ERS 拮抗劑抑制OA大鼠關節(jié)軟骨的細胞凋亡[3，4]，提示ERS 可能通過促進軟骨細胞凋亡的途徑參與OA 的發(fā)生發(fā)展，但ERS調控軟骨細胞凋亡的具體機制尚不明確。

ERS 對細胞凋亡的途徑依賴于下游CHOP、JNK、Caspase-12 途徑，CHOP 通過調控下游B 細胞淋巴瘤/白血病-2 削弱細胞的抗凋亡能力、促進細胞色素C 的釋放及細胞凋亡；JNK 磷酸化為有活性的p-JNK及Caspase-12 裂解為有活性的Cleaved caspase-12均能作用于Caspase 級聯(lián)激活途徑， 引起Caspase-3激活并引起細胞凋亡[17，18]。 筆者研究在OA 軟骨細胞模型中檢測到CHOP、p-JNK、Cleaved caspase-12 的表達水平均增加， 提示OA 進程中ERS 的激活可能引起下游CHOP 的高表達、JNK 的磷酸化活化、Caspase-12 的裂解后活化，進而介導了促進細胞凋亡的生物學效應。 為了進一步驗證OA 細胞模型中ERS下游CHOP、JNK、Caspase-12 對凋亡的調控作用，筆者在OA 細胞模型中分別進行了CHOP 表達的敲低、JNK 拮抗劑干預、Caspase-12 抑制劑干預， 經上述干預后細胞的增殖水平增加、凋亡率降低，表明OA 細胞模型中ERS 激活通過下游CHOP、JNK、Caspase-12介導了細胞凋亡。

綜上所述，IL-1β 誘導軟骨細胞炎性損傷模型中ERS 通過CHOP、JNK 和Caspase-12 引起細胞凋亡。在OA 進程中關鍵軟骨細胞在炎癥反應的作用下會發(fā)生ERS 激活，激活的ERS 進一步通過下游CHOP、JNK、Caspase-12 促進軟骨細胞發(fā)生凋亡。 根據(jù)以上結果， 軟骨細胞中ERS 介導的細胞凋亡參與OA 的發(fā)病。