胡麗玲,楊曉云,鄭 紡

(天津市人民醫(yī)院 特殊檢查實驗室,天津中醫(yī)藥大學 中西醫(yī)結合學院,天津300121)

感染性疾病(infectious disease)是由病原微生物引起的疾病的統(tǒng)稱,目前仍然是全球公共衛(wèi)生重大威脅,傳統(tǒng)的病原學診斷方法已不能滿足臨床診斷和治療的需要[1]。與傳統(tǒng)病原學診斷方法(培養(yǎng)、質譜法、免疫相關抗原抗體檢測和核酸檢測技術等)比較,宏基因組學的二代測序(mNGS)是一種非靶向廣譜病原學篩查技術,近幾年發(fā)展迅猛已廣泛應用于感染性疾病病原微生物的精準診斷,特別是在危重、疑難、罕見、新發(fā)病原體導致感染的診斷。

1 宏基因組二代測序概況

宏基因組學的臨床應用起源于2000年初微陣列技術的應用。該項技術早期的一些成功應用包括SARS冠狀病毒的發(fā)現(xiàn)、癌癥突變的基因圖譜,以及對人體不同部位微生物組的深入分析[2]。宏基因組二代測序無需預設、無需培養(yǎng)、無偏好性,通過提取臨床樣本中DNA或RNA片段,直接對樣本中所有核酸進行高通量測序、數(shù)據(jù)庫比對和智能化算法分析,能夠快速、準確的判斷致病病原微生物的種類(包括細菌、真菌、病毒、寄生蟲等)。此外,mNGS檢測可以覆蓋全樣本類型包括腦脊液、體液、膿液、拭子、肺泡灌洗液、組織、痰液、血液等,而且可顯著提高低病原含量無菌體液樣本的陽性率。mNGS主要操作流程包括:樣本的采集與處理、提取核酸、文庫構建、上機測序、信息分析、報告解讀;其一次可測得上萬種病原體,可檢測新發(fā)、罕見、跨物種傳播、混合感染病原體以及培養(yǎng)陰性的病原體,尤其適用于疑難、危重、特殊感染性疾病的診斷[2-3]。

2014年,新英格蘭醫(yī)學雜志報道了1例14歲男孩患有聯(lián)合免疫缺陷重癥腦膜腦炎,應用傳統(tǒng)的多項病原檢測技術均未能發(fā)現(xiàn)導致感染的病原體,隨后患兒腦脊液mNGS檢測診斷為鉤端螺旋體感染,開啟了全世界對mNGS的關注[4]。MIAO等[5]對511例臨床樣本研究發(fā)現(xiàn)mNGS對感染性疾病診斷的敏感性高于培養(yǎng)(50.7%vs 35.2%),針對結核分枝桿菌、病毒、厭氧菌、諾卡菌和真菌的檢測優(yōu)勢也非常明顯,而且受先前抗生素暴露的影響較小,是一種很有前途的傳染病檢測技術。多項臨床研究表明mNGS在感染性疾病診斷研究中非常有潛力,如確診博卡病毒[6],鸚鵡衣原體[7]、水痘帶狀皰疹病毒[8]、細小單胞菌[9]、阿米巴腦膜炎[10]、裂頭蚴病感染[11]等。最值得關注的是由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)引起的COVID-19,mNGS 技術能夠檢測到樣本中所有的病毒基因序列,從而識別出新型病毒,還能夠通過比對基因序列找到變異位點,協(xié)助尋找中間宿主及病毒起源[12]。

2 mNGS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病診斷的應用

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病主要包括腦炎、腦膜炎以及脊髓炎等,具有高發(fā)病率和病死率的特點,快速準確的檢出病原菌,給予患者及時有效的診療對改善患者的預后具有重要意義。傳統(tǒng)的診斷流程很大程度上依賴于病原體特異性檢測,有時還需要侵入性外科手術,且需要數(shù)天到數(shù)周的時間。近幾年,應用mNGS輔助診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病越來越受到重視,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的精準治療中發(fā)揮重要作用。

WILSON等[13]進行的大樣本、多中心前瞻性研究,共納入美國8家醫(yī)院204例兒科和成人患者,調查了腦脊液mNGS檢測對感染性腦膜炎和腦炎的診斷價值。該研究發(fā)現(xiàn)13例(22%)僅由mNGS 確診的病例中7例(54%)幫助臨床啟動治療,6例通過mNGS進行了耐藥基因、病毒分型、動態(tài)監(jiān)測、進化分析等深入分析。由mNGS和常規(guī)檢查共同確診的19例,通過mNGS檢測到多種病原體如:圣路易斯腦炎病毒(SLEV)、戊型肝炎病毒、EB病毒、無乳鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌、法氏諾卡氏菌、熱帶假絲酵母菌、克雷伯菌屬產(chǎn)氣桿菌、米特斯鏈球菌、糞腸球菌、牛分枝桿菌、結核分枝桿菌和新型隱球菌等。一項單中心、前瞻性隊列研究表明,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的細菌性感染中無論采用何種抗菌藥物治療mNGS均優(yōu)于培養(yǎng)法和其他常規(guī)方法;接受經(jīng)驗性抗菌藥物治療的患者用常規(guī)方法檢出率顯著降低約20%,而mNGs檢出率不受影響;在培養(yǎng)陰性患者中,mNGS額外檢測出48種細菌和真菌[14]。另有結核性腦膜炎(TBM)患者相關研究發(fā)現(xiàn)腦脊液標本mNGS診斷結核分枝桿菌的敏感性可達84.4%,明顯高于抗酸桿菌(AFB)、BACTECTM MGIT 960培養(yǎng)(MGIT 960)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)和Xpert MTB/RIF檢測的診斷性能,與T-SPOT相比未顯示出明顯優(yōu)勢,但兩者結合在一起可彌補臨床常規(guī)檢測的不足,最大化提升腦脊液結核桿菌的檢出率[15-16]。PIANTADOSI等[17]對中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者進行腦脊液RNA和DNA的mNGS分析,檢測到蜱傳播的病原體波瓦桑病毒、伯氏疏螺旋體和嗜吞噬細胞無形體,還發(fā)現(xiàn)了地理相關的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病,如新英格蘭的蜱媒感染。

3 mNGS在呼吸系統(tǒng)感染性疾病中病原學診斷的應用

3.1 肺部感染病原體的診斷

呼吸系統(tǒng)感染是造成全球死亡人數(shù)最多的一類感染,下呼吸道感染(LRTIs)發(fā)病率和病死率在成人和兒童中位居第4位,2019年死亡人數(shù)達260萬[18]。近年來分子生物學方法在感染性疾病病原檢測中表現(xiàn)突出,如DNA限制性內切酶分析技術、核酸探針雜交技術、聚合酶鏈反應(PCR)技術和環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術等,但仍有50%左右的呼吸系統(tǒng)感染無法明確病原體[19]。mNGS 可大大提高呼吸系統(tǒng)感染病原體診斷效率,也是mNGS應用最廣泛的領域。借助mNGS檢測可以獲得肺部病原體微生物組的概況,其在病原體檢測中提供了足夠的準確性和更高的靈敏度,能夠輔助重癥肺炎診斷,尤其是應用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法難以觀察的病原體[20]。

QIAN等[21]對100例肺部感染患者的呼吸道樣本進行了常規(guī)方法和mNGS檢測,該研究顯示mNGS對病原菌和真菌的檢測靈敏度高于傳統(tǒng)培養(yǎng)(95%vs54%,P<0.001);mNGS診斷病毒感染的敏感性低于PCR,但它發(fā)現(xiàn)了14種常規(guī)方法無法檢測到的病毒,包括多種亞型的人類皰疹病毒;mNGS檢測對病毒基因組覆蓋率>95%,為流行病學研究提供了可靠的信息。該研究建議當臨床懷疑存在混合或罕見病原體感染時,尤其是在免疫功能低下和(或)需要緊急治療的病情危重的患者,應及時使用mNGS。CHEN等[22]對235例疑似肺部感染患者采集支氣管肺泡灌洗液(BALF)標本,應用mNGS和微生物培養(yǎng)技術評價其對肺部感染的診斷價值。該研究表明BAL標本的mNGS檢測可為肺部感染性疾病提供更準確的診斷信息,mNGS在描述多微生物生態(tài)系統(tǒng)、展示不同基礎疾病患者呼吸道微生物分布和優(yōu)勢菌株方面比微生物培養(yǎng)更有優(yōu)勢。BAL的mNGS對肺部感染病原體的診斷敏感性為88.89%,特異性為14.86%,陽性預測值(PPV)為21.16%,陰性預測值(NPV)為83.87%。單純肺部感染患者和免疫功能低下患者中感染類型以細菌感染(58.33%)和混合感染(43.18%)為主。LIU等[23]研究還發(fā)現(xiàn)mNGS對經(jīng)支氣管鏡肺活檢(TBLB)標本病原微生物測序的敏感性優(yōu)于肺泡灌洗液,而與肺泡灌洗液相比其特異性降低;mNGS對肺組織中病原菌的檢測尤其是肺部難治性感染性疾病具有較高診斷價值,包括巨細胞病毒肺炎、吉氏肺囊蟲肺炎(PCP)、肺曲霉病和肺結核;此外,mNGS還協(xié)助診斷非感染性肺部并發(fā)癥如移植物抗宿主病(GVHD)、特發(fā)性肺炎綜合征(IPS)和遲發(fā)性肺毒性綜合征(DPTS)。CHEN等[24]研究還在1名27歲的男性患者會厭組織和氣管肺泡灌洗液(BALF) 通過mNGS檢測發(fā)現(xiàn)了組織胞漿菌,而會厭組織和肺病理均未見陽性結果。

3.2 協(xié)助診斷社區(qū)獲得性肺炎

社區(qū)獲得性肺炎(CAP)是威脅嬰幼兒及老年人群健康的常見感染性疾病,mNGS還可以協(xié)助診斷免疫缺陷患者社區(qū)獲得性肺炎[25-26]。有研究應用mNGS對121例社區(qū)獲得性肺炎患兒的支氣管肺泡灌洗液標本進行病原體檢測,mNGS的診斷性能陽性符合率為86.78%(105/121),高于常規(guī)方法(培養(yǎng)和靶向聚合酶鏈反應試驗)陽性符合率為66.94%(81/121)的診斷性能;使用mNGS 與常規(guī)方法聯(lián)合檢測診斷的患者比例增加到99.18%;其中僅mNGS確診的患者占17.36%;肺炎鏈球菌占52.38%,合并感染占23.8%;此外,僅用mNGS檢測到百日咳博德氏菌和人博卡病毒(HBoV)[27]。

3.3 病毒及厭氧菌的診斷

RNA病毒在呼吸系統(tǒng)感染性疾病中占有重要地位,在檢測呼吸道RNA病毒方面mNGS也優(yōu)于RT-PCR和多重PCR,對于不排除病毒感染的患者進行mNGS檢測時,可同時進行DNA及RNA檢測。有研究應用RNA mNGS評估SARS-CoV-2 RT- PCR陰性中的替代病毒感染頻率和SARS-CoV-2 RT-PCR陽性中的病毒復合感染頻率,mNGS鑒定了常規(guī)臨床檢查檢測到的所有病毒(甲型流感病毒、人偏肺病毒、人冠狀病毒OC43、人冠病毒HKU1);mNGS還發(fā)現(xiàn)了常規(guī)臨床檢查未檢測到的吸道合胞病毒(RSV)、人類偏肺病毒(hMPV)、人類冠狀病毒NL63等[28]。mNGS檢測與qRT-PCR能夠優(yōu)勢互補,可最大化的實現(xiàn)各自的臨床診斷價值。張文宏團隊首次結合qRT-PCR、CRISPR和mNGS對首個COVID-19輸入性病例進行了快速診斷[29]。此外,mNGS技術對呼吸系統(tǒng)厭氧菌感染的精準化診斷方面具有優(yōu)勢,厭氧菌感染的病原體檢出的陽性率為71.43%(10/14)顯著高于培養(yǎng)的陽性率7.14%(1/14)(P<0.01)[30]。

呼吸系統(tǒng)與外界相通,正常菌群微生物組成復雜,大量條件致病菌與感染菌的鑒別困難。不同呼吸系統(tǒng)感染類型優(yōu)選標本類型也不同,不同的標本類型檢測結果判讀標準不盡相同,為進一步保障mNGS結果準確性,國內已發(fā)表多個專家共識[31-33]。

4 mNGS在血液系統(tǒng)感染性疾病病原學診斷中的應用

血流感染病原體隨著血流播散至全身各組織器官,除了能夠對組織器官造成直接損傷外,還能夠引起內分泌、代謝、凝血、免疫炎癥反應的異常,最終導致膿毒癥、感染性休克及多器官功能障礙[2]。血流感染控制不佳導致的膿毒癥甚至感染性休克,是危重患者死亡的重要原因。全球每年報告的膿毒癥發(fā)病人數(shù)為1940萬,與膿毒癥相關的死亡人數(shù)為530萬[34]。血流感染診斷的“金標準”是血培養(yǎng)(Blood Culture),然而傳統(tǒng)血培養(yǎng)的陽性率低于20%,至少需要3～5天,對于特定的細菌培養(yǎng)物、結核分枝桿菌和真菌則需要更長的培養(yǎng)時間;對諾卡氏菌、隱球菌、布魯氏菌陽性率較低,病毒無法培養(yǎng)[35]。

有研究顯示在血流感染發(fā)作前幾天,mNGS通過血液中游離細胞DNA(mcfDNA)序列可以識別出與臨床相關的病原體,從而可能實現(xiàn)提前干預治療。mcfDNA-seq對所有血流感染的預測敏感性為75%(95%可信區(qū)間為51%～90%),對細菌性BSI的敏感性為80%(95%置信區(qū)間為55%～93%)[36]。GRUMAZ等[37]從48名膿毒癥患者的256份連續(xù)7個時間點的血漿樣本中,分離出mcfDNA,在整個研究期間血培養(yǎng)陽性率僅為11%,而mNGS陽性率為71%;急性膿毒癥患者中mNGS陽性率為96%,根據(jù)專家評估其中53%的病例更換或給予更充分的治療。斯坦福大學急診醫(yī)學中心對納入的350例膿毒癥患者比較了mNGS與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法在膿毒癥患者中的診斷價值,結果顯示mNGS診斷膿毒癥病原體的敏感性92.9%,特異性62.7%;其陽性率顯著高于傳統(tǒng)培養(yǎng)陽性率(48.6%vs18.1%),mNGS平均檢測時間為29小時[38]。另有研究納入124例ICU重癥膿毒癥患者,不僅發(fā)現(xiàn)mNGS檢測病原體陽性率明顯高于傳統(tǒng)血培養(yǎng),還發(fā)現(xiàn)1例肺孢子蟲、1例結核病原體及罕見的吉羅維肺孢子蟲[39]。國內林威等[40]研究報道應用mNGS檢測協(xié)助診斷3例無焦痂兒童恙蟲病,而傳統(tǒng)檢測方法未能確診病原。血液mcfDNA mNGS檢測不僅可用于診斷血流感染,還可用于診斷深部感染或難以取樣的部位感染 (如侵襲性真菌感染、 肺炎或骨髓炎)[41]。

5 mNGS在其他感染性疾病中病原學診斷的應用

mNGS技術在其他系統(tǒng)感染性疾病的診療中也有較高的診斷價值。殷楚強等[42]研究表明mNGS對疑似脊柱感染患者的診斷與臨床最終診斷一致性較好,mNGS檢測發(fā)現(xiàn)常見化膿性脊柱炎的病原微生物為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、鏈球菌;其他常見感染類型為脊柱結核、布魯桿菌脊柱炎,還發(fā)現(xiàn)了脆弱擬桿菌、微小微單胞菌、齒垢密螺旋體、貝納柯克斯體等少見病原微生物。LI等[43]研究證實應用mNGS從福爾馬林固定角膜標本中可檢測出大多數(shù)感染性角膜炎患者的真菌、細菌和阿米巴病原體,還發(fā)現(xiàn)了其他潛在病原體如巨細胞病毒。mNGS在消化系統(tǒng)感染中的應用也有研究,例如1例發(fā)熱和腹痛的患者應用mNGS能夠快速診斷馬爾尼菲籃狀菌感染[44]。此外,mNGS是免疫缺陷患者中如腫瘤、器官移植患者病原學診斷的很好的補充,尤其適用于器官移植后、免疫缺陷和長期使用免疫抑制劑患者的嚴重感染。如快速精準診斷免疫缺陷病人卡氏肺孢子蟲感染[45]。

6 總結

綜上,mNGS技術是傳統(tǒng)病原學檢測方法的補充和延伸,能夠快速、客觀檢測出臨床樣本中的多種病原微生物,在感染性疾病精準診斷中顯示出巨大臨床應用價值。盡管有越來越多的關于mNGS成功的報道,但短期內仍無法完全取代傳統(tǒng)病原學診斷方法,有一些技術瓶頸需要解決,如mNGS檢測的大量序列屬于宿主,可能導致病原體序列比例低,影響病原體檢測的敏感性。從呼吸道、口腔和生殖道采集的標本中,很難區(qū)分正常定植菌和致病菌。病原體基因數(shù)據(jù)庫制備缺乏統(tǒng)一、全面、準確的參照數(shù)據(jù)庫;對細胞內細菌和厚壁微生物的檢出率較低。由于基因型與表型不一致,點突變導致的耐藥、毒力變化難以檢測,暫時無法滿足病原體耐藥及毒力分析。對于感染性疾病患者病原體的判定需要依賴于報告解讀者對于mNGS檢測、醫(yī)學微生物、感染病學知識有所積累的經(jīng)驗,臨床醫(yī)師對待mNGS檢測結果應結合臨床實踐綜合判斷。隨著測序技術的改進以及更多的實踐經(jīng)驗和評估,未來mNGS將朝著臨床應用規(guī)范化、規(guī)?；⒕毣?、自動化方向發(fā)展,助力感染性疾病精準診斷。