陳 夢(mèng) 楊夢(mèng)靈 董亞蘭 胡德勝

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科,武漢 430022

缺血性心臟病已成為世界范圍內(nèi)最常見的死因之一,其主要治療方法是通過再灌注恢復(fù)缺血心肌血運(yùn),從而改善缺血性心臟病的預(yù)后。然而再灌注會(huì)造成心肌額外損傷,稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)[1]。它發(fā)生的病理機(jī)制主要與線粒體損傷、鈣超載、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等相關(guān)[2]。目前有關(guān)MIRI治療的研究仍是熱點(diǎn)。

核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)是內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵因子,可激活下游多種抗氧化酶,如醌氧化還原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1]、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)等,并通過多種途徑協(xié)同清除再灌注時(shí)心肌組織產(chǎn)生的大量超氧陰離子、過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)等活性氧(reactive oxygen species,ROS)成分而減輕缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷[3]。

清心通絡(luò)方由黃芩、黃連、黃芩、姜黃、丹參、川芎組成,以清熱解毒、活血化瘀為治則。中醫(yī)認(rèn)為“瘀毒”是冠心病的重要病因病機(jī),在冠心病發(fā)病過程中,“瘀”為常,“毒”為變,因瘀致毒,瘀毒互結(jié),從而導(dǎo)致惡性心血管事件的發(fā)生,因此解毒活血是冠心病瘀毒證的主要治法[4]。I/R損傷時(shí)心肌局部產(chǎn)生大量ROS、炎癥因子,以及內(nèi)皮功能障礙的病理表現(xiàn)與“瘀”“毒”相關(guān)?；诖?本研究探討清心通絡(luò)方改善小鼠MIRI的機(jī)制,以期為中醫(yī)治療I/R損傷提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性C57BL/6J小鼠45只,8周齡,體重22～24 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司湖北分公司,動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(鄂)2022-0030。造模前小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房中,標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),自由進(jìn)食、飲水。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

中藥清心通絡(luò)方:黃芪15 g,黃芩10 g,黃連5 g,丹參15 g,川芎10 g,姜黃10 g。根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》換算成小鼠給藥劑量(黃芪3.7 g,黃芩2.5 g,黃連1.2 g,丹參3.7 g,川芎2.5 g,姜黃2.5 g)。上述中藥飲片均購(gòu)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中藥房。所有藥材加水慢煎,制成生藥濃度為5.4 g·mL-1的液體,置于4℃冰箱冷藏,用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。另外再取1份藥材制成凍干粉用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn),置于-80℃保存,臨用前用DMEM培養(yǎng)基制成1 mg·mL-1的溶液。

1.3 主要試劑

伊文思藍(lán)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(貨號(hào)E2129)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司(貨號(hào)G1017);血清肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme,CK-MB)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)等試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所,貨號(hào)分別為A032-1-1、E006-1-1、A020-2-2、C010-2-1、A001-3-2、A003-1-2;RNA逆轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自武漢擎科生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)TSK301M、TSE201);細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司(貨號(hào)AP104);Bax、Bcl-2抗體購(gòu)自Abmark公司(貨號(hào)TU333334S、TU323153S),PARP-1、α-actin抗體購(gòu)自proteintech公司(貨號(hào)23660-1-AP、66520-1-Ig),HO-1、Nrf2抗體購(gòu)自ABclonal公司(貨號(hào)A1244、A1346)。

1.4 主要儀器

小動(dòng)物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物技術(shù)有限公司,型號(hào)ALC-V8S);體式顯微鏡(日本OLYMPUS,型號(hào)SZX2-ZB10);多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)PerkinElmer,型號(hào)EnSpire);離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf,型號(hào)Centrifuge 5424R);勻漿機(jī)(武漢賽維爾生物科技有限公司,型號(hào)KZ-Ⅱ);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)BIO-RAD,型號(hào)CFX ConnectTM);電泳儀(美國(guó)BIO-RAD,型號(hào)PowerPacTMBasic);凝膠成像儀(美國(guó)賽默飛,型號(hào)iBright750)

1.5 動(dòng)物分組和給藥

將45只雄性小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和中藥組,每組15只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,中藥組給予1.08 g·kg-1·d-1的清心通絡(luò)方灌胃,假手術(shù)組和模型組則予等體積生理鹽水(0.2 mL·d-1)灌胃,每日固定給藥1次。給藥14 d后造模。中藥劑量根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》進(jìn)行換算。

1.6 小鼠心肌I/R模型的建立

參照常規(guī)方法:結(jié)扎小鼠左側(cè)冠狀動(dòng)脈左前降支造成左心室缺血,以心電圖出現(xiàn)ST段和(或)T波抬高或降低等心肌缺血波形為結(jié)扎成功的標(biāo)準(zhǔn),顯微鏡下見心肌組織泛白,30 min后松開結(jié)扎線恢復(fù)冠脈血液。

1.7 小鼠血清及心臟組織樣本提取

運(yùn)用眼眶采血及摘除眼球的方法分別獲得I/R 6 h和I/R 1 d的血液樣本,于4℃、3500 rpm離心10 min后獲取血清,并再次4℃、12000 rpm離心10 min后取上清,置于-80℃凍存,等待檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。采取頸椎脫臼法處死小鼠,取左心室心肌組織進(jìn)行勻漿后分別提取RNA及蛋白用于qPCR及WB檢測(cè)。

1.8 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.8.1 小鼠一般情況評(píng)估 觀察各組小鼠一般情況,包括精神、活動(dòng)、飲食、皮毛光澤度、大小便等,稱重記錄造模前后各組小鼠體重變化。

1.8.2 心肌梗死面積的測(cè)定 I/R 3 d后在原位重新結(jié)扎冠脈左前降支,經(jīng)股靜脈注入3%伊文思藍(lán)染料,待小鼠口唇變藍(lán)后取出心臟,用最佳切削溫度(optimal cutting temperature,OCT)化合物包埋固定后沿心臟水平面自心底向心尖平均切成薄片,隨后置于1% TTC中37 ℃避光孵育30 min,用4%多聚甲醛溶液固定24 h后拍照。正常心肌呈藍(lán)色,缺血心肌呈紅色,梗死心肌呈白色。心梗面積百分比=[各切片白色梗死區(qū)域之和/(各切片白色梗死區(qū)域之和+各切片紅色缺血區(qū)域之和)]×100%。

1.8.3 血清CK、CK-MB、LDH、AST水平測(cè)定 取各組小鼠I/R 6 h后的血清,按照檢測(cè)試劑盒操作說明測(cè)定CK、CK-MB、LDH、AST的水平。

1.8.4 血清MDA含量及SOD水平測(cè)定 取各組小鼠I/R 1 d后的血清,按照檢測(cè)試劑盒操作說明進(jìn)行測(cè)定。

1.8.5 qPCR檢測(cè)心肌組織IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA相對(duì)水平 取I/R 1 d的小鼠左室區(qū)域心肌組織,勻漿后提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qPCR,檢測(cè)IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.8.6 WB檢測(cè)心肌組織Bax、Bcl-2、PARP-1、HO-1、Nrf2的蛋白表達(dá)水平 分別取I/R 1 d和I/R 3 d的小鼠左室區(qū)域心肌組織,勻漿后提取總蛋白,用BCA法測(cè)定總蛋白濃度,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,確定上樣量。電泳及轉(zhuǎn)膜完成后,用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,用抗體稀釋液按1∶1000稀釋一抗Bax、Bcl-2、PARP-1、HO-1、Nrf2、α-actin后于4℃搖床孵育過夜;按1∶3000稀釋二抗,于37 ℃孵育2 h。用ECL發(fā)光液及顯影液處理膜后曝光獲得WB圖片。

1.8.7 HL-1細(xì)胞凋亡檢測(cè) 分為正常組、模型組、低濃度(0.1 mg·mL-1)中藥組和高濃度(0.25 mg·mL-1)中藥組,中藥組先予以不同濃度中藥預(yù)處理HL-1細(xì)胞24 h,模型組、低濃度中藥組和高濃度中藥組用200μM H2O2處理6 h,最后按細(xì)胞凋亡試劑盒的操作說明檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 清心通絡(luò)方對(duì)小鼠體重的影響

給藥周期內(nèi)各組小鼠一般情況可,體重均有所增長(zhǎng)。給藥結(jié)束后,與假手術(shù)組和模型組相比,中藥組小鼠體重變化差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠體重變化

2.2 清心通絡(luò)方對(duì)小鼠心梗面積的影響

模型組及中藥組小鼠心臟切片雙染后均可見白色梗死區(qū)域和紅色缺血區(qū)域,每組取1只小鼠心臟不同水平切面展示,從心尖部位至心室部位共選4個(gè)切面,見圖1。

Ⅰ:模型組;Ⅱ:中藥組。

與模型組比較,中藥組小鼠心梗面積顯著減少(P<0.01),見表2。

表2 MIRI小鼠心梗面積比較

2.3 清心通絡(luò)方對(duì)小鼠血清CK、CK-MB、LDH、AST的影響

與假手術(shù)組相比,模型組小鼠血清CK、CK-MB、LDH、AST水平顯著增加(P均<0.01);與模型組相比,中藥組小鼠血清CK、LDH、AST水平均下降(P<0.01或P<0.05),CK-MB水平下降但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組小鼠血清CK、CK-MB、LDH、AST水平變化

2.4 清心通絡(luò)方對(duì)小鼠心肌炎癥因子mRNA水平的影響

與假手術(shù)組相比,模型組小鼠心肌組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平明顯升高(P均<0.01);與模型組相比,中藥組小鼠心肌組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA水平明顯降低(P均<0.01)。見表4。

表4 各組小鼠心肌IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA相對(duì)含量變化

2.5 清心通絡(luò)方對(duì)小鼠血清SOD、MDA的影響

與假手術(shù)組相比,模型組小鼠血清SOD水平降低(P<0.05),MDA含量升高(P<0.01);與模型組相比,中藥組小鼠血清MDA含量明顯下降(P<0.01),SOD水平顯著升高(P<0.01)。見表5。

表5 各組小鼠血清中SOD、MDA水平變化

2.6 清心通絡(luò)方對(duì)小鼠心肌PARP-1、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平的影響

與假手術(shù)組相比,模型組小鼠心肌組織中PARP-1、Bax蛋白表達(dá)量升高(P均<0.01),Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量下降(P均<0.01);與模型組相比,中藥組小鼠心肌組織中PARP-1、Bax蛋白表達(dá)量明顯下降(P均<0.01),Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)升高(P均<0.05)。見圖2及表6。

A:假手術(shù)組;B:模型組;C:中藥組。

表6 各組小鼠心肌織中PARP-1、Bax、Bcl-2、Nrf2、HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)

2.7 清心通絡(luò)方對(duì)H2O2 處理后HL-1細(xì)胞凋亡的影響

與正常組相比,H2O2處理后模型組HL-1細(xì)胞凋亡明顯增加(P<0.01),中藥組HL-1細(xì)胞凋亡減少(P<0.01),但低劑量中藥組與高劑量中藥組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表7。

表7 各組HL-1細(xì)胞凋亡結(jié)果比較

3 討論

MIRI可歸于中醫(yī)學(xué)“胸痹”“真心痛”等范疇。心主血脈,其五行屬火,故火熱之邪最易入心,如《圣濟(jì)總錄》云:“大抵心屬火而惡熱,其受病則易以生熱”。火為熱之極,毒為火之聚,內(nèi)生火熱毒邪煎灼脈道,傷其形,敗其血,遂致血脈失和,變證叢生[5]。正如《素問·刺熱篇》言:“心熱病者,先不樂,數(shù)日乃熱,熱爭(zhēng)則卒心痛”。且“瘀毒”與血管內(nèi)皮損傷、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激相關(guān)[6]。針對(duì)“瘀毒”,清熱解毒可降低“熱毒負(fù)荷”,而活血可擴(kuò)張冠脈、抗血小板黏附、改善微循環(huán)[7-8]。清心通絡(luò)方由黃芪、丹參、川芎、姜黃、黃芩、黃連組成,其中丹參活血祛瘀、清心除煩,川芎活血行氣、姜黃破血行氣、黃芪補(bǔ)氣行血,三者加強(qiáng)丹參之活血祛瘀;黃連、黃芩性味苦寒,能清熱解毒;全方共奏清熱解毒、活血化瘀之效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,川芎能鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、抗凝血、抗腫瘤、改善心功能等[9]。川芎提取物在鹽酸異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌缺血損傷模型和大鼠心肌I/R損傷模型中均能增加血清SOD的含量、減少M(fèi)DA含量,通過抗氧化改善缺血心肌損傷[10-11]。姜黃能抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、抗纖維化及保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等[12]。其有效成分姜黃素可通過抑制氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)、抑制凋亡等途徑減輕MIRI[13]。丹參活性成分能多方面抗MIRI,包括清除氧自自由基、抑制心肌細(xì)胞鈣超載、改善能量代謝、抑制炎癥反應(yīng)、抗血小板聚集、調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能及促進(jìn)微血管再生等[14]。丹參及其配伍制劑均能治療冠心病,保護(hù)心臟[15]。此外,臨床研究發(fā)現(xiàn)丹參川芎嗪在室間隔缺損修補(bǔ)術(shù)中應(yīng)用于體外循環(huán)時(shí),可明顯降低MDA、升高SOD,從而發(fā)揮保護(hù)心肌和抗心律失常的作用[16]。黃芪具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗纖維化、促進(jìn)血管生成等作用,能有效減輕缺血再灌注損傷[17];其活性成分黃芪甲苷和丹參有效成分——丹參素聯(lián)用能在大鼠心肌缺血晚期發(fā)揮保護(hù)心肌及改善心功能的作用,可能與調(diào)控缺血心肌糖脂代謝、抗炎、抗心肌纖維化等作用有關(guān)[18]。黃芩的藥理作用主要包括抗炎、抗氧化、抗免疫等[19];研究發(fā)現(xiàn)其有效成分黃芩苷通過MAPK/Nrf-2/HO-1/NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)心臟氧化應(yīng)激與炎癥,從而減輕大鼠MIRI[20]。黃連最主要的有效成分小檗堿在心血管系統(tǒng)中具有抗心律失常、抗心力衰竭、抗血小板聚集、抗高血壓等藥理作用[21];它可通過降低MIRI時(shí)的心肌過氧化抑制心肌細(xì)胞凋亡[22]。本研究結(jié)果與前述研究相似,方中諸藥配伍,能改善MIRI,并通過增強(qiáng)抗炎、抗氧化的作用保護(hù)心肌。

再灌注治療仍是目前急性心梗的主要治療方案,而有效減輕MIRI能進(jìn)一步改善缺血性心臟病的最終預(yù)后。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)均是導(dǎo)致MIRI的重要機(jī)制。目前有關(guān)MIRI氧化應(yīng)激的機(jī)制研究主要涉及Nrf2/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)、PI3K/Akt-eNOS和線粒體參與[23]。其中Nrf2/ARE信號(hào)通路功能強(qiáng)大,它龐大的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)是Nrf2能夠多方面維持內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定的基礎(chǔ)。Nrf2具有氧化還原、促進(jìn)代謝和維持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)及緩解炎癥的生理作用,它的激活劑已在許多人類疾病模型中顯示出保護(hù)作用,被認(rèn)為是一種藥物靶點(diǎn)[24]。在非應(yīng)激狀態(tài)下,E3泛素連接酶通過kelch樣ECH相關(guān)蛋白1(kelch like ECH associated protein 1,Keap1)靶向Nrf2使其降解;而在應(yīng)激狀態(tài)下,多種蛋白通過Keap1激活Nrf2使其入核與ARE結(jié)合,激活下游抗氧化基因如HMOX1、GPX2、NQO1的轉(zhuǎn)錄,抑制IL-1β、IL-6等促炎基因的表達(dá),從而發(fā)揮Nrf2抗氧化、抗炎等多種生物功能[25]。Hao T等基于MIRI時(shí)ROS與NO失衡的病理改變合成具有逆轉(zhuǎn)ROS/NO失衡功效的藥物CS-B-NO,該藥物發(fā)揮抗MIRI作用的主要機(jī)制是激活Nrf2/Keap1信號(hào)通路,增加SOD、HO-1、NQO1等抗氧化酶的含量,在抗氧化應(yīng)激的同時(shí)抑制NF-κB信號(hào)通路減輕炎癥反應(yīng)[26]。

本研究結(jié)果顯示,清心通絡(luò)方能有效減少心肌細(xì)胞凋亡及心梗面積,提高小鼠血清抗氧化酶SOD活性、降低MDA含量,并提高Nrf2及HO-1的蛋白表達(dá),提示其對(duì)MIRI小鼠具有顯著的抗氧化損傷作用。同時(shí),用藥后心肌損傷炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的mRNA水平明顯下降,表明其具有抗炎功效。綜上所述,清心通絡(luò)方能夠改善小鼠MIRI,其機(jī)制可能是通過激活Nrf2/HO-1通路、抗氧化應(yīng)激、抗心肌細(xì)胞凋亡等途徑發(fā)揮藥理作用。