田 禹, 楊 文, 楊 程, 劉雁萍, 王仲怡,張小蘭, 顧力行, 周 俊, 周經(jīng)姣

(武漢科技大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院,武漢 430065)

據(jù)WHO國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)發(fā)布的全球最新癌癥數(shù)據(jù)顯示,2020年全球肺癌發(fā)病人數(shù)220.6萬(wàn)例,占全部癌癥新增病例的11.4%;死亡人數(shù)高達(dá)179.6萬(wàn)例,占比18.0%[1-2].由于具有“高復(fù)發(fā)”和“易轉(zhuǎn)移”的特點(diǎn),中國(guó)肺癌患者五年生存率僅為19.8%.在進(jìn)行手術(shù)切除后,40%診斷為早期的患者以及超過(guò)50%診斷為中晚期的患者在術(shù)后五年內(nèi)經(jīng)歷了復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[3].

肺癌尤其是小細(xì)胞肺癌 (small cell lung cancer,SCLC)和分化差的非小細(xì)胞肺癌 (non-small cell lung cancer,NSCLC),是常見(jiàn)的發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤之一.肺癌骨轉(zhuǎn)移好發(fā)部位在胸部、脊柱、骨盆、肢體、顱骨等,轉(zhuǎn)移前期癥狀不明顯,但發(fā)展迅速[4].骨轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)生溶骨性骨質(zhì)破壞,會(huì)引發(fā)劇烈疼痛.重度疼痛是肺癌骨轉(zhuǎn)移后常見(jiàn)的臨床表現(xiàn),可加重患者病情,降低生活質(zhì)量,晚期肺癌骨轉(zhuǎn)移疼痛控制問(wèn)題一直是惡性腫瘤防治的難點(diǎn)[5].

肺癌的骨轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不明確,相關(guān)的動(dòng)物模型建立困難、敏感性低.生物發(fā)光活體成像可以多時(shí)間點(diǎn)、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)到體積為0.5 mm3的微小腫瘤轉(zhuǎn)移灶[6].結(jié)合生物發(fā)光活體成像技術(shù)建立肺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型是研究肺癌骨轉(zhuǎn)移的重要工具,有助于深入研究肺癌骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制以及探索高效的治療藥物和預(yù)后評(píng)價(jià)策略.

本研究應(yīng)用Luciferase和GFP雙標(biāo)記肺腺上皮癌細(xì)胞A549,在BALB/c nu/nu小鼠體內(nèi)建立肺癌骨轉(zhuǎn)移模型.應(yīng)用小鼠成像技術(shù)、組織切片和HE染色等分析顯示,該小鼠肺癌骨轉(zhuǎn)移模型的生物學(xué)特性,與人體肺癌骨轉(zhuǎn)移具有高度相似性.成功構(gòu)建的肺癌骨轉(zhuǎn)移模型有利于癌癥骨轉(zhuǎn)移的分子病理機(jī)制研究,特別是癌細(xì)胞在骨中停滯、存活、增殖以及癌癥骨病的相關(guān)研究,可用于篩選和評(píng)價(jià)高效的癌癥治療藥物.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和細(xì)胞株 293T細(xì)胞和A549細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù),由本實(shí)驗(yàn)室保存及培養(yǎng).DH-5a感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自Tiangen公司.

1.1.2 主要試劑 胰酶消化液 (Biosharp, BL501A)、RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma, R8758)、DMEM高糖培養(yǎng)基 (Procell, PM150210)、嘌呤霉素(Aladdin, P113126),PEI 40K(Yeasen, 40816ES02),Polybrene (Solarbio, H8761),異氟烷(RWD, R510-22-10),D-Luciferin potassium(Ark, L120798),Trizol(Absin, abs9331)、Reverse transcription Kit (Abclonal, RK20403)、Quantity PCR mix (Abclonal, RK21203).

1.1.3 主要儀器 恒溫?fù)u床(上海一恒),CO2培養(yǎng)箱(Biobase), 高速離心機(jī)(Beckman),Nanodrop (Thermo Scientific),倒置熒光顯微鏡(Olympus),Spectral instruments imaging(LLC),VonFrey纖維絲測(cè)痛儀(Stoelting),熒光定量PCR儀(Bio-Rad).

1.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6 w齡左右BALB/c nu/nu小鼠購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技公司,每組16只飼養(yǎng)于武漢科技大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房,飼養(yǎng)條件:溫度18～22 ℃,濕度50%～60%,12 h晝夜更替.所有動(dòng)物相關(guān)操作均按照武漢科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定執(zhí)行(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理批準(zhǔn)號(hào)#202047).

1.2 方法

1.2.1 A549-Luc-GFP-Puro穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建 胰酶消化293T細(xì)胞傳入10 cm培養(yǎng)皿中.第2天細(xì)胞在培養(yǎng)皿中密度達(dá)到70%～80%時(shí),采用脂質(zhì)體PEI 40K轉(zhuǎn)染法將VSV-G質(zhì)粒、Gag/pol/rev慢病毒包裝質(zhì)粒和Luc-GFP-Puro質(zhì)粒15 μg共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞.轉(zhuǎn)染48～72 h后,將含有病毒液的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15 mL離心管中,4 ℃,4 000 r·min-1,離心30 min去除細(xì)胞碎片,收集病毒上清.將病毒上清用0.22 μm濾器過(guò)濾至高速離心管中,4 ℃,30 000×g,離心2.5 h濃縮獲得Luc-GFP-Puro慢病毒.

A549細(xì)胞接種于6孔板,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜.第2天細(xì)胞融合度為70%～80%時(shí)感染Luc-GFP-Puro慢病毒.病毒感染48 h后,熒光倒置顯微鏡下可見(jiàn)部分A549細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白GFP.病毒感染后48～72 h開(kāi)始puromycin篩選,向新鮮培養(yǎng)基中添加puromycin,終濃度為2 μg·mL-1.藥篩會(huì)殺死沒(méi)有感染Luc-GFP-Puro慢病毒的A549細(xì)胞,2～3天換液一次,并添加相應(yīng)濃度的puromycin.藥篩持續(xù)1周左右,篩選出穩(wěn)定表達(dá)Luciferase和GFP的雙標(biāo)A549細(xì)胞(A549-Luc-GFP-Puro細(xì)胞).

1.2.2 肺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠模型的構(gòu)建 在A549-Luc-GFP-Puro細(xì)胞融合度在80%～90%時(shí)消化細(xì)胞,將細(xì)胞吹打成均勻的細(xì)胞懸液,立即轉(zhuǎn)移到15 mL離心管,300×g離心5 min.棄上清液加入1 mL預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞,血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù).稀釋A549-Luc-GFP-Puro細(xì)胞至每毫升1×107個(gè).

選擇6～8 w齡的雌性 BALB/c nu/nu小鼠,實(shí)驗(yàn)前將小鼠進(jìn)行麻醉,麻醉維持時(shí)間約為30～35 min.小鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)之后,擦拭消毒并用食指和拇指輕輕地抓住外踝、內(nèi)踝和脛骨下半部分,然后曲腿90°.用70%的酒精濕潤(rùn)皮膚,增加脛骨韌帶下方的可見(jiàn)度,脛骨韌帶可見(jiàn)一條明顯的、粗的白線.在抓緊小鼠腿的同時(shí),將針插入脛骨下方,穿過(guò)韌帶中部,進(jìn)入脛骨頂部髁間前區(qū).將A549-Luc-GFP-Puro細(xì)胞80 μL接種于 BALB/Cnu/nu小鼠的左后肢脛骨.對(duì)照組注射PBS 80 μL.

1.2.3 肺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠模型的生物發(fā)光成像和X-ray成像 小鼠腹腔注射D-luciferin底物,小鼠吸入異氟烷進(jìn)行麻醉.將麻醉后的小鼠放入spectral instruments imaging成像儀,進(jìn)行活體生物成像.每間隔7天對(duì)小鼠進(jìn)行成像,對(duì)腫瘤細(xì)胞在小鼠脛骨內(nèi)的生長(zhǎng)以及對(duì)脛骨的破壞情況進(jìn)行監(jiān)測(cè).同時(shí)進(jìn)行X-ray拍照,觀測(cè)小鼠骨關(guān)節(jié)滑膜、軟骨、骨贅大小以及生長(zhǎng)板厚度.

1.2.4 肺癌骨轉(zhuǎn)移引起骨疼痛的分析與評(píng)價(jià) 在A549-Luc-GFP-Puro細(xì)胞植入小鼠脛骨腔后第0、7、10、14、17、21、24、28天,測(cè)試小鼠骨持續(xù)疼痛(自發(fā)的防護(hù)和退縮)和機(jī)械性觸誘發(fā)痛(觸診引起的防護(hù)和觸診引起的畏縮):將小鼠放在具有金屬絲網(wǎng)地板的透明塑料觀察箱中,先使其適應(yīng)10 min.1)在2 min的觀察期內(nèi),記錄自發(fā)退縮的次數(shù)和防護(hù)的時(shí)間(代表傷害感受行為);2)用Von Frey纖維絲測(cè)痛儀垂直刺激小鼠左后肢的足底中部,使之稍成S形,持續(xù)時(shí)間不超過(guò)4 s,出現(xiàn)抬足或舔足行為視為陽(yáng)性反應(yīng),否則為陰性反應(yīng).刺激力度從1.3 g開(kāi)始,當(dāng)該力度的刺激不能引起陽(yáng)性反應(yīng)時(shí),則給予相鄰大一級(jí)力度的刺激,如出現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)時(shí),則給予相鄰小一級(jí)力度的刺激,如此連續(xù)進(jìn)行,每次間隔15 s.然后應(yīng)用Chaplan等[7]報(bào)道的方法計(jì)算出50%縮足閾值.

1.2.5 骨關(guān)節(jié)組織切片和病理學(xué)分析 A549-Luc-GFP-Puro細(xì)胞植入后第28天取膝關(guān)節(jié)和脛骨組織固定48 h,脫鈣處理、更換脫鈣液數(shù)次,再脫水、透明、浸蠟包埋.骨組織切片、脫蠟、復(fù)水,Harris蘇木精染色10 min;鹽酸酒精分化、水洗待核變藍(lán)后1%伊紅染色3～5 min;各級(jí)酒精脫水、二甲苯透明、樹(shù)膠封固,顯微鏡下觀察膝關(guān)節(jié)和脛骨的形態(tài)、癌組織的分布及浸潤(rùn)情況等.

1.2.6 熒光定量RT-PCR檢測(cè)骨腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因表達(dá) 從脛骨腔取出腫瘤組織,用剪刀剪碎至1 mm3小塊,每個(gè)樣品加入1 mL Trizol溶液.組織研磨后離心收集上清,提取RNA,用Reverse transcription Kit逆轉(zhuǎn)錄出cDNA.熒光定量PCR檢測(cè)骨腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因Mta1、Mta2、Mta3、Lasp1 等的表達(dá)情況.β-actin作為內(nèi)參, 計(jì)算2-ΔΔCt比較基因表達(dá)差異.

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2020、GraphPad Prism 8.0、 Aura Idl進(jìn)行錄入與統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示.采用方差分析,p≤0.05表明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建Luc-GFP-Puro陽(yáng)性的穩(wěn)轉(zhuǎn)A549細(xì)胞系

VSV-G、Gag/pol/rev和Luc-GFP-Puro質(zhì)粒用PEI轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝慢病毒,病毒上清超速離心濃縮,得到高濃度Luc-GFP-Puro病毒(5×107pfu·mL-1).用Luc-GFP-Puro病毒感染A549細(xì)胞后48 h,加入2 μg·mL-1puromycin 進(jìn)行篩選,篩選一周后獲得陽(yáng)性穩(wěn)轉(zhuǎn)A549-Luc-GFP-Puro細(xì)胞(圖1).在熒光倒置顯微鏡450～490 nm藍(lán)光激發(fā)下,檢測(cè)到90%以上的A549細(xì)胞高表達(dá)GFP蛋白發(fā)綠色熒光(圖2).結(jié)果顯示帶有Luc-GFP-Puro的雙標(biāo)記的穩(wěn)轉(zhuǎn)A549細(xì)胞系構(gòu)建成功.

圖1 Luc-GFP-Puro慢病毒包裝和Luc-GFP-Puro雙標(biāo)記A549細(xì)胞篩選示意圖Fig.1 Modeling of Luc-GFP-Puro lentivirus package and screening of A549-Luc-GFP-Puro cells

2.2 肺癌骨轉(zhuǎn)移模型生物發(fā)光成像

在小鼠脛骨注射A549-Luc-GFP-Puro細(xì)胞的過(guò)程中,確保注射器針頭垂直于脛骨平臺(tái)進(jìn)針,使用平穩(wěn)的力量旋轉(zhuǎn)進(jìn)針,避免過(guò)度用力引起小鼠骨組織的損傷(圖3).A549-Luc-GFP-Puro細(xì)胞接種小鼠脛骨后,每周對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)情況進(jìn)行生物發(fā)光成像.首先小鼠腹腔注射D-luciferin(濃度15 mg·mL-1),隨后對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉,將麻醉后的小鼠放入小動(dòng)物成像儀進(jìn)行成像.在A549-Luc-GFP-Puro細(xì)胞接種第7天,檢測(cè)到小鼠膝關(guān)節(jié)和脛骨有明顯的生物發(fā)光信號(hào),而對(duì)側(cè)腿則呈現(xiàn)陰性.隨著時(shí)間的推移,第14、21、28天生物發(fā)光信號(hào)逐漸增強(qiáng),顯示腫瘤細(xì)胞在小鼠的脛骨腔存活并且穩(wěn)定地增殖(圖4a～4d).隨熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng),小鼠開(kāi)始表現(xiàn)出消瘦,體重下降、膚色變暗,出現(xiàn)晚期癌癥患者的惡液質(zhì)現(xiàn)象.

圖3 A549-Luc-GFP-Puro細(xì)胞接種方式和位置(箭頭所示)Fig.3 Injection of A549-Luc-GFP-Puro cells into tibia

圖4 A549-Luc-GFP-Puro細(xì)胞接種小鼠第7、14、21、28天(a～d)活體生物發(fā)光成像Fig.4 In vivo bioluminescence imaging at day 7, 14, 21, 28 (a-d) post A549-Luc-GFP-Puro injection

2.3 肺癌骨轉(zhuǎn)移模型X-ray成像分析

左側(cè)脛骨為腫瘤細(xì)胞接種側(cè),右側(cè)為健康側(cè).X-ray成像顯示,在接種腫瘤細(xì)胞第14天,接種側(cè)脛骨隱約可見(jiàn)骨質(zhì)密度下降;接種第21天,接種側(cè)脛骨骨質(zhì)明顯不均一,且骨邊界模糊不清,脛骨骨質(zhì)破壞嚴(yán)重,骨密度明顯降低,骨膜邊界不清,呈彌散狀,部分骨骼組織消失.在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,小鼠健康側(cè)的膝關(guān)節(jié)和脛骨骨質(zhì)均無(wú)明顯變化(圖5a～5d).

圖5 A549-Luc-GFP-Puro細(xì)胞接種小鼠第7、14、21、28天(a～d)的X-ray成像 Fig. 5 X-ray imaging at day 7, 14, 21, 28 (a-d) post A549-Luc-GFP-Puro injection

2.4 肺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠持續(xù)性疼痛和觸覺(jué)疼痛的評(píng)價(jià)

在2 min的觀察期內(nèi),記錄小鼠自發(fā)退縮和防護(hù)的時(shí)間.PBS對(duì)照組在術(shù)后7天有抬足行為,但10天左右基本消失.A549-Luc-GFP-Puro細(xì)胞接種組,在第10天左右自發(fā)抬足行為明顯,且抬足時(shí)間在觀察期內(nèi)逐漸延長(zhǎng),在14、17、21、24、28天分別為8.7±2.7 s, 15.0±2.8 s, 18.7±5.0 s, 27.3±3.5 s, 38.3±4.3 s.與PBS對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)(圖6a).

a. 小鼠抬足時(shí)間分析; b. 50%疼痛閾值分析圖6 肺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠疼痛分析Fig.6 Evaluation and analysis of bone pain in mice with bone metastasis of lung cancer

PBS對(duì)照組無(wú)明顯觸誘發(fā)痛表現(xiàn),觀察期間各時(shí)間點(diǎn)的50%縮足閾值趨于穩(wěn)定.A549-Luc-GFP-Puro細(xì)胞接種組在第10天左右出現(xiàn)明顯觸誘發(fā)痛,在觀察期間接種組左后腿50%縮足閾值明顯逐漸下降.與PBS對(duì)照組小鼠比較,A549-Luc-GFP-Puro細(xì)胞接種組左后腿50%疼痛閾值具有顯著性差異(p<0.01)(圖6b).

2.5 肺癌骨轉(zhuǎn)移模型病理學(xué)分析

在A549-Luc-GFP-Puro細(xì)胞接種的第21天,觀測(cè)到骨腫瘤已經(jīng)開(kāi)始影響小鼠的行走,注射腫瘤細(xì)胞的左后肢在小鼠行動(dòng)時(shí)出現(xiàn)拖拽的現(xiàn)象.在細(xì)胞接種第28天,對(duì)小鼠進(jìn)行解剖,將膝關(guān)節(jié)和脛骨截取進(jìn)行組織切片進(jìn)行病理學(xué)分析.圖7右側(cè)圖片為沒(méi)有接種腫瘤細(xì)胞的健康膝關(guān)節(jié)和脛骨,圖7左側(cè)為接種腫瘤組的膝關(guān)節(jié)和脛骨.可以觀察到左側(cè)腫瘤組骨髓腔內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活躍,骨髓腔內(nèi)及骨小梁間被大量腫瘤細(xì)胞填充,骨髓腔和骨質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重.健康脛骨骨髓腔內(nèi)見(jiàn)各種正常的骨髓細(xì)胞,骨結(jié)構(gòu)無(wú)異常改變.

a. 對(duì)照組:橢圓標(biāo)示處顯示骨髓腔結(jié)構(gòu)完整,骨小梁數(shù)量較多,骨質(zhì)密集;b. 腫瘤組:橢圓標(biāo)示處顯示骨質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞嚴(yán)重,骨髓腔邊緣骨小梁結(jié)構(gòu)較少,骨質(zhì)疏松,腔內(nèi)骨質(zhì)流失圖7 小鼠膝關(guān)節(jié)和脛骨組織切片HE染色結(jié)果(標(biāo)尺: 100 μm) Fig.7 HE staining of mouse knee and tibia cavity (scale bar: 100 μm)

2.6 檢測(cè)骨腫瘤組織中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)情況

取出脛骨腫瘤組織,提取RNA逆轉(zhuǎn)錄出cDNA,熒光定量PCR檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因Mta1、Mta2、Mta3、Lasp1等.從圖8可以看出,Mta2、Lasf1基因表達(dá)有增高趨勢(shì),但與對(duì)照組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05).Mta3基因特別是Mta1增高顯著,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05).

注:*表示p<0.05,NS表示無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.圖8 骨腫瘤組織中轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的表達(dá)分析 Fig.8 Analysis of the expression of metastasis related genes in bone tumor tissues

3 討論

肺癌潛在骨轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不明確,開(kāi)發(fā)肺癌骨轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型是研究其轉(zhuǎn)移機(jī)制和開(kāi)發(fā)抗腫瘤藥物的重要工具.理想的動(dòng)物模型應(yīng)能模擬疾病發(fā)生的病理生理過(guò)程,具有可重復(fù)性,便于觀測(cè)研究.研究表明,腫瘤細(xì)胞小鼠心內(nèi)注射形成骨轉(zhuǎn)移率低;尾靜脈注射可發(fā)生腫瘤肺轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和骨轉(zhuǎn)移,但形成腫瘤轉(zhuǎn)移灶差異大、可重復(fù)性低.與心內(nèi)注射和靜脈注射方法相比,骨髓腔注射構(gòu)建骨轉(zhuǎn)移模型腫瘤生長(zhǎng)迅速、成瘤率高,且實(shí)驗(yàn)期間不會(huì)發(fā)生其他器臟、組織轉(zhuǎn)移,可重復(fù)性高[8-9].

本研究中采用Luc-GFP-Puro病毒感染A549細(xì)胞,puromycin篩選得到Luc-GFP-Puro陽(yáng)性A549細(xì)胞接種小鼠脛骨,在接種部位可以穩(wěn)定的表達(dá)熒光素酶.接種第7天,腹腔注射底物D-熒光素檢測(cè)到腫瘤信號(hào),可反映腫瘤在小鼠脛骨內(nèi)生長(zhǎng)情況.此活體動(dòng)物模型非常靈敏和高效,在骨腫瘤極早期即可進(jìn)行觀察、量化體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、觀測(cè)抗腫瘤藥物的作用.另外這種生物發(fā)光成像對(duì)機(jī)體無(wú)損傷,可以多時(shí)間點(diǎn)、動(dòng)態(tài)對(duì)活體腫瘤病灶的生長(zhǎng)情況進(jìn)行直觀檢測(cè),并具有極高的檢測(cè)靈敏度、實(shí)驗(yàn)費(fèi)用也大大降低.

石蠟切片和HE染色是小鼠肺癌骨轉(zhuǎn)移的診斷金標(biāo)準(zhǔn).光鏡下可以觀察到肺癌骨轉(zhuǎn)移灶的形態(tài)、分布及浸潤(rùn)情況,常與X-ray等影像學(xué)技術(shù)聯(lián)合使用用于模型的評(píng)價(jià)[10-11].本研究應(yīng)用A549-Luc-GFP-Puro細(xì)胞構(gòu)建的肺癌骨轉(zhuǎn)移模型,接種第21天,接種側(cè)脛骨骨質(zhì)明顯不均一,骨膜邊界不清呈彌散狀,部分骨骼組織消失.A549-Luc-GFP-Puro接種第28天,取膝關(guān)節(jié)和脛骨制備組織切片和HE染色,結(jié)果顯示骨髓腔內(nèi)及骨小梁間被大量腫瘤細(xì)胞填充,骨質(zhì)結(jié)構(gòu)被破壞嚴(yán)重,骨髓腔內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)活躍.這些結(jié)果表明,此模型能模擬腫瘤細(xì)胞在骨組織的增殖及轉(zhuǎn)移過(guò)程,并且具有與肺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生相似的生物學(xué)特性及病理學(xué)表現(xiàn),具有很高的應(yīng)用價(jià)值.

肺癌轉(zhuǎn)移至骨組織后常引發(fā)溶骨性骨破壞,導(dǎo)致頑固性骨痛、病理性骨折甚至癱瘓等并發(fā)癥,嚴(yán)重影響患者的生存及生活質(zhì)量[5,12].本研究應(yīng)用A549-Luc-GFP-Puro細(xì)胞構(gòu)建的骨轉(zhuǎn)移模型,X-ray成像可以觀測(cè)到腫瘤對(duì)膝關(guān)節(jié)和小鼠脛骨組織的損害,接種側(cè)持續(xù)性疼痛指標(biāo),如抬足時(shí)間逐漸延長(zhǎng);50%疼痛閾值下降,持續(xù)性疼痛和觸診疼痛強(qiáng)度與腫瘤骨組織浸潤(rùn)、骨組織損傷程度一致.隨著腫瘤在小鼠脛骨組織中的生長(zhǎng),接種第21天后出現(xiàn)明顯行走異常、腫瘤晚期惡液質(zhì)現(xiàn)象.

取出脛骨腫瘤組織提取RNA,進(jìn)行熒光定量RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Mta1和Mta3腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因高表達(dá),結(jié)果提示脛骨中破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞等微環(huán)境表達(dá)的分子與腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移相關(guān).同時(shí),本模型脛骨組織中大量的腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)胰酶消化法分離出骨組織中的腫瘤原代細(xì)胞,原代細(xì)胞更多保留了體內(nèi)原始骨組織中的生物學(xué)特征,保持其原有的遺傳特征,可更好地反映腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)狀態(tài),從而獲得與體內(nèi)生理功能更接近的數(shù)據(jù),可用于藥物測(cè)試、細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)研究.

此外,此模型可用于研究腫瘤細(xì)胞與骨組織之間的相互作用,也可用于腫瘤細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移后藥物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)及對(duì)骨組織破壞影響的相關(guān)研究,為進(jìn)一步肺癌骨轉(zhuǎn)移的骨應(yīng)力改變及防治的研究奠定重要的基礎(chǔ).