徐雅婷，金孔語恬，沈晨棟，凌宗濤，崔 迎，董華平，壽建昕，朱帥輝，駱 翔*

（1.紹興文理學(xué)院，浙江 紹興 312000；2.浙江華光膠囊股份有限公司，浙江 紹興 312500）

明膠是膠原降解的產(chǎn)物之一，明膠中含量較多的氨基酸依次為精氨酸、賴氨酸和組氨酸[1]。食用級(jí)的藥用明膠與適宜的輔料按一定比例和方法可制備明膠膠囊[2]。明膠膠囊是用途廣泛的一種藥用輔料。近年來，膠囊生產(chǎn)能力和技術(shù)水平得到很大提升，產(chǎn)品種類不斷豐富，膠囊企業(yè)逐漸向自動(dòng)化、規(guī)?；较虬l(fā)展。但是，企業(yè)對(duì)于膠囊處方的研究和改良一直停滯不前，膠囊的質(zhì)量和附加值得不到提升，阻礙了膠囊劑的安全性、穩(wěn)定性和生物有效性的提高，面臨著藥品一致性評(píng)價(jià)失敗的風(fēng)險(xiǎn)。明膠膠囊在潮濕的環(huán)境中，特別是在氧氣與水分共同作用下易變質(zhì)[3]。明膠的交聯(lián)使膠囊的溶解性質(zhì)發(fā)生變化，如崩解時(shí)間延長(zhǎng)。明膠交聯(lián)是目前膠囊生產(chǎn)過程中所面臨的主要問題之一[4-7]。明膠膠囊交聯(lián)反應(yīng)后生成致密的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，致使膠囊難崩解、溶出度下降、藥物釋放較慢和生物利用度降低[8]。為此，開發(fā)新型抗交聯(lián)的明膠膠囊是目前膠囊產(chǎn)業(yè)中亟需解決的關(guān)鍵問題之一。國(guó)內(nèi)外研究者試圖采用其他材料代替明膠或者加入抗氧化劑等方法來解決明膠膠囊的交聯(lián)問題[9-10]。因此，明膠膠囊的抗氧化處理、檢測(cè)抗氧化能力和提高膠囊保存時(shí)長(zhǎng)等問題，對(duì)于提高企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益是十分重要的。

加入適量的抗氧劑是防止食品被氧化的最方便有效的方法之一[11]。天然來源的抗氧劑因其廣泛使用和廉價(jià)易得已成為食品和藥品中安全常用的輔料?，F(xiàn)已知來源的天然抗氧劑種類復(fù)雜、品種繁多，如維生素 E、維生素 C、茶多酚等。它們均具有一定的抗氧化能力，并且不同抗氧劑的機(jī)理各不相同[12-14]。因此，有必要尋找出一種最有效的抗氧劑。圖1 為明膠分子的交聯(lián)機(jī)制圖，即明膠膠囊在制備和長(zhǎng)期儲(chǔ)存過程中會(huì)被空氣氧化，明膠分子側(cè)鏈的伯胺基被氧化成醛基，并易與其附近的伯氨基發(fā)生席夫堿反應(yīng)，造成明膠交聯(lián)，從而影響了膠囊產(chǎn)品的性能。

Fig.1 Crosslinking mechanism of gelatin molecules圖1 明膠分子的交聯(lián)機(jī)制

因此，我們?cè)O(shè)計(jì)將抗氧劑加入明膠膠囊來抑制伯胺基的氧化反應(yīng)，減少醛基的產(chǎn)生。通過測(cè)定明膠膠囊中醛基的含量變化，篩選出最適宜的抗氧劑，這間接表征明膠交聯(lián)的程度大小。本研究擬采用不同抗氧劑處理過的明膠膠囊，采用品紅—亞硫酸法[15-17]和 2,4-二硝基苯肼法測(cè)定膠囊殼中的醛基，并以醛基濃度為指標(biāo)，通過處方工藝優(yōu)化篩選出最優(yōu)的抗氧劑，這為抗交聯(lián)明膠膠囊的開發(fā)提供了研究基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。品紅—亞硫酸法和 2,4-二硝基苯肼法的原理分別如圖2、圖3 所示。

Fig.2 Principle of fuchsin-sulfite method圖2 品紅—亞硫酸法原理

Fig.3 Principle of 2,4-dinitrophenylhydrazine method圖3 2,4-二硝基苯肼法原理

1 材料和方法

1.1 藥物與試劑

明膠膠囊（浙江華光膠囊股份有限公司，2020 年生產(chǎn)，批號(hào) P02001015）；透明質(zhì)酸（艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司，平均分子量 3 kDa，批號(hào) KH19003）；茶多酚（天津希恩思生化科技有限公司，純度 ≥ 98%，批號(hào) C20PA0991A）；白藜蘆醇（天津希恩思生化科技有限公司，純度 ≥ 98%，批號(hào) W16031134701）；谷胱甘肽（北京伊諾凱科技有限公司，純度 ≥ 97%，批號(hào)G09050IK01）；維生素E 醋酸酯（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度 ≥ 98%，批號(hào) KYFDF68）；維生素 C（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度 ≥ 99%，批號(hào) KCEE709）；焦亞硫酸鈉（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度 ≥ 99%，批號(hào) S112439）；甘氨酸（阿拉丁試劑（上海）有限公司，純度 >99%，批號(hào) A110749）；聚乙二醇1000 維生素E 琥珀酸酯（Tocopherylpolyethylene glycol succinate 1000，TPGS，巴斯夫中國(guó)有限公司上海分公司，批號(hào) V819469）；無水乙醇（上海麥克林生化科技有限公司，純度 ≥ 99.7%，批號(hào) E809061）；2,4-二硝基苯肼（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度 ≥ 99%，批號(hào) C2023038）；甲醛溶液（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，37% w/v，批號(hào) C19PA28025A）；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義英峪予華儀器廠）；EM120-HR pro 水分測(cè)定儀（瑞士普利賽斯稱重設(shè)備有限公司）；CS101-2ABN 烘箱（重慶康誠(chéng)永生試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；TG16-WS 型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；UV2700 紫外可見分光光度計(jì)（島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司）；TopPette 微量移液器（北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；ME104E 型電子天平（梅特勒托利多科技（中國(guó)）有限公司）。

1.3 制備抗氧劑處理過的明膠膠囊

1.3.1 明膠膠囊水分測(cè)定

隨機(jī)取 5 顆未處理的明膠膠囊，剪成小碎片，放入水分測(cè)定儀中測(cè)定水分，重復(fù)多次，每次測(cè)定的含水量在 13%～15% 范圍內(nèi)。

1.3.2 明膠膠囊的抗氧化處理

配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1% 的抗氧劑溶液，用移液槍移取 20 μL 抗氧劑溶液加入到膠囊殼中，用玻璃棒均勻涂抹內(nèi)壁，每組制備 30 粒，將抗氧劑處理后的膠囊殼放入 40℃ 烘箱中，烘 8～10 min，之后隨機(jī)取出 5 粒膠囊，剪碎后放入水分測(cè)定儀中測(cè)定水分含量，水分含量應(yīng)符合未處理膠囊的水分范圍區(qū)間。

1.4 品紅—亞硫酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

0.1 g 的堿性品紅固體溶解于少量的 80℃ 熱水中，加入 10 mL 10% 亞硫酸氫鈉溶液、1 mL濃鹽酸，攪拌均勻。過濾，轉(zhuǎn)移至 100 mL 量瓶中，加水定容。用濾紙過濾，貯存于8℃的冰箱中，放置 12 h 以上，待溶液顏色褪色為淡黃色，即顯色劑制備完成，備用。接著將甲醛溶液稀釋至 0.01 mg·mL-1，分別取 1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5 mL 甲醛稀釋液于 EP 管中，加水至 5 mL后，加入 1 mL 顯色劑，常溫反應(yīng) 40 min 后，以水作為空白溶劑，利用 UV2700 紫外—可見分光光度計(jì)分別對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行 200～800 nm 全波長(zhǎng)掃描，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來確定最大吸收波長(zhǎng)并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。表1 為品紅—亞硫酸法試劑配比。

Table 1 Experimental steps of fuchsin-sulfite method表1 品紅—亞硫酸法操作步驟

1.5 2,4-二硝基苯肼標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

A 溶液的配制：取 100 μL 37% 甲醛，加水至 10 mL，混勻后取 2 mL，加水至 8 mL，即為 1 mg·mL-1；從中取1 mL，加水至 10 mL，記為 A 溶液。

B 溶液的配制：稱取0.2 g 2,4-二硝基苯肼，加入 60 mL 80℃ 的熱水，溶解后加入 1 mL 濃鹽酸溶液，加水至 100 mL，離心，取離心后的上清液至 100 mL 量瓶中，加水定容，記為 B 溶液。

C 溶液的配制：稱取 10.0 g KOH 溶于 100 mL 水中，記為 C 溶液。

具體配比如表2 所示，以組合 1 作為空白溶劑，利用 UV2700 紫外—可見分光光度計(jì)對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行 200～800 nm 的全波長(zhǎng)掃描，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來確定最大吸收波長(zhǎng)并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Table 2 Experimental steps of 2,4-dinitrophenylhydrazine method表2 2,4-二硝基苯肼法操作步驟

1.6 加速實(shí)驗(yàn)確定明膠膠囊交聯(lián)程度

1.6.1 品紅亞硫酸法測(cè)定醛基含量

取 2020 年綠白膠囊殼若干，往殼體里加入 20 μL 水，用玻璃棒均勻涂抹內(nèi)壁，放入 40℃ 烘箱中；在20、40、60、80、120、240、360、480 min 分別取出 10 粒膠囊殼，稱取白色膠囊帽，加水溶解（加水量=殼體質(zhì)量/ 0.5×15 mL）；分別取 800、900、1 000、1 100、1 200 μL 溶解液于帶編號(hào)的EP 管中，加水至5 mL，將EP 管放入離心機(jī)中，3 000 r·min-1離心 10 min；離心結(jié)束后，分別將上清液倒于另外 5 支相應(yīng)編號(hào)的EP 管中，分別加入 1 mL 顯色劑，常溫反應(yīng) 40 min 后，以水為空白溶劑，利用 UV2700 紫外分光光度計(jì)對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行 200～800 nm 全波長(zhǎng)掃描，記錄最大吸收波長(zhǎng)。

1.6.2 2,4-二硝基苯肼法測(cè)定醛基含量

取 2020 年綠白膠囊，往膠囊殼中加入 20 μL 水，用玻璃棒均勻涂抹內(nèi)壁，放入 40℃ 烘箱；分別在 20、40、60、80、120、240、360、480 min 取出 15 粒，分別稱取 0.6 g 白色膠囊帽，加入 15 mL 水溶解，溶出液離心（3 000 r·min-1離心 10 min）。取 0.15 mL 的溶出液，加入 3 mL B 溶液，60℃ 水浴加熱 10 min 后，加入0.3 mL 無水乙醇、2.7 mL C 溶液后，定容至 15 mL；以水為空白溶劑，利用 UV2700 紫外分光光度計(jì)對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行 200～800 nm 全波長(zhǎng)掃描，記錄最大吸收波長(zhǎng)。

1.7 加速實(shí)驗(yàn)確定抗氧劑抗交聯(lián)程度

1.7.1 品紅亞硫酸法測(cè)定醛基含量

首先，采用 2020 年綠白膠囊，往白色膠囊體里加入 20 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1% 的抗氧劑溶液，用玻璃棒涂抹均勻，放入 40℃ 烘箱；在 20、40、60、80、120、240、360、480 min 分別取出10 粒，稱取白色膠囊體，加水溶解（加水量為殼體質(zhì)量/ 0.5×15 mL），分別取 800、900、1 000、1 100、1 200 μL 溶解液于帶編號(hào)的EP 管中，加水至 5 mL，將 EP 管放入離心機(jī)中，3 000 r·min-1離心 10 min，離心結(jié)束后，分別將上清液倒于另外 5 支 EP 管中，加入 1 mL 品紅—亞硫酸顯色劑，反應(yīng) 40 min 后，以水作為空白溶劑，利用 UV2700 紫外分光光度計(jì)對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行 200～800 nm 全波長(zhǎng)掃描，記錄最大吸收波長(zhǎng)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出醛基的含量。

1.7.2 2,4-二硝基苯肼法測(cè)定醛基含量

首先，采用 2020 年綠白膠囊，往白色膠囊體里加入 20 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1% 的抗氧劑溶液，用玻璃棒涂抹均勻，放入 40℃ 烘箱；在 20、40、60、80、120、240、360、480 min 分別取出 10粒，稱取白色膠囊體 15 粒，稱取 0.6 g 膠囊體，加入 15 mL 水溶解，溶出液離心。取 0.15 mL 的溶出液，加入 3 mL B 溶液，60℃ 水浴加熱 10 min 后，加入 0.3 mL 無水乙醇、2.7 mL C 溶液后定容至 15 mL，以水作為空白溶劑，利用 UV2700 紫外分光光度計(jì)對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行 200～800 nm全波長(zhǎng)掃描，記錄最大吸收波長(zhǎng)。

2 結(jié)果

2.1 明膠膠囊的水分

明膠膠囊的含水量見表3 所示。

Table 3 Water content of gelatin capsules表3 明膠膠囊的含水量

2.2 品紅—亞硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

品紅—亞硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品見圖4 所示。

Fig.4 Samples for the standard curve of fuchsin-sulfite method圖4 品紅—亞硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品

根據(jù) 200～800 nm 紫外掃描結(jié)果表明，品紅—亞硫酸顯色劑在 580 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收峰。圖5 為品紅—亞硫酸法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：A=56.726C -0.199，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，甲醛濃度在 0.05～0.12 mg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

Fig.5 The standard curve of fuchsin-sulfite method圖5 品紅—亞硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 2,4-二硝基苯肼法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2,4-二硝基苯肼法標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品見圖6 所示。

Fig.6 Samples for the standard curve of 2,4-dinitrophenylhydrazine method圖6 2,4-二硝基苯肼法標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品

根據(jù)200～800 nm 紫外掃描結(jié)果表明，2,4-二硝基苯肼在 436 nm 波長(zhǎng)有最大吸收峰。如圖7所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：A=894.42C -0.005 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.987 1，甲醛濃度在 0.66～1.1 μg·mL-1內(nèi)成一定的線性關(guān)系。

Fig.7 The standard curve of 2,4-dinitrophenylhydrazine method圖7 2,4-二硝基苯肼法標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 抗氧劑加速實(shí)驗(yàn)醛基含量變化

由表4 可知，表中所用的抗氧劑制備的抗氧化膠囊在加速實(shí)驗(yàn)中醛基含量均小于僅使用水制備的膠囊的醛基含量，說明這些抗氧化劑具有抗氧化能力，能夠在明膠膠囊中發(fā)揮抗交聯(lián)功能，但是它們抗交聯(lián)的能力差異較大。這些抗氧劑抗交聯(lián)能力由強(qiáng)到弱的順序是：茶多酚＞谷胱甘肽＞透明質(zhì)酸＞焦亞硫酸鈉＞甘氨酸＞維生素E＞TPGS＞白藜蘆醇。

Table 4 Determination of aldehyde groups in gelatin capsules表4 明膠膠囊中醛基含量測(cè)定

3 討論

由上述實(shí)驗(yàn)可以知道，2,4-二硝基苯肼法和品紅-亞硫酸法均可測(cè)定膠囊中的醛基，每個(gè)方法測(cè)定的醛基含量不同，醛基可與苯肼或者亞硫酸品紅試液發(fā)生一系列加成反應(yīng)。通過分子重排反應(yīng)生成有色物質(zhì)，其顏色的深淺與樣品中醛基的含量在一定線性范圍內(nèi)成正相關(guān)[18]。通過對(duì)兩種方法所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較得出：2,4-二硝基苯肼法測(cè)得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)波動(dòng)和偏差較大。這是由于該方法的檢測(cè)限比較高，靈敏度達(dá)不到要求，并且經(jīng)過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，2,4-二硝基苯肼標(biāo)準(zhǔn)曲線誤差較大，即使得到較好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，但是重現(xiàn)性也比較差；而品紅亞硫酸法得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線較精準(zhǔn)，重復(fù)性較高，所以我們認(rèn)為品紅亞硫酸法具有較高的準(zhǔn)確度。兩種方法測(cè)定用抗氧劑處理過的膠囊的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，茶多酚和甘氨酸抗氧化能力最強(qiáng)。因此，醛基含量是衡量明膠膠囊交聯(lián)程度的一項(xiàng)重要指標(biāo)之一，使用抗氧化劑可以解決明膠膠囊在儲(chǔ)存過程中出現(xiàn)的交聯(lián)問題，也可為膠囊殼生產(chǎn)工藝的優(yōu)化提供可靠依據(jù)。