王 珊,許海燕,侯敏娜,彭修娟,王 青,劉艷紅,劉 峰

1.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院,咸陽(yáng) 712046; 2.陜西步長(zhǎng)制藥有限公司,西安 710075

地黃為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch. 的新鮮或干燥塊根[1],始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[2],并被列為上品。地黃在全國(guó)各地均有栽培,主產(chǎn)于河南、山東、山西等省,以河南溫縣、孟縣、武陟等地栽培歷史最長(zhǎng),產(chǎn)量最高,于秋季采挖,除去蘆頭、須根及泥沙,鮮用,習(xí)稱“鮮地黃”;或?qū)⒌攸S緩緩烘焙至約八成干,習(xí)稱“生地黃”。鮮地黃性寒,味甘、苦,偏于清熱生津、涼血止血;生地黃性甘、寒,長(zhǎng)于清熱涼血、養(yǎng)陰、生津。地黃經(jīng)酒燉或清蒸法制成的熟地黃,其味甘,性微溫,具有滋陰補(bǔ)血、益精填髓之功效[3]。通過對(duì)《神農(nóng)本草經(jīng)》《本草經(jīng)集注》[4]《備急千金要方》[5]等相關(guān)古籍文獻(xiàn)進(jìn)行查閱和總結(jié),發(fā)現(xiàn)鮮地黃與生地黃和熟地黃的功效不一致,且“生者尤良”,其中鮮地黃可外用,可內(nèi)服,還可用于養(yǎng)生保健。

地黃臨床上主要用于治療腎陰虛引起的各種病證。腎臟疾病的病理類型多樣,診治較為復(fù)雜。而現(xiàn)代研究結(jié)果顯示,多種慢性腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展均有氧化應(yīng)激反應(yīng)的參與[6],其在多種腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。氧化應(yīng)激是指機(jī)體面對(duì)各種有害刺激時(shí)所產(chǎn)生的反應(yīng),機(jī)體的氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失去平衡,產(chǎn)生大量氧化應(yīng)激產(chǎn)物,在體內(nèi)大量蓄積,這些產(chǎn)物被稱為活性氧(reactive oxygen species, ROS),包括超氧陰離子、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基等[7],因此推測(cè)地黃具有抗氧化應(yīng)激的作用。目前對(duì)生地黃和熟地黃的抗氧化活性已有研究報(bào)道[8-10],但關(guān)于鮮地黃、生地黃、熟地黃的抗氧化活性差異性比較的研究較少。

地黃不同炮制品的臨床功效的差異性與其外觀性狀等有一定的相關(guān)性。鮮地黃、生地黃和熟地黃的外觀差異較大,尤其是顏色,其主要原因是藥材在采收、加工、儲(chǔ)藏等過程中發(fā)生了酶促褐變反應(yīng)。有關(guān)酶促褐變反應(yīng)發(fā)生的確切途徑還在研究,但目前普遍認(rèn)為涉及2個(gè)途徑,第一是酚類化合物被氧化為醌類化合物,第二是酚類化合物在發(fā)生氧化反應(yīng)的同時(shí)還會(huì)發(fā)生自身聚合。褐變的顏色取決于化合物本身的光譜特征、酶底物的來源和pH值[11]。通過對(duì)酶促褐變反應(yīng)機(jī)制的分析可知,酶促褐變反應(yīng)的產(chǎn)生主要是化合物發(fā)生了氧化反應(yīng)。

因此本文將用3種體外抗氧化活性模型對(duì)鮮地黃、生地黃及熟地黃的抗氧化活性進(jìn)行初步的研究,為揭示地黃具有滋補(bǔ)腎陰且能抗氧化應(yīng)激提供一定的理論依據(jù)。同時(shí)通過對(duì)鮮地黃、生地黃及熟地黃的褐變酶活性進(jìn)行檢測(cè)分析,為揭示地黃不同炮制品之間氧化活性的差異提供一定的理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

紫外分光光度計(jì)(T6-新世紀(jì),北京普析通用股份有限公司);XP-205電子天平(梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司);DZF-6090真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);LGJ-12D型冷凍干燥機(jī)(北京四環(huán)啟航科技有限公司);OM-1500A小型噴霧干燥機(jī)(上海歐蒙實(shí)業(yè)有限公司);DHG-9075鼓風(fēng)干燥箱(上?？彼{(lán)儀器科技有限公司);DC-3010電子恒溫電浴爐(上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);HR1832飛利浦榨汁機(jī)[飛利浦電子技術(shù)(上海)有限公司];WBZ-10微波真空干燥機(jī)(貴陽(yáng)新奇微波工業(yè)有限責(zé)任公司)。

1.2 試藥

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH,Alfa Aesar公司);2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(2,2’-azobis-3-ethylbenzoinesulfonic acid,ABTS)、三吡啶三吖嗪[2,4,6-tri (2-pyridyl)-1,3,5-triazine,TPTZ]均購(gòu)自日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社;6水合三氯化鐵(FeCl3·6H2O)、7水合硫酸鐵(FeSO4·7H2O)、過硫酸鉀(K2S2O8)、醋酸鈉(CH3COONa)均為分析純,購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇、甲醇均為分析純,購(gòu)自天津恒興化學(xué)試劑有限公司;鄰苯二酚(Sigma公司);愈創(chuàng)木酚、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)均購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)、體積分?jǐn)?shù)為30%的過氧化氫均為分析純,購(gòu)自北京化工廠;高純水(美國(guó)Millipore公司)。

鮮地黃、生地黃及熟地黃樣品均于2021年從道地產(chǎn)區(qū)直接收集,經(jīng)陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院雷國(guó)蓮教授鑒定為玄參科植物地黃RehmanniaglutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根。

2 方法與結(jié)果

2.1 鮮地黃、生地黃及熟地黃的不同提取物抗氧化活性的比較

2.1.1鮮地黃樣品的制備 取適量鮮地黃清洗干凈,晾干,用榨汁機(jī)榨汁,取地黃汁用微波真空干燥機(jī)進(jìn)行干燥(置于微波真空干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行干燥,設(shè)定真空度為-0.05 MPa,初始溫度為25.5 ℃,干燥至含水率低于10%),得鮮地黃粉末,備用。

2.1.2工作液的配制 準(zhǔn)確稱取DPPH適量,用無水乙醇溶解配制成200 μmol·L-1的儲(chǔ)備液,即得。

將7 mmol·L-1的ABTS與2.45 mmol·L-1的過硫酸鉀溶液等體積混勻,室溫避光放置16 h,即得ABTS儲(chǔ)備液。使用前用甲醇或無水乙醇稀釋至吸光度為0.7±0.002,得ABTS工作液。

TPTZ工作液:由0.3 mmol·L-1醋酸鈉緩沖液(pH 3.6)、10 mmol·L-1TPTZ溶液、20 mmol·L-1FeCl3·6H2O溶液組成,三者體積比為10∶1∶1,TPTZ工作液需要新鮮制備,使用前將3種儲(chǔ)備液按上述體積比混合。

不同濃度硫酸亞鐵溶液:精密稱取FeSO4·7H2O 0.020 86 g置于25 mL量瓶中,以純凈水溶解并定容,配制成3 mmol·L-1FeSO4溶液,分別取3 mmol·L-1FeSO4溶液5、4、3、2、1、0.5、0.1 mL,置于7個(gè)10 mL量瓶中,用純凈水定容,配制成1.5、1.2、0.9、0.6、0.3、0.15、0.03 mmol·L-1的FeSO4溶液。

2.1.3供試品溶液的配制 分別稱取10批生地黃和熟地黃樣品適量,干燥,粉粹,過80目篩,再分別稱取鮮地黃、生地黃和熟地黃粉末各0.15 g(平行3份),精密稱定,加入30 mL純凈水,超聲處理30 min,濾過,將濾液用水稀釋至一系列質(zhì)量濃度,備用。

2.1.4樣品的測(cè)定 (1)DPPH·(DPPH自由基)清除實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[12-13],取2 mL 200 μmol·L-1DPPH溶液與2 mL供試品溶液室溫反應(yīng)30 min,并于517 nm處測(cè)定混合液的吸光度(A)值,重復(fù)3次取平均值。根據(jù)公式:清除率(%) = [1-(Ai-Aj)/A0]×100%(式中:Ai為2 mL 200 μmol·L-1DPPH乙醇溶液+2 mL供試品溶液的吸光度;Aj為2 mL 無水乙醇溶液+2 mL供試品溶液的吸光度;A0為2 mL 200 μmol·L-1DPPH乙醇溶液+2 mL空白試劑的吸光度)計(jì)算DPPH·清除率,其中供試品的清除自由基能力用清除DPPH·的半數(shù)抑制率(IC50)值表示。

DPPH法分為動(dòng)力學(xué)法和靜力學(xué)法。本文用DPPH靜力學(xué)法,其檢測(cè)的是樣品清除DPPH·的量或DPPH·與某一供氫體反應(yīng)的化學(xué)計(jì)量關(guān)系或復(fù)雜混合物中活性-OH·的量,常以IC50表示[14]。該方法具有操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏、易重復(fù)等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)鮮地黃、生地黃及熟地黃的水提取物、醇提取物進(jìn)行了DPPH實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表1。由表1可知,地黃的不同炮制品均有一定的抗氧化活性,其中醇提取物的抗氧化活性高于水提取物;在水提取物清除DPPH·活性的實(shí)驗(yàn)中,其清除DPPH·活性的排序?yàn)轷r地黃>熟地黃>生地黃;在醇提取物清除DPPH·活性實(shí)驗(yàn)中,其清除DPPH·活性的排序?yàn)轷r地黃>生地黃>熟地黃。

表1 10批鮮地黃、生地黃和熟地黃不同提取物清除DPPH·的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析發(fā)現(xiàn),鮮地黃、生地黃及熟地黃的水提取物和醇提取物的抗氧化活性有顯著性差異,其中醇提取物的抗氧化活性顯著高于水提取物(P<0.01);在水提取物實(shí)驗(yàn)中,與鮮地黃比較,生地黃和熟地黃水提取物的抗氧化活性均顯著低于鮮地黃(P<0.01);在醇提取物實(shí)驗(yàn)中,與鮮地黃比較,生地黃和熟地黃醇提取物的抗氧化活性均顯著低于鮮地黃(P<0.01)。

(2)ABTS·(ABTS自由基)清除實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[12,14],取3 mL ABTS工作液與0.5 mL供試品溶液混勻,室溫反應(yīng)60 min,并于734 nm處測(cè)定其A值,重復(fù)3次取平均值,計(jì)算ABTS·清除率(清除率計(jì)算公式同2.1.4項(xiàng)下公式),同時(shí)以清除ABTS·的IC50值表示供試品清除自由基的能力。

該實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)單氧離子自由基ABTS·來表示抗氧化劑清除自由基的能力,該方法操作簡(jiǎn)單,反應(yīng)速度相對(duì)較快,適用的pH范圍較廣,無論親水性還是親脂性的抗氧化劑均可適用,而且拓寬了DPPH法的應(yīng)用范圍,有研究表明抗氧化劑清除ABTS·的效率高于DPPH·[15]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)鮮地黃、生地黃及熟地黃的水提取物、醇提取物進(jìn)行了ABTS·清除實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表2。由表2可知,地黃的不同炮制品均有一定清除ABTS·的能力,其中醇提取物的活性高于水提取物;在水提取物清除ABTS·活性的實(shí)驗(yàn)中,其清除ABTS·活性的排序?yàn)轷r地黃>熟地黃>生地黃;在醇提取物清除ABTS·活性實(shí)驗(yàn)中,其清除ABTS·活性的排序?yàn)轷r地黃>生地黃>熟地黃。

表2 10批鮮地黃、生地黃和熟地黃不同提取物清除ABTS·的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析發(fā)現(xiàn),鮮地黃和生地黃醇提取物的抗氧化活性顯著高于水提取物的抗氧化活性(P<0.01),熟地黃水提取物和醇提取物的抗氧化活性比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在水提取物和醇提取物的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)中,生地黃的抗氧化活性顯著低于鮮地黃(P<0.01),熟地黃的抗氧化活性與鮮地黃比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

(3)FRAP活性測(cè)定實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[12,14],取0.5 mL各供試品溶液,加入FRAP工作液3 mL,混勻反應(yīng)75 min,并于734 nm處測(cè)定A值,重復(fù)3次取平均值。

以FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求回歸方程,樣品的抗氧化能力以FRAP值表示:1FRAP單位=1 mmol·L-1FeSO4,即樣品的抗氧化能力相當(dāng)于FeSO4的mmol·L-1數(shù)。將不同濃度的 FeSO4溶液代替樣品溶液,同上操作測(cè)定A值,以A為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程A=0.705 3C+0.119 2(R2=0.999 2)。將一系列供試品溶液所測(cè)的A值代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算FeSO4當(dāng)量值。FeSO4當(dāng)量值越大,表示樣品的還原能力越強(qiáng)。

鐵離子還原能力法是基于氧化還原反應(yīng)的比色法,其操作簡(jiǎn)單、快速、重復(fù)性好、廉價(jià)且易于標(biāo)準(zhǔn)化,與其他方法聯(lián)合使用,能區(qū)別不同反應(yīng)機(jī)制的方法測(cè)量結(jié)果的差異。FRAP法反映的不是樣品對(duì)某一種自由基的清除活性,而是樣品的總還原能力,目前該法測(cè)定結(jié)果可用來反映樣品的總抗氧化活性[15]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)鮮地黃、生地黃及熟地黃的水提取物、醇提取物進(jìn)行了FRAP實(shí)驗(yàn),結(jié)果見圖1。

圖1 鮮地黃、生地黃和熟地黃不同提取物的鐵離子還原能力考察

FRAP實(shí)驗(yàn)中各樣品的鐵離子還原能力用圖1中相應(yīng)曲線的斜率表示。由圖1可知,地黃不同炮制品的總還原能力與DPPH及ABTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致,其各炮制品的醇提取物的總還原能力強(qiáng)于水提取物;在水提取物的實(shí)驗(yàn)中,其總還原能力依次為鮮地黃>熟地黃>生地黃;在醇提取物實(shí)驗(yàn)中,其總還原能力強(qiáng)弱依次為鮮地黃>生地黃>熟地黃。

2.2 鮮地黃、生地黃和熟地黃褐變酶活性的比較

2.2.1溶液的配制 以下溶液的配制參考文獻(xiàn)[16]略有修改。

(1)0.05 mol·L-1磷酸緩沖液(PBS)的配制。A母液:精密稱取Na2HPO4·12H2O 35.81 g,用蒸餾水定容至500 mL得到0.2 mol·L-1的磷酸氫二鈉溶液,即得;B母液:精密稱取NaH2PO4·2H2O 15.60 g,用蒸餾水定容至500 mL得到0.2 mol·L-1的磷酸二氫鈉溶液,即得;pH 6.0的0.05 mol·L-1PBS:分別精密移取A母液12.5 mL和B母液112.5 mL,再加入10 g PVP和0.019 g EDTA-Na2,用蒸餾水定容至500 mL即得0.05 mol·L-1PBS (pH6.0,含體積分?jǐn)?shù)為1%的PVP,0.1 mmol·L-1EDTA-Na2);pH 7.8的0.05 mol·L-1PBS:分別精密移取A母液112.5 mL和B母液12.5 mL,再加入10 g PVP和0.019 g EDTA-Na2,用蒸餾水定容至500 mL即得0.05 mol·L-1PBS(pH7.8,含體積分?jǐn)?shù)為1%的 PVP,0.1 mmol·L-1EDTA-Na2)。

(2)0.05 mol·L-1鄰苯二酚的配制:精密稱取鄰苯二酚0.55 g,加蒸餾水定容至100 mL,即得。

(3)體積分?jǐn)?shù)為2%的 H2O2的配制:精密移取6.7 mL體積分?jǐn)?shù)為 30%的 H2O2,加蒸餾水定容至100 mL,即得。

(4)0.05 mol·L-1愈創(chuàng)木酚的配制:精密移取愈創(chuàng)木酚555 μL,加PBS(pH 7.8)定容至100 mL,即得,4 ℃避光保存。

2.2.2地黃粗酶液的制備

(1)多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)的制備:從-80 ℃冰箱中取出鮮地黃、生地黃和熟地黃樣品,精密稱取0.5～2 g,置于研缽(已冰浴)中,加入2 mL 4 ℃下預(yù)冷的0.05 mol·L-1PBS(pH 6.0)研磨成勻漿,將勻漿轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,再用6 mL PBS分次沖洗研缽,然后于4 ℃以 10 000 r·min-1離心15 min,將上清液轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中,定容,于4 ℃ 以10 000 r·min-1離心15 min,得到的上清液即為PPO粗酶液。

(2)過氧化物酶(peroxidase,POD)的制備:操作同PPO酶的制備方法,不同之處在于用0.05 mol·L-1PBS(pH 7.8)代替0.05 mol·L-1PBS(pH 6.0)進(jìn)行制備。

2.2.3酶活性的測(cè)定 PPO廣泛存在于自然界中,幾乎所有植物細(xì)胞中都或多或少地存在PPO[17],而且PPO在果、蔬及中藥材的褐變中發(fā)揮著不可替代的作用[11,18]。POD廣泛存在于各類生命體中,其特點(diǎn)是含有鐵和銅等離子的一類氧化還原酶,在H2O2存在下能催化酚類、黃酮類的氧化和聚合,導(dǎo)致組織褐變[19]。

有研究發(fā)現(xiàn),POD的催化能力甚至強(qiáng)于PPO。因此本文對(duì)PPO和POD酶活性分別進(jìn)行了測(cè)定。

(1)PPO酶活性測(cè)定步驟與計(jì)算公式:PPO酶活性測(cè)定中所需要試劑、反應(yīng)試管分組及各試液的配比見表3。

表3 PPO酶活性測(cè)定的反應(yīng)液

將表3中各試管立即放入37 ℃的水浴鍋中保溫10 min以上,向4號(hào)試管中加入0.5 mL PBS(pH 6.0),混勻,在410 nm處調(diào)零,再向測(cè)定管中加入0.5 mL粗酶液,混合均勻后立即計(jì)時(shí)并測(cè)定,每30 s讀取1次,共測(cè)2 min,做3組重復(fù)實(shí)驗(yàn)。待測(cè)定管全部測(cè)定完后,計(jì)算酶活性。

計(jì)算方法:以ΔA410每分鐘內(nèi)變化0.01為1個(gè)PPO酶活性單位,以此計(jì)算出PPO酶活性。

式中:ΔA為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)410 nm處吸光度的變化;Wt為地黃樣品的鮮質(zhì)量(g);t為反應(yīng)時(shí)間(min);D為稀釋倍數(shù),即提取的總酶液為反應(yīng)系統(tǒng)內(nèi)酶液的倍數(shù)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)生地黃、鮮地黃和熟地黃中PPO酶的活性進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見表4,其結(jié)果與POD酶活性檢測(cè)結(jié)果基本一致。地黃不同炮制品的PPO酶活性從高到低依次為生地黃>鮮地黃>熟地黃。通過顯著性分析發(fā)現(xiàn),與鮮地黃比較,生地黃PPO酶活性顯著高于鮮地黃(P<0.01),熟地黃PPO酶活性顯著低于鮮地黃(P<0.01);與生地黃相比較,熟地黃的PPO酶活性顯著低于生地黃(P<0.01)。

表4 鮮地黃、生地黃和熟地黃中PPO酶活性的檢測(cè)結(jié)果

(2)POD酶活性測(cè)定步驟與計(jì)算公式:POD酶活性測(cè)定中所需要試劑、反應(yīng)試管分組及各試液的配比見表5。

表5 POD酶活性測(cè)定的反應(yīng)液

將表5中的各試管立即放入37 ℃的水浴鍋中保溫5 min以上,向4號(hào)試管中加入1 mL粗酶液,混勻,在470 nm處調(diào)零,再向測(cè)定管中加入1 mL粗酶液,混勻后立即計(jì)時(shí)并測(cè)定,每30 s讀取1次,共測(cè)2 min,重復(fù)測(cè)定3次,待測(cè)定管全部測(cè)定完畢后,計(jì)算酶活性。

計(jì)算方法:以每分鐘內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)POD酶活性單位,以此計(jì)算出POD酶活性。

式中:ΔA470為反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化;Vt為提取酶液的總體積(mL);W為地黃樣品的質(zhì)量(g);Vs為測(cè)定時(shí)取用酶液體積(mL);t為反應(yīng)時(shí)間(min)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)鮮地黃、生地黃和熟地黃中POD酶的活性進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果見表6。地黃不同炮制品的POD酶活性從高到低依次為生地黃>鮮地黃>熟地黃。通過顯著性分析發(fā)現(xiàn),與鮮地黃比較,生地黃POD酶活性均顯著高于鮮地黃(P<0.01),熟地黃POD酶活性顯著低于鮮地黃(P<0.01);與生地黃比較,熟地黃的POD酶活性顯著低于生地黃(P<0.01)。

表6 鮮地黃、生地黃和熟地黃中POD酶活性的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

地黃具有悠久的臨床應(yīng)用歷史,且地黃的不同炮制品各具有獨(dú)特的臨床功效。本文通過對(duì)古籍文獻(xiàn)進(jìn)行查閱,發(fā)現(xiàn)鮮地黃、生地黃及熟地黃的功效不一致。地黃的不同炮制品均歸于腎經(jīng),主要應(yīng)用于腎陰虛證。鮮地黃性寒,偏于清熱生津、涼血止血,生地黃性甘、寒,長(zhǎng)于清熱涼血、養(yǎng)陰、生津。而熟地黃具有滋陰補(bǔ)血、益精填髓之功效,三者的功效有較為明顯的差異,直接用干地黃替換鮮地黃并不能發(fā)揮鮮地黃的特殊療效。但由于鮮藥汁多鮮嫩,容易腐爛變質(zhì),且受季節(jié)限制,每年因?yàn)轷r藥材未及時(shí)加工、儲(chǔ)存不當(dāng)?shù)?造成鮮藥的腐爛率超過30%,所以鮮藥逐漸被易保存的干燥藥材替代,也形成了以干燥藥材為主的中醫(yī)藥學(xué)臨床應(yīng)用的理論體系。但是部分藥材鮮品獨(dú)特的功效是干品藥材所無法替代的。因此本實(shí)驗(yàn)以地黃為示范,對(duì)鮮地黃進(jìn)行榨汁,對(duì)其汁進(jìn)行微波干燥,以此來代替鮮地黃,而現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)腎臟疾病的產(chǎn)生與氧化應(yīng)激有著密切的關(guān)系[6],故用體外抗氧化模型將其與生地黃和熟地黃的抗氧化活性進(jìn)行比較評(píng)價(jià),希望以此為突破口揭示鮮地黃、生地黃及熟地黃的臨床療效的差異及作用機(jī)制。同時(shí)通過檢測(cè)鮮地黃、生地黃及熟地黃的褐變酶活性來揭示地黃不同炮制品之間抗氧化活性差異性的原因。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),地黃的不同炮制品均有一定的抗氧化活性,其中鮮地黃的抗氧化活性最好;在水提取物實(shí)驗(yàn)中,地黃不同炮制品在3種體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)中,其抗氧化活性能力依次為鮮地黃>熟地黃>生地黃;在醇提取物實(shí)驗(yàn)中,地黃不同炮制品在3種體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)中,其抗氧化活性能力依次為鮮地黃>生地黃>熟地黃。

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)POD和PPO 2種褐變酶的活性檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn),地黃不同炮制品的褐變酶的活性差異較大;其中POD和PPO 2種褐變酶的活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致,生地黃的褐變酶活性最高,這也是生地黃顏色較深的原因之一;鮮地黃的褐變酶活性較低,這也是鮮地黃顏色為鮮黃色的原因之一;熟地黃為黑色,而褐變酶活性最低,這可能與熟地黃炮制過程需要反復(fù)蒸有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),酶促褐變反應(yīng)的產(chǎn)物仍具有一定的抗氧化性[11],但其褐變酶反應(yīng)的強(qiáng)弱不同其抗氧化活性存在差異,且部分不能發(fā)生酶促褐變反應(yīng)的底物本身也具有一定的抗氧化活性。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,鮮地黃的褐變酶活性較低,其抗氧化活性最高;生地黃的褐變酶活性最高,其水提取物、醇提取物的抗氧化相對(duì)較低。熟地黃的褐變酶活性最低,其水提取物的抗氧化活性高于生地黃,這應(yīng)該與熟地黃在加工后其多糖含量較高有關(guān)。通過對(duì)抗氧化活性與褐變酶活性的綜合比較分析可知,地黃的不同炮制品抗氧化活性與酶促褐變反應(yīng)有一定的相關(guān)性。

目前有關(guān)藥物的抗氧化能力評(píng)價(jià)在臨床及食品業(yè)等領(lǐng)域均非常重要,體外抗氧化檢測(cè)方法由于其具有操作簡(jiǎn)單、迅速、靈敏、成本低廉等優(yōu)點(diǎn),使其在食品、藥品等抗氧化效應(yīng)的評(píng)價(jià)方面使用非常廣泛。但其最大的缺陷是無法真實(shí)模擬生理環(huán)境,不能確切地反映藥物的抗氧化性的實(shí)際作用效果,也存在有些體系或模型甚至與生理/病理無關(guān),且僅測(cè)定了藥物抗氧化能力的某一方面,無法模擬生理?xiàng)l件下的多條抗氧化途徑。因此本課題組后期還需對(duì)地黃不同炮制品的體內(nèi)抗氧化活性進(jìn)行檢測(cè)及評(píng)價(jià),進(jìn)而更加有效地揭示地黃不同炮制品的臨床作用機(jī)制的差異性。