呂鑫科,曾愛國

1.武漢大學中南醫(yī)院藥學部,武漢 430071;2.西安交通大學醫(yī)學部藥學院,西安 710061

木犀草素化學名為3’,4’,5,7四羥基黃酮(3’,4’,5,7-tetralydroxyflanone),是典型的黃酮類化合物,廣泛存在于荊芥、野菊花、金銀花、白毛夏枯草、洋薊等中藥材中[1-3]?，F(xiàn)代藥理學研究表明,木犀草素具有抗氧化[4]、抗炎[5-6]、抗腫瘤[7]、抑菌[8]、抗過敏[9]以及增加冠狀動脈血流量和降低冠狀動脈血管阻力[10]等作用。但木犀草素的水溶性差,不易吸收,生物利用度低,限制了其在臨床上的應用[11]。

提高難溶性藥物的溶解度一般用減小藥物粒徑、成鹽、固體分散體、包合物、前藥修飾、改變晶型等方法[12-13]。目前,固體分散體是提高難溶性藥物溶解度和溶出度、改善體內吸收和生物利用度的常用方法[14-15]。鄧向濤等[16]和吳春等[17]以乙醇為溶劑,分別用溶劑法、溶劑-熔融法制備木犀草素-PVP k30固體分散體,增大木犀草素的溶解度,提高體內生物利用度。以乙醇為溶劑制備固體分散體,在除去乙醇時,易造成環(huán)境污染,且制備的固體分散體易析晶。本研究擬以聚乙二醇(PEG) 400為溶劑,在85 ℃溶解木犀草素,加入PVP k30在150 ℃充分攪拌,制備木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體。用該方法制備固體分散體時,不需要除去PEG 400,可簡化制備過程且不會污染環(huán)境。PEG 400作為載體成分,還可起到增塑作用,降低PVP k30玻璃轉變溫度,提高固體分散體的穩(wěn)定性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

AY 120型電子天平、傅里葉紅外分析儀、LC-20A型色譜系統(tǒng)均購自日本Shimadzu公司;Mapada UV-1200型紫外分光光度計(上海美普達儀器有限公司);DSC 822e型差示掃描量熱儀(Mettler Toledo有限公司);D8 Advance型X線衍射儀(Bruker有限公司);ZRS-8G型智能溶出試驗儀(上海雙旭電子有限公司);98-1-C型數(shù)字電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試藥

木犀草素(質量分數(shù)>98%,西安冠宇生物技術有限公司);木犀草素對照品、芹菜素對照品質量分數(shù)均>99.9%,均購自中國食品藥品檢定研究院;PEG 400、PVP k30均購自天津市光復科技發(fā)展有限公司;甲醇、乙腈均為色譜純,均購自天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心;肝素鈉(天津生物化學制藥有限公司);羧甲基纖維素鈉(國藥集團化學試劑有限公司);三蒸水為自制;其他試劑均為分析純,均購自西安化學試劑廠。

1.3 動物

SD雄性大鼠,體質量為(280±20) g,購自西安交通大學醫(yī)學實驗動物中心,許可證號為SCKX(陜)0073276。

2 方法

2.1 木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的制備

取適量木犀草素,加入PEG 400中,85 ℃攪拌至溶解;按一定比例加入PVP k30,150 ℃攪拌10 min,室溫冷卻;粉碎,過80目篩,得粒徑為50～100 μm的木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體,置于干燥器中避光保存,備用。

取PEG 400,按一定比例加入PVP k30,150 ℃攪拌10 min,室溫冷卻,粉碎,過80目篩;加入木犀草素,混合均勻,即得物理混合物,置于干燥器中避光保存。

2.2 差示掃描量熱法曲線的繪制

精密稱取2.0 mg木犀草素以及相當于2.0 mg木犀草素的木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體和物理混合物測定差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry,DSC)曲線。差示掃描量熱儀用銦和鋅進行溫度和焓值校正,以空鋁坩堝作為參比物,在氮氣流下從25 ℃升溫至350 ℃,升溫速率為10 ℃·min-1。

2.3 粉末X線衍射分析

稱取適量的木犀草素、木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體和物理混合物在室溫下測定各樣品的粉末X線衍射圖譜。粉末X線衍射條件:銅靶,管壓為40 kV,管電流為30 mA,步長為0.02°,掃描速度為每分鐘2.0°,持續(xù)時間為0.06 s,掃描范圍為10°～40°。

2.4 溶出實驗

以蒸餾水為溶出介質,用槳法(2020年版《中華人民共和國藥典》四部通則0931第二法)測定木犀草素的溶出度。分別精密稱取5.0 mg木犀草素以及相當于5.0 mg木犀草素的木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體和物理混合物,加入200 mL水中,溫度為(37.5±0.5) ℃,轉速為100 r·min-1。分別于5、10、15、30、60、120、180、240 min取樣5 mL,立即用0.2 μm微孔濾膜過濾,同時補充5 mL同溫度的蒸餾水。用紫外-可見分光光度計在254 nm處測定溶出樣品的吸光度值,計算溶出樣品中木犀草素的含量,并繪制溶出曲線。

2.5 體內藥動學

2.5.1試藥的配制 木犀草素混懸液:精密稱取0.25 g木犀草素,置于50 mL量瓶中,加入適量5 g·L-1CMC-Na水溶液,用蒸餾水定容至刻度,即得5 mg·mL-1的木犀草素混懸液。

木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體混懸液:精密稱取木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體(10%載藥量)2.5 g,置于50 mL量瓶中,加入適量5 g·L-1CMC-Na水溶液,用蒸餾水稀釋至刻度,即得5 mg·mL-1的木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體溶液。

2.5.2血漿樣品的采集 取SD雄性大鼠10只,隨機分為2組,每組5只,實驗前12 h禁食但不禁水。分別以木犀草素混懸液和木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體混懸液單次灌胃給藥,給藥量為40 mg·kg-1。根據(jù)預實驗結果,分別于給藥前和給藥后5、15、30、60、120、240、360、480、720 min頸靜脈取血0.30 mL,置于肝素離心管中,以3 000 r·min-1離心5 min,取上層血漿冷凍備用。

2.5.3血漿樣品的預處理 取血漿100 μL,加入2 μg·mL-1內標(芹菜素)甲醇溶液20 μL,再加入100 μL 3 mol·L-1的稀鹽酸溶液,于80 ℃水浴鍋中加熱1.5 h,冷卻后加入1 mL乙酸乙酯,渦旋振蕩1 min,以3 000 r·min-1離心10 min,取1 mL上清液,氮氣吹干,100 μL流動相復溶,以12 000 r·min-1離心10 min,取上清液進樣分析。

2.5.4色譜條件 色譜柱為Tianhe C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為乙腈-甲醇-體積分數(shù)0.05%磷酸(30∶5∶65);流速為1.0 mL·min-1;檢測波長為254 nm;進樣量為20 μL;柱溫為30 ℃。

3 結果

木犀草素、物理混合物及木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的PXRD圖見圖1。由圖1可見,木犀草素在2θ為12.68°、14.04°、15.81°、21.37°、25.40°、26.16°、27.38°、28.40°處具有較強的特征衍射峰,而在木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體PXRD圖中木犀草素的特征衍射峰消失,物理混合物在2θ為12.68°、14.04°、15.81°、21.37°、26.16°處有較強的木犀草素特征衍射峰,表明木犀草素以無定形狀態(tài)或分子形式分散于載體材料中。

圖1 木犀草素、物理混合物及木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的PXRD圖

木犀草素、物理混合物及木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的DSC曲線見圖2。由圖2可見,木犀草素的熔融峰在350 ℃;在木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體DSC曲線中,木犀草素熔融峰消失,只在載體和木犀草素之間出現(xiàn)一個熔融峰,表明木犀草素與載體在固體分散體中形成共熔體,并以無定形狀態(tài)或分子形式分散于載體材料中。物理混合物在190 ℃左右出現(xiàn)吸熱峰,而木犀草素熔融峰消失,這可能是因為載體PEG 400和PVP k30熔融后,木犀草素溶解在二者的熔融液中;在固體分散體的制備過程中,木犀草素在85 ℃時能溶解在PEG 400中也證實了這一點。

圖2 物理混合物、木犀草素及木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的DSC曲線

在水溶性介質中,木犀草素在4 h內達平衡時的溶解度僅為0.60 μg·mL-1,溶出率僅為2.41%。相比之下,木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體中的木犀草素在30 min達到平衡時,溶解度為25.06 μg·mL-1,約為木犀草素的40倍,溶出率高達100%。物理混合物的溶解度僅為4.03 μg·mL-1左右,溶出率僅為16%。物理混合物的溶解度和溶出率高于木犀草素,可能是由于水溶性載體PEG 400和PVP k30改善了木犀草素的潤濕性。以上結果表明,固體分散體可顯著改善木犀草素的溶出速度和溶解度,使其具有更快的釋放速度和更大的溶出率。結果見圖3。

圖3 木犀草素、物理混合物和木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的溶出曲線(n=5)

用HPLC法測定木犀草素在大鼠血漿樣品中的質量濃度。結果表明,芹菜素的保留時間為16.05 min,木犀草素的保留時間為9.67 min,血漿樣品中芹菜素和木犀草素的主峰保留時間與對照溶液中的保留時間一致;在該色譜條件下,血漿中的內源性雜質不影響木犀草素和芹菜素的測定,且具有較好的分離度,見圖4。木犀草素在0.01～5.00 μg·mL-1范圍內線性關系良好,線性回歸方程為y=0.907 2x+0.010 6(r=0.999 5)。檢測限為0.20 ng(信噪比為S/N=3),定量限為1.00 ng(信噪比為S/N=10)。低、中、高3個質量濃度(0.05、1.00、5.00 μg·mL-1)的回收率分別為114.20%、96.42%、105.31%,RSD值分別為9.42%、5.41%、6.25%。低、中、高3個質量濃度的溶液室溫放置24 h、凍融循環(huán)以及-20 ℃放置30 d內藥物在血漿中的穩(wěn)定性良好,回收率在94.81%～108.25%范圍內,RSD值小于5.57%。

注:1.木犀草素;2.芹菜素。

木犀草素和木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的藥時曲線見圖5。由圖5可見,木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的達峰濃度(Cmax)藥時曲線下面積(AUC)均顯著大于木犀草素原料藥。用DAS 2.0藥動學軟件包自動擬合數(shù)據(jù),主要藥動學參數(shù)見表1。由表1可見,木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的達峰時間(tmax)為28.12 min,Cmax為3.01 μg·min-1,是木犀草素原料藥Cmax的5倍,表明木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體在體內能快速釋放和溶出,且體內吸收較快。木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的AUC0→12 h為(1.74±0.44) min·mg·mL-1,顯著高于木犀草素原料藥,相對生物利用度為915.82%。體外溶出度結果顯示,固體分散體能明顯提高木犀草素的溶解度和溶出速率,而體內藥動學結果表明,固體分散體能促進木犀草素在體內的吸收,生物利用度顯著提高,表明木犀草素的溶解和溶出是其在體內吸收的限速步驟,固體分散體是改善木犀草素溶解性和體內生物利用度的有效方法。

表1 木犀草素和木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體在大鼠體內藥代動力學參數(shù)(n=5)

圖5 木犀草素和木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體的藥時曲線(n=5)

4 討論

固體分散體的制備工藝有熔融法、溶劑法、溶劑-熔融法、研磨法和熱熔擠出法等。鄧向濤等[16]和吳春等[17]用溶劑法、溶劑-熔融法制備木犀草素-PVP k30固體分散體,提高木犀草素的溶出度和生物利用度。但是,以乙醇為溶劑制備固體分散體,易導致藥物重結晶,使分散度下降,且乙醇揮發(fā)會污染環(huán)境。木犀草素為黃酮類化合物,具有較多的羥基,在PEG 400中有較好的溶解度,因此本文以PEG 400作為溶劑,采用溶劑-熔融法制備木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體,使用該方法完全可以避免環(huán)境污染和析晶問題。此外,PEG 400不用除去,而作為固體分散體載體成分,可以起到增塑作用,降低PVP k30玻璃轉變溫度,不僅可以降低制備過程中的熔融溫度,還可提高固體分散體的穩(wěn)定性。體外溶出實驗和體內藥動學結果顯示,木犀草素-PEG 400/PVP k30固體分散體在體內能快速釋放和溶出,且體內吸收速度較快,能極大地改善木犀草素的體內生物利用度,表明以PEG 400作為溶劑,用溶劑-熔融法制備固體分散體是改善木犀草素溶解度和生物利用度的有效方法。