嵇成鋒,王 琛,張和香,田春銘

淮安市康復(fù)醫(yī)院心血管內(nèi)科,淮安 211600

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MI/RI)是心肌組織長時(shí)間缺血再恢復(fù)血液灌流,但恢復(fù)血液灌流會進(jìn)一步加重心肌損傷和功能失常[1]。丹參是我國傳統(tǒng)中藥,二氫丹參酮是丹參的主要活性成分之一,具有抗炎、抗腫瘤和增強(qiáng)細(xì)胞自噬等多種生物活性[2-4]。丹參酮IIA預(yù)處理可減少中性粒細(xì)胞浸潤,縮小心肌梗死面積,改善MI/RI損傷[5]。本研究用冠狀動脈左前降支結(jié)扎法建立MI/RI模型,探討二氫丹參酮對MI/RI損傷的改善作用,以及對NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3(NOD-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3)/半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)的調(diào)節(jié)作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ALC-V8S型小動物呼吸機(jī)(上海奧爾科特生物科技有限公司);7080型全自動生化分析儀(日本日立公司);Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher公司);DYCZ-24KS電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 試藥

二氫丹參酮(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%,上海源葉生物科技有限公司,批號B50031);肌酸激酶(creatine kinase,CK,批號H197-1-2)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH,批號A020-2-2)和肌鈣蛋白(cardiac troponin I,cTnI,批號H149-2)試劑盒,均購自南京建成生物工程研究所;腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α,批號SP10205)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6,批號SP10234)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β,批號SP10180)ELISA試劑盒,均購自武漢賽培生物科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒(批號P0010,上海碧云天生物科技有限公司);NLRP3(批號ab263899)、caspase-1(批號ab179515)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Blymphoblastoma-2 gene,Bcl-2,批號ab241548)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax,批號ab270742)以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH,批號ab8245)抗體均購自美國Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠,60只,8周齡,體質(zhì)量為180～200 g,購自北京北科華夏生物醫(yī)藥科技有限公司,許可證號為SYXK(京)2017～0044。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后用于實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 造模與給藥

將60只大鼠用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、低劑量組、高劑量組和陽性對照組,每組12只,低劑量組大鼠灌胃10 mg·kg-1二氫丹參酮,高劑量組大鼠灌胃25 mg·kg-1二氫丹參酮,陽性對照組大鼠灌胃尼莫地平20 mg·kg-1,假手術(shù)組和模型組灌胃生理鹽水,連續(xù)灌胃14 d后,進(jìn)行造模[6]。

除假手術(shù)組大鼠外,其余組大鼠通過結(jié)扎冠狀動脈左前降支建立MI/RI損傷模型。戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠,固定于操作臺上,切開頸部皮膚,進(jìn)行氣管插管,連接小動物呼吸機(jī)。沿胸骨左緣第3～4肋間,切開皮膚和肌肉層,暴露心臟,用0號縫合線結(jié)扎冠狀動脈左前降支,以ST段抬高、心肌由紅色變成灰白色為造模成功,30 min后,打開結(jié)扎線,灌注120 min。假手術(shù)組大鼠僅打開胸腔,掛線,但不結(jié)扎。

2.2 心肌損傷指標(biāo)的檢測

灌注120 min后,取動脈血6 mL,靜置30 min,離心后取上清,用全自動生化分析儀檢測CK、LDH和cTnI的質(zhì)量濃度。

2.3 心肌梗死面積所占百分比的測定

采血完成后,取出心臟,沿心尖至心基底部切取厚度為2 mm左右的心肌組織薄片,置于加熱后的TTC溶液中孵育20 min,用Image J分析梗死心肌面積,灰白色為梗死區(qū),正常心肌被染成紅色。心肌梗死面積所占百分比(%)=(梗死區(qū)面積/心肌總面積)×100%。

2.4 炎性指標(biāo)的檢測

剪取部分心尖組織置于EP管中,勻漿,離心后取上清。根據(jù)試劑盒說明書將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋,隨后依次加入樣品,封板后置于37 ℃恒溫箱中孵育30 min,洗滌液洗滌5次,甩干,加入酶標(biāo)抗體,封板孵育30 min,按照上述洗滌步驟洗滌,加入顯色劑,避光孵育15 min,測定吸光度(A)值。

2.5 心肌細(xì)胞病理損傷的檢測

取部分心肌組織,多聚甲醛固定,脫水、包埋、切片、烘片,二甲苯透明,乙醇脫水,按照HE染色試劑盒說明書進(jìn)行染色。

2.6 心肌細(xì)胞凋亡率的測定

取4 μm厚的石蠟切片,二甲苯脫蠟,梯度乙醇復(fù)水,PBS沖洗,將切片置于TUNEL溶液中1 h,之后進(jìn)行DAB顯色,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察,凋亡細(xì)胞呈黃褐色,每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野,計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率。心肌細(xì)胞凋亡率(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量)×100%。

2.7 心肌細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平的測定

取心肌組織,研磨,裂解,離心,取上清液,測蛋白質(zhì)量濃度,煮沸變性。120 V電泳2 h,0.3 A恒流濕轉(zhuǎn),封閉1 h,4 ℃冰箱中NLRP3、caspase-1、Bax、Bcl-2以及GAPDH抗體孵育,二抗室溫孵育1 h,顯色,Image J分析條帶灰度值。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 心肌損傷指標(biāo)測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較,模型組CK、LDH和cTnI濃度升高(P<0.05);與模型組比較,其他3組CK、LDH和cTnI濃度降低(P<0.05);與二氫丹參酮低劑量組比較,二氫丹參酮高劑量組CK、LDH和cTnI濃度降低(P<0.05);與二氫丹參酮高劑量組比較,陽性對照組CK、LDH和cTnI濃度降低(P<0.05)。見表1。

表1 大鼠血清中CK、LDH和cTnI水平的比較

3.2 心肌梗死面積所占百分比測定結(jié)果

與模型組比較,其他3組心肌梗死面積所占百分比降低(P<0.05);與二氫丹參酮低劑量組比較,二氫丹參酮高劑量組心肌梗死面積所占百分比降低(P<0.05);與二氫丹參酮高劑量組比較,陽性對照組心肌梗死面積所占百分比降低(P<0.05)。見表2。

表2 大鼠心肌梗死面積所占百分比的比較

3.3 炎癥因子測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較,模型組IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高(P<0.05);與模型組比較,其他3組IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低(P<0.05);與二氫丹參酮低劑量組比較,二氫丹參酮高劑量組IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低(P<0.05);與二氫丹參酮高劑量組比較,陽性對照組IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 大鼠心肌組織中炎癥因子表達(dá)水平的比較

3.4 大鼠心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化

假手術(shù)組大鼠心肌纖維排列整齊、致密,模型組大鼠心肌纖維出現(xiàn)斷裂、排列紊亂,間隙增寬;二氫丹參酮低劑量、二氫丹參酮高劑量組和陽性對照組大鼠病理損傷不同程度減輕。見圖1。

注:A.假手術(shù)組;B.模型組;C.二氫丹參酮低劑量組;D.二氫丹參酮高劑量組;E.陽性對照組。

3.5 心肌細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較,模型組心肌細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);與模型組比較,其他3組心肌細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與二氫丹參酮低劑量組比較,二氫丹參酮高劑量組心肌細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05);與二氫丹參酮高劑量組比較,陽性對照組心肌細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。見表4、圖2。

注:A.假手術(shù)組;B.模型組;C.二氫丹參酮低劑量組;D.二氫丹參酮高劑量組;E.陽性對照組。

表4 大鼠心肌細(xì)胞凋亡率的比較

3.6 心肌組織中蛋白測定結(jié)果

與假手術(shù)組比較,模型組NLRP3、Bax和caspase-1蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05);與模型組比較,其他3組NLRP3、Bax和caspase-1蛋白水平降低,Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05);與二氫丹參酮低劑量組比較,二氫丹參酮高劑量組NLRP3、Bax和caspase-1蛋白水平降低,Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05);與二氫丹參酮高劑量組比較,陽性對照組NLRP3、Bax和caspase-1蛋白水平降低,Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05)。見表5、圖3。

注:A.假手術(shù)組;B.模型組;C.二氫丹參酮低劑量組;D.二氫丹參酮高劑量組;E.陽性對照組。

表5 大鼠心肌組織中NLRP3、Bax、caspase-1和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的比較

4 討論

CK、LDH及cTnI是反映心肌損傷的重要指標(biāo),本研究中模型組CK、LDH及cTnI水平升高,表明冠狀動脈左前降支結(jié)扎造成大鼠心肌損傷,而不同劑量二氫丹參酮可降低CK、LDH及cTnI水平,表明二氫丹參酮可減輕心肌損傷程度。張偉等[7]報(bào)道稱冠心病大鼠CK、LDH以及cTnI水平升高,心肌損傷嚴(yán)重,與本研究結(jié)果一致。

此外,與模型組(23.27%±2.63%)比較,低劑量和高劑量二氫丹參酮顯著降低MI/RI大鼠心肌梗死面積所占百分比[(17.88%±2.76%)、(11.75%±1.97%)];模型組心肌細(xì)胞凋亡率(35.10%±4.35%)顯著高于二氫丹參酮低劑量、高劑量組[(27.72%±3.80%),(18.62%±1.94%)]。病理學(xué)結(jié)果同樣顯示,二氫丹參酮可顯著改善MI/RI大鼠心肌組織病理形態(tài)改變。以上結(jié)果表明二氫丹參酮對MI/RI引起的心肌損傷具有保護(hù)作用。研究表明,二氫丹參酮在阿霉素引起的心臟毒性和缺血再灌注引起的心肌損傷中均具有保護(hù)作用[8-9]。由此可見,二氫丹參酮有可能成為MI/RI損傷的潛在治療藥物。

炎癥反應(yīng)是MI/RI損傷的重要病理特征,貫穿于MI/RI損傷的全過程,其水平在一定程度上可反映MI/RI損傷的嚴(yán)重程度[10]。GE X等[11]研究表明,MI/RI誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞外囊泡具有促炎特征,會進(jìn)一步加重心臟損傷。三苦滴丸通過降低MI/RI損傷后的炎癥反應(yīng)可提高心肌對抗MI/RI損傷的能力[12]。葛根素通過降低炎癥反應(yīng),對MI/RI損傷具有保護(hù)作用[13]。尿激酶原可降低MI/RI損傷大鼠的炎癥反應(yīng),改善大鼠心功能[14]。因此,炎癥反應(yīng)可能成為治療MI/RI損傷的重要途徑之一。而二氫丹參酮具有顯著的抗炎作用,FENG J等[15]研究表明,二氫丹參酮在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型中發(fā)揮抗炎作用。在本研究中模型組大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α含量顯著升高,而低劑量和高劑量二氫丹參酮組IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著降低,表明二氫丹參酮可降低MI/RI損傷大鼠的炎癥反應(yīng)。

NLRs受體家族成員在宿主先天性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,可特異性識別胞質(zhì)內(nèi)病原相關(guān)分子,NLRP3是目前該家族成員中研究最多的炎性小體,NLRP3激活后,可以使pro-caspase-1裂解為有活性的cleaved caspase-1,從而促進(jìn)炎癥因子前體成熟[16-18]。研究發(fā)現(xiàn),IP3R1通過NLRP3/caspase-1途徑調(diào)控MI/RI損傷中Ca2 +的轉(zhuǎn)運(yùn)和細(xì)胞焦亡,從而發(fā)揮心臟保護(hù)作用[19]。WEI X等[20]研究表明miR-703通過抑制NLRP3/caspase-1介導(dǎo)的焦亡作用來保護(hù)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果顯示,模型組NLRP3、caspase-1和Bax蛋白相對表達(dá)量升高,Bcl-2蛋白相對表達(dá)量降低;與模型組比較,二氫丹參酮低劑量、二氫丹參酮高劑量組和陽性對照組NLRP3、caspase-1和Bax蛋白量降低,Bcl-2蛋白量升高。結(jié)果表明,二氫丹參酮可抑制NLRP3/caspase-1信號通路。

綜上所述,二氫丹參酮可改善MI/RI大鼠心肌損傷,減輕心肌梗死,抑制心肌炎癥反應(yīng)和心肌細(xì)胞凋亡,其可能是通過抑制NLRP3/caspase-1信號通路發(fā)揮調(diào)控作用。