任君浩,朝 博,王 飛,武 強(qiáng)

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,呼和浩特 010059

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,好發(fā)于兒童、青年、中年人群。研究表明,威靈仙總皂苷具有抗炎以及促進(jìn)軟骨缺損修復(fù)等作用[1-2],在食管鱗癌、肝癌、口腔癌以及胃癌中均發(fā)揮抗癌作用[3]。miR-410-3p與結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤有關(guān)[4-5]。而本課題組在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR-410-3p在腦膠質(zhì)瘤中處于低表達(dá)水平。第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten/protein kinase B/mammalian target of rapamycin, PTEN/Akt/mTOR)信號(hào)通路是重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖和代謝等過(guò)程,研究表明,PTEN/Akt/ mTOR信號(hào)通路參與調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[6]。本研究主要探討威靈仙總皂苷對(duì)U87細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

5430R型高速冷凍離心機(jī)(上海艾研生物科技有限公司);DNP-9016二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(上海鉑溫儀器有限公司);Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 試藥

威靈仙總皂苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥91.3%,批號(hào)PCS3247,成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司);引物序列由上海生工生物工程研究所合成;轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體lipofectamine 3000(批號(hào)L3000075,北京諾為生物技術(shù)有限公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)RR037A,北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司);雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(批號(hào)RG027,上海碧云天生物科技有限公司);CCK-8試劑盒(批號(hào)CA1210,北京索萊寶科技有限公司);PTEN(批號(hào)ab267787)、p-Akt(批號(hào)ab8805)、Akt(批號(hào)ab18785)、p-mTOR(批號(hào)ab109268)以及mTOR(批號(hào)ab134903)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH,批號(hào)ab8245)抗體,均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 細(xì)胞系

膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87(美國(guó)ATCC公司)。

2 方法

2.1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率

細(xì)胞復(fù)蘇、常規(guī)培養(yǎng)、傳代,取第3代細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,并接種于培養(yǎng)板,培養(yǎng)24 h后,每孔加入0、10、20、30、40、50 μmol·L-1威靈仙總皂苷,每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。1 d后每孔加入工作液10 μL,避光孵育4 h,檢測(cè)吸光度(A)值。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

取第3代細(xì)胞懸液接種于96孔板中,將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、NC組、inhibitor組和inhibitor聯(lián)合威靈仙總皂苷組,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,除對(duì)照組外,其余組分別轉(zhuǎn)染miR-410-3p NC和miR-410-3p inhibitor。miR-410-3p inhibitor聯(lián)合威靈仙總皂苷組轉(zhuǎn)染24 h后加入40 μmol·L-1威靈仙總皂苷處理24 h。

2.3 qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞中miR-410-3p的表達(dá)水平

按照2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞分組和處理,24 h后,預(yù)冷PBS清洗3次,離心,收集細(xì)胞,提取RNA,嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作,2-△△CT法計(jì)算miR-410-3p表達(dá)水平,引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2.4 細(xì)胞存活率的檢測(cè)

24 h后,按照2.1項(xiàng)下的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 細(xì)胞遷移數(shù)量的檢測(cè)

按照2.2項(xiàng)下的方法進(jìn)行細(xì)胞分組和處理,24 h后,將細(xì)胞接種于6孔板中,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后,在板底部均勻劃線,清除細(xì)胞碎片,分別在劃線0 h和24 h在顯微鏡下觀察并拍照,測(cè)定劃痕寬度,計(jì)算劃痕愈合率(%)。

2.6 細(xì)胞侵襲數(shù)量的檢測(cè)

按照2.2項(xiàng)下的方法進(jìn)行細(xì)胞分組和處理,24 h后,將細(xì)胞懸液100 μL加入鋪有基質(zhì)膠的上室中,下室中加入完全培養(yǎng)基,重新培養(yǎng)24 h,取出后將上室未侵襲的細(xì)胞去除,固定,染色,清洗,晾干,顯微鏡下觀察,計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)量。

2.7 miR-410-3p與PTEN靶向關(guān)系的檢測(cè)

用Targetscan軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè),構(gòu)建野生型(WT)-PTEN和突變型(Mut)-PTEN雙熒光素酶報(bào)告載體,將2種載體、miR-410-3p mimic和miR-410-3p NC共同轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞,48 h后,測(cè)定熒光素酶活性。

2.8 各蛋白相對(duì)表達(dá)量的檢測(cè)

按照2.2項(xiàng)下的方法進(jìn)行細(xì)胞分組和處理,24 h后,取細(xì)胞裂解,離心,取上清,試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)量濃度。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的凝膠電泳,濕轉(zhuǎn),洗膜,室溫封閉,PTEN、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR以及GAPDH抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜3次,二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h,ECL顯影,Image J分析條帶灰度值。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 不同濃度威靈仙總皂苷對(duì)細(xì)胞存活率的影響

細(xì)胞存活率組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與0 μmol·L-1組比較,其他濃度組細(xì)胞存活率均降低,且具有劑量依賴性(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組細(xì)胞存活率的比較

3.2 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果

與NC組比較,inhibitor組miR-410-3p表達(dá)水平降低(P<0.05);與inhibitor組比較,inhibitor聯(lián)合威靈仙總皂苷組miR-410-3p表達(dá)水平升高(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組細(xì)胞中miR-410-3p表達(dá)水平的比較

3.3 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果

與inhibitor組比較,inhibitor聯(lián)合威靈仙總皂苷組的細(xì)胞存活率降低(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞存活率的比較

3.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

與NC組比較,inhibitor組劃痕愈合率升高(P<0.05);與inhibitor組比較,inhibitor聯(lián)合威靈仙總皂苷組劃痕愈合率降低(P<0.05)。見(jiàn)表5、圖1。

注:A.對(duì)照組;B.NC組;C.inhibitor組;D.inhibitor聯(lián)合威靈仙總皂苷組。

表5 各組細(xì)胞劃痕愈合率的比較

3.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

與NC組比較,inhibitor組侵襲細(xì)胞數(shù)量增多(P<0.05);與inhibitor組比較,inhibitor聯(lián)合威靈仙總皂苷組侵襲細(xì)胞數(shù)量減少(P<0.05)。見(jiàn)表6、圖2。

注:A.對(duì)照組;B.NC組;C.inhibitor組;D.inhibitor聯(lián)合威靈仙總皂苷組。

表6 各組侵襲細(xì)胞數(shù)量的比較

3.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果

U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染W(wǎng)T PTEN和miR-410-3p mimic后,熒光素酶相對(duì)活性明顯降低。見(jiàn)圖3、表7。

圖3 miR-410-3p與PTEN的結(jié)合位點(diǎn)和突變位點(diǎn)

表7 熒光素酶相對(duì)活性

3.7 蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果

與NC組比較,inhibitor組p-Akt和p-mTOR蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高,PTEN蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05);與inhibitor組比較,inhibitor聯(lián)合威靈仙總皂苷組p-Akt和p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量降低,PTEN蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.05);對(duì)照組和NC組PTEN、p-Akt和p-mTOR蛋白相對(duì)表達(dá)量比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表8、圖4。

注:A.對(duì)照組;B.NC組;C.inhibitor組;D. inhibitor聯(lián)合威靈仙總皂苷組。

表8 各組細(xì)胞中蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

4 討論

膠質(zhì)瘤的難治性主要表現(xiàn)在癌細(xì)胞自身具有較強(qiáng)的增殖、遷移和侵襲能力[7]。目前,主要用手術(shù)切除和化療等治療手段,但長(zhǎng)期使用化療藥物易出現(xiàn)耐藥性,使得治療效果不理想[8]。因此,尋找新的有效治療膠質(zhì)瘤的藥物至關(guān)重要。近年來(lái),中藥在治療膠質(zhì)瘤中的作用受到廣泛關(guān)注,白藜蘆醇通過(guò)抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲促進(jìn)凋亡[9]。威靈仙是我國(guó)傳統(tǒng)中藥,具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、化痰和消積等功效,威靈仙總皂苷是其主要活性成分之一。本研究用不同劑量威靈仙總皂苷處理膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞,結(jié)果顯示細(xì)胞存活率隨威靈仙總皂苷濃度的升高而降低,且具有劑量依賴性。近年來(lái),miR-410-3p在腫瘤中的作用受到廣泛關(guān)注,舒芬太尼可通過(guò)上調(diào)miR-410-3p的表達(dá)從而減弱膀胱癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。miR-410-3p在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá),可增強(qiáng)骨肉瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的敏感性,降低耐藥性,從而抑制癌細(xì)胞增殖[11]。

miR-410-3p表達(dá)上調(diào)可抑制橫紋肌肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[12]。miR-410-3p表達(dá)上調(diào)可增強(qiáng)黑色素瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[13]。為進(jìn)一步探討威靈仙總皂苷是否能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-410-3p的表達(dá)參與調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物活性,本研究通過(guò)在U87細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染miR-410-3p inhibitor后,miR-410-3p表達(dá)下調(diào),表明成功降低miR-410-3p的表達(dá)量,而用威靈仙總皂苷則可使miR-410-3p的表達(dá)量增加。miR-410-3p表達(dá)降低有利于細(xì)胞存活、遷移和侵襲,而用威靈仙總皂苷處理后,細(xì)胞存活率和劃痕愈合率降低,侵襲細(xì)胞數(shù)量減少。結(jié)果表明,威靈仙總皂苷可上調(diào)miR-410-3p的表達(dá),抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

PTEN是一個(gè)編碼雙重特異性磷酸酶活性產(chǎn)物的抑癌基因,同時(shí)具有脂質(zhì)磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性,通過(guò)降低細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂速度,參與調(diào)控細(xì)胞分裂周期[14]。Akt在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和代謝方面發(fā)揮重要作用,一旦細(xì)胞受到外界刺激,Akt將被PI3K激活,進(jìn)而活化下游mTOR信號(hào)[15-16]。PTEN通過(guò)負(fù)調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路,在多種腫瘤中發(fā)揮抗癌作用[17]。WANG B等[18]研究發(fā)現(xiàn),ACK1通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN/Akt/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)肝癌的發(fā)生、發(fā)展。沒(méi)食子兒茶素通過(guò)降低卵巢癌細(xì)胞中PTEN的表達(dá)量,升高p-Akt和p-mTOR的表量達(dá),從而抑制SKOV3細(xì)胞的增殖活性,但PTEN抑制劑可消除其抑癌作用[19]。 GAO S等[20]研究表明miR-146b通過(guò)靶向PTEN/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制前列腺癌自噬,在治療前列腺癌中具有潛在的應(yīng)用前景。本研究證實(shí)miR-410-3p可靶向作用于PTEN。此外,miR-410-3p的表達(dá)下調(diào)后,細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)量降低,p-Akt和p-mTOR蛋白的表達(dá)量升高;給予威靈仙總皂苷上調(diào)miR-410-3p的表達(dá)后,細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)量升高,p-Akt和p-mTOR蛋白的表達(dá)量降低。結(jié)果表明,miR-410-3p參與調(diào)節(jié)PTEN/Akt/mTOR信號(hào)通路。

綜上所述,威靈仙總皂苷可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲,其可能是通過(guò)調(diào)節(jié)miR-410-3p介導(dǎo)的PTEN/Akt/mTOR信號(hào)通路發(fā)揮作用,為臨床治療膠質(zhì)瘤提供理論依據(jù)。