張建波,張亞奇,吳啟英

聯(lián)勤保障部隊(duì)第九二八醫(yī)院五官科,海口 571101

喉癌是常見的頭頸部鱗狀細(xì)胞癌,具有高度侵襲和轉(zhuǎn)移能力,目前對喉癌的發(fā)病機(jī)制尚不清楚[1]。多項(xiàng)研究表明,黃芪甲苷具有抗腫瘤作用,黃芪甲苷可抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的活性,促進(jìn)凋亡蛋白表達(dá)[2]。此外,黃芪甲苷可抑制黑色素瘤B16細(xì)胞增殖,促進(jìn)凋亡蛋白表達(dá)[3]。Apelin是G蛋白偶聯(lián)受體APJ的內(nèi)源性配體,Apelin/APJ信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)血管生成相關(guān)因子促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移和侵襲[4]。APJ高表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力[5]。本研究用不同濃度黃芪甲苷處理Hep-2細(xì)胞,探討黃芪甲苷對Hep-2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高速冷凍離心機(jī)(美國Bio-Rad公司);Attune NxT型流式細(xì)胞儀(美國賽默飛世爾公司);PCR擴(kuò)增儀(美國BD公司)。

1.2 試藥

黃芪甲苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%,批號(hào)84687-43-4,西安天廣源生物科技有限公司);胎牛血清(批號(hào)C0234)、DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)11330032)均購自美國Gibco公司;Transwell小室(批號(hào)3450,北京明陽科華生物科技有限公司);基質(zhì)膠(批號(hào)CC3210,江蘇百克賽斯生物科技有限公司);SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒(批號(hào)WBK508-01,上海詠科生物科技有限公司);TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)D1802,上海雅吉生物科技有限公司);二辛可酸(BCA)蛋白定量試劑盒(批號(hào)zy61003RE,上海澤葉生物科技有限公司);甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH,批號(hào)ab8245)、內(nèi)源性配體(Apelin)(批號(hào)ab125213)和G蛋白偶聯(lián)受體(APJ)(批號(hào)ab6721)抗體均購自美國Abcam公司。

1.3 細(xì)胞系

人喉癌Hep-2細(xì)胞購自美國ATCC公司,培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基中,每天更換1次培養(yǎng)基,每2 d進(jìn)行1次胰蛋白酶消化傳代。

2 方法

2.1 細(xì)胞增殖活性的測定

將Hep-2細(xì)胞接種于96孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,用不同濃度(0、20、 40、80 μmol ·L-1)黃芪甲苷溶液處理細(xì)胞24 h,取出培養(yǎng)板,每孔加入20 μL MTT溶液培養(yǎng)4 h,棄掉培養(yǎng)液,預(yù)冷磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞2次,每孔加入150 μL 二甲基亞砜(DMSO)振蕩混勻10 min,測定吸光度(A)值。

2.2 細(xì)胞凋亡率的測定

用不同濃度(0、20、40、80 μmol·L-1)黃芪甲苷溶液處理細(xì)胞24 h后,棄掉培養(yǎng)液,離心,收集細(xì)胞,加入500 μL 結(jié)合緩沖液吹打混勻,取100 μL細(xì)胞懸液加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V 孵育10 min,加入碘化丙啶孵育15 min。用流式細(xì)胞儀和Flowjo軟件分析細(xì)胞凋亡率。

2.3 遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)量的測定

侵襲細(xì)胞數(shù)量的檢測:將用不同濃度黃芪甲苷溶液處理后的Hep-2細(xì)胞制成密度為5×105個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液,取200 μL添加至鋪滿基質(zhì)膠的Transwell上室中,下室中加入完全培養(yǎng)基600 μL,培養(yǎng)24 h后,去除培養(yǎng)基,固定,用濕棉簽去除多余未穿膜的細(xì)胞,染色,于顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)量。

遷移細(xì)胞數(shù)量的檢測:除Transwell小室上室中不鋪基質(zhì)膠外,其余操作步驟同上。

2.4 Apelin和APJ蛋白相對表達(dá)量的測定

收集經(jīng)不同濃度黃芪甲苷溶液處理后的Hep-2細(xì)胞,裂解,取上清液,測定蛋白質(zhì)量濃度,煮沸。每個(gè)上樣孔中加入蛋白樣品20 μg,聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì),用濕轉(zhuǎn)法將蛋白濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,洗膜,室溫封閉1 h,抗體孵育過夜,二抗室溫孵育,顯色,Image J分析條帶灰度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 黃芪甲苷對細(xì)胞存活率的影響

細(xì)胞存活率隨黃芪甲苷濃度的增加逐漸降低,且具有濃度依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞存活率的比較

3.2 黃芪甲苷對細(xì)胞凋亡率的影響

細(xì)胞凋亡率隨黃芪甲苷濃度的增加逐漸升高,且具有濃度依賴性(P<0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞凋亡率的比較

3.3 黃芪甲苷對細(xì)胞遷移能力的影響

遷移細(xì)胞數(shù)量隨黃芪甲苷濃度的增加逐漸減少,且具有濃度依賴性(P<0.05)。見表3、圖1。

注:A.黃芪甲苷0 μmol·L-1組;B.黃芪甲苷20 μmol·L-1組;C.黃芪甲苷40 μmol·L-1組;D.黃芪甲苷80 μmol·L-1組。

表3 各組遷移細(xì)胞數(shù)量的比較

3.4 黃芪甲苷對細(xì)胞侵襲能力的影響

侵襲細(xì)胞數(shù)量隨黃芪甲苷濃度的增加逐漸減少,且具有濃度依賴性(P<0.05)。見圖2、表4。

注:A.黃芪甲苷0 μmol·L-1組;B.黃芪甲苷20 μmol·L-1組;C.黃芪甲苷40 μmol·L-1組;D.黃芪甲苷80 μmol·L-1組。

表4 各組侵襲細(xì)胞數(shù)量的比較

3.5 黃芪甲苷對Apelin/APJ信號(hào)通路的影響

Apelin和APJ的蛋白相對表達(dá)量隨黃芪甲苷濃度的增加逐漸降低,且具有濃度依賴性(P<0.05)。見表5、圖3。

注:A.黃芪甲苷0 μmol·L-1組;B.黃芪甲苷20 μmol·L-1組;C.黃芪甲苷40 μmol·L-1組;D.黃芪甲苷80 μmol·L-1組。

表5 各組細(xì)胞中Apelin和APJ蛋白相對表達(dá)量的比較

4 討論

喉癌的發(fā)病具有隱匿性,多數(shù)患者就診時(shí)已處于中晚期,常采用手術(shù)切除和放、化療等進(jìn)行治療,但是由于耐藥性的出現(xiàn)常使患者治療效果不佳,且術(shù)后5年生存率較低,復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移發(fā)生率較高,嚴(yán)重威脅患者的生命健康,給社會(huì)和醫(yī)療帶來沉重負(fù)擔(dān)[6-7]。

中藥因其來源廣、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)而被越來越多的學(xué)者關(guān)注。黃芪是我國傳統(tǒng)中藥材,具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降血糖以及強(qiáng)心降壓等作用[8],其含有黃芪多糖和黃芪甲苷等活性成分,黃芪多糖可通過調(diào)節(jié)線粒體自噬抑制肝癌細(xì)胞增殖,同時(shí)誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[9]。黃芪甲苷具有抗氧化、抗炎以及調(diào)節(jié)免疫等多種藥理活性[10-12]。黃芪甲苷對具有阿霉素多藥耐藥性的人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞具有良好的逆轉(zhuǎn)作用,能夠增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對化療藥物的敏感性[13]。黃芪甲苷通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制肝癌HepG2細(xì)胞生長,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,降低癌細(xì)胞遷移和侵襲能力[14]。

本研究用不同濃度黃芪甲苷處理Hep-2細(xì)胞后,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與0 μmol·L-1組比較,20 μmol·L-1組、40 μmol·L-1組、80 μmol·L-1組的細(xì)胞凋亡率逐漸升高,且具有濃度依賴性,表明黃芪甲苷可誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡,且黃芪甲苷濃度越大,細(xì)胞凋亡率越高。MTT法檢測細(xì)胞存活率,結(jié)果顯示,與0 μmol·L-1組比較,20 μmol·L-1組、40 μmol·L-1組、80 μmol·L-1組細(xì)胞的存活率逐漸降低,且具有濃度依賴性,表明黃芪甲苷可抑制Hep-2細(xì)胞的增殖,且黃芪甲苷濃度越大,細(xì)胞增殖越緩慢。Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力,結(jié)果顯示,與0 μmol·L-1組比較,20 μmol·L-1組、40 μmol·L-1組和80 μmol·L-1組遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,且具有濃度依賴性,表明黃芪甲苷可降低Hep-2細(xì)胞遷移和侵襲能力。以上結(jié)果表明,黃芪甲苷可抑制喉癌Hep-2細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,降低癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。

Apelin/APJ系統(tǒng)是調(diào)節(jié)血管生成的重要信號(hào)因子,在促進(jìn)惡性腫瘤血管再生過程中具有重要作用,因此Apelin/APJ系統(tǒng)與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[15-18]。研究發(fā)現(xiàn),在肺腺癌中Apelin/APJ信號(hào)通路通過激活自噬誘導(dǎo)癌細(xì)胞遷移和侵襲[19]。CHEN T等[20]研究表明,Apelin13和APJ在結(jié)直腸癌中高表達(dá),抑制Apelin13表達(dá)可阻礙結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。本研究通過蛋白印跡法檢測發(fā)現(xiàn),與0 μmol·L-1組比較,20 μmol·L-1組、40 μmol·L-1組、80 μmol·L-1組Apelin和APJ蛋白的相對表達(dá)量降低,且具有濃度依賴性,表明黃芪甲苷可抑制Apelin/APJ信號(hào)軸的激活。

綜上所述,黃芪甲苷可抑制喉癌Hep-2細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡,降低癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力,其可能是通過抑制Apelin/APJ信號(hào)通路發(fā)揮作用,但是本研究仍存在不足,一方面對于Apelin/APJ信號(hào)通路發(fā)揮作用的具體機(jī)制需要深入研究;另一方面,本研究僅在體外探討黃芪甲苷對喉癌細(xì)胞的影響,下一步需要建立喉癌移植瘤小鼠模型,探討黃芪甲苷在體內(nèi)的作用。