戴冬艷,徐 佳,朱 靜,楊寶衛(wèi)

1. 泰州市藥品檢驗院,泰州 225300;2. 江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學院,淮安 223003

異甘草酸鎂(C42H60MgO16·4H2O)是第4代甘草酸制劑,是從天然植物甘草中提取的主要成分18β-甘草酸經(jīng)堿催化異構(gòu)化后成鹽精制而得[1]。異甘草酸鎂中所含有效成分是單一的18α-甘草酸,含量達到98%以上。研究發(fā)現(xiàn),18α-甘草酸的親脂性好,在胃腸道呈單體形式,易被吸收,因其結(jié)構(gòu)與潑尼松龍類似故更易與類固醇激素的靶細胞受體結(jié)合,且肝臟靶向性高。因此,與其他甘草酸制劑比較,異甘草酸鎂具有更強的抗生物氧化、抗炎、保護肝細胞膜和改善肝功能的作用[2],且未發(fā)現(xiàn)以往使用甘草酸制劑常見的水鈉潴留和血壓升高等不良反應(yīng)。甘草酸及異甘草酸鎂的化學結(jié)構(gòu)見圖1。

注:A.18-β甘草酸;B.18-α甘草酸;C.異甘草酸鎂。

由正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司獨家生產(chǎn)的異甘草酸鎂注射液的主要成分為異甘草酸鎂,溶劑為生理鹽水。臨床上用異甘草酸鎂注射液治療慢性乙型肝炎、肝硬化和藥物性肝損傷等各種肝臟疾病,也用于預(yù)防惡性腫瘤化療藥導(dǎo)致的肝損傷[3-6]。其執(zhí)行質(zhì)量標準為國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標準 WS1-(X-062)-2012Z,用高效液相色譜法測定異甘草酸鎂的含量,用滴定法測定生理鹽水中氯化鈉的含量[7]。

近年來關(guān)于異甘草酸鎂注射液的研究報道以藥理研究居多,少見關(guān)于質(zhì)量研究的報道。有研究用ICP-OES法測定異甘草酸鎂注射液中的鎂離子和鈉離子含量,從而換算成異甘草酸鎂和氯化鈉的含量[8],也有研究用高效液相色譜法測定異甘草酸鎂原料中的有關(guān)物質(zhì)[9]。近年來,離子色譜技術(shù)高速發(fā)展,其具有檢出限低、精密度高、線性范圍較寬和多元素同時測定等優(yōu)點,已被廣泛應(yīng)用于藥物中陰陽離子、氨基酸、糖類物質(zhì)的測定[10-14]。本實驗建立的方法以鎂、鈉陽離子為目標檢測物,供試品無需前處理,溶液直接測定,且一種方法能同時測定2種成分,方便、快捷。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Thermo ICS 6000離子色譜儀[配Dionex CERS 500(4 mm)抑制器、電導(dǎo)檢測器及甲烷磺酸(MSA)在線淋洗液發(fā)生器],購自Thermo Fisher公司;Milli-Q純水機(Millipore公司)。

1.2 試藥

鈉元素標準溶液(GSB 04-1738-2004,批號218009-1,質(zhì)量濃度為1 000 μg·mL-1)、鈣元素標準溶液(GSB 04-1720-2004,批號20A034-6,質(zhì)量濃度為1 000 μg·mL-1)、鎂元素標準溶液(GSB 04-1735-2004,批號20A001-5,質(zhì)量濃度為1 000 μg·mL-1)、鉀元素標準溶液(GSB 04-1733-2004,批號20A012-5,質(zhì)量濃度為1 000 μg·mL-1),均由國家有色金屬及電子材料分析測試中心提供;銨元素標準溶液(BW 0900,批號L451,質(zhì)量濃度為1 000 μg·mL-1),由北京海岸鴻蒙標準物質(zhì)技術(shù)有限責任公司提供;異甘草酸鎂注射液(批號:211103204、211107204、220112104,正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司);水為用Milli-Q純水系統(tǒng)制備的超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Dionex IonPacTMCS12A RFICTM分析柱(250 mm×4 mm,8 μm)和CG12A保護柱(50 mm×4 mm);淋洗液為20 mmol·L-1的甲烷磺酸溶液;抑制器為Dionex CERS 500(4 mm)[15];抑制電流為59 mA;流速為1.0 mL·min-1;電導(dǎo)檢測器;柱溫為30 ℃;檢測器溫度為35 ℃;進樣體積為25 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1系統(tǒng)適用性溶液 精密量取鈉、鎂、鉀、鈣與銨各單元素標準溶液3、0.2、0.2、0.3、0.1 mL置于100 mL量瓶中,用超純水稀釋制成每1 mL中分別含鈉30 μg、鎂2 μg、鉀2 μg、鈣3 μg、銨1 μg的混合溶液,作為系統(tǒng)適用性溶液[16]。

2.2.2標準儲備液 精密量取鎂元素標準溶液5 mL,置于50 mL量瓶中,用超純水稀釋并定容至刻度,制成100 μg·mL-1的鎂元素標準儲備液Ⅰ。精密量取100 μg·mL-1的鎂元素標準儲備液Ⅰ 10 mL,置于100 mL量瓶中,用超純水稀釋并定容至刻度,制成10 μg·mL-1的鎂元素標準儲備液Ⅱ。精密量取鈉元素標準溶液5 mL,置于50 mL量瓶中,用超純水稀釋并定容至刻度,制成100 μg·mL-1的鈉元素標準儲備液Ⅰ。

2.2.3系列對照品溶液 精密量取鎂元素標準儲備液Ⅰ 1、1、2、1、1、1 mL和鈉元素標準溶液2、2、3、1、1、1 mL,分別置于200、100、100、25、20、10 mL量瓶中,加超純水稀釋并定容至刻度,充分搖勻,制成每1 mL分別含鎂離子為0.5、1、2、4、5、10 μg及鈉離子10、20、30、40、50、100 μg的S1～S6系列對照品溶液。

2.2.4供試品溶液 精密量取異甘草酸鎂注射液1 mL,置于100 mL量瓶中,用超純水稀釋定容至刻度,充分搖勻,作為供試品溶液。

2.2.5空白溶液 以超純水作為空白溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性及專屬性實驗

取2.2.1項下的系統(tǒng)適用性溶液,按照2.1項色譜條件進樣測定,記錄色譜圖。見圖2。結(jié)果顯示,各陽離子理論塔板數(shù)均>2 000,分離度均≥1.5,各離子峰之間的分離度良好[17]。供試品溶液與對照品溶液色譜圖相同保留時間出現(xiàn)鎂離子、鈉離子色譜峰,且空白溶液在此位置不出峰,對測定結(jié)果無干擾。

注:A.空白溶液;B.系統(tǒng)適用性溶液; C.對照品溶液;D.供試品溶液;1.鈉離子;2.銨離子;3.鉀離子;4.鎂離子;5.鈣離子。

2.4 線性關(guān)系考察

取2.2.3項下的系列對照品溶液,按照2.1項下色譜條件進樣測定,記錄色譜圖,以鎂、鈉離子的質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(x)、峰面積為縱坐標(y)進行線性回歸,得鎂離子、鈉離子的線性方程分別為:y1=30.03x1-1.27,r=0.999 9;y2=16.38x2+6.64,r=0.999 8。結(jié)果表明鎂離子、鈉離子分別在0.5～10、10～100 μg·mL-1范圍內(nèi)與其峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實驗

取2.2.3項下的S3對照品溶液(鎂離子2 μg·mL-1、鈉離子30 μg·mL-1)連續(xù)進樣6次,記錄各組分的峰面積,鎂離子、鈉離子峰面積的RSD值分別為0.47%、0.43%,表明儀器的精密度良好。

2.6 重復(fù)性實驗

量取2.2.4項下制備同一批號(批號211103204)的供試品溶液6份進行測定,測得鎂離子、鈉離子的平均含量分別為141.89、3 623.67 μg·mL-1,RSD值分別為1.07%、0.78%,表明該方法的重復(fù)性良好[18]。

2.7 穩(wěn)定性實驗

取同一份供試品溶液(批號211103204)分別于0、1、2、4、10、20 h進樣測定,記錄峰面積,RSD值分別為1.73%、1.16%,表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收實驗

精密量取異甘草酸鎂注射液(批號21110304)5 mL,置于50 mL量瓶中,用超純水稀釋并定容至刻度,充分搖勻。精密量取1 mL置于20 mL量瓶中,同法量取9份,分別加入1、1.5、2 mL鎂元素標準儲備液Ⅱ(質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1)和2、3、4 mL鈉元素標準儲備液Ⅰ(質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1),用超純水稀釋并定容至刻度,搖勻,每個質(zhì)量濃度制備3份,得低、中、高3個質(zhì)量濃度的供試品溶液[19]。按照2.1項下色譜條件進樣測定,計算回收率。鎂離子、鈉離子的低、中、高3個質(zhì)量濃度的平均回收率(n=9)分別為100.29%、101.39%,RSD值分別為1.09%、1.09%,表明回收率良好,見表1。

表1 鎂離子、鈉離子回收率的測定結(jié)果

2.9 定量限和檢測限

取2.2.3項下的S1對照品溶液逐級稀釋,按照2.1項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積,當信噪比為10∶1時,得鎂離子、鈉離子的定量限(limit of quantification,LOQ)分別為0.123 4、0.117 4 μg·mL-1;當信噪比為3∶1時,得鎂離子、鈉離子的檢測限(limit of detection,LOD)分別為0.040 67、0.038 24 μg·mL-1。

2.10 方法耐用性

取系統(tǒng)適用性溶液,在改變淋洗液甲烷磺酸溶液的濃度±5 mmol·L-1、柱溫±5 ℃、流速±0.1 mL·min-1等條件下測定,各條件下,各陽離子的理論塔板數(shù)均>2 000,分離度均≥1.5。表明本方法的耐用性良好。

2.11 樣品測定

按上述方法對3批異甘草酸鎂注射液樣品進行測定,按標準曲線法定量,結(jié)果以鎂離子、鈉離子含量計;同時按照國家藥品標準WS1-( X-062)-2012Z中的方法用HPLC法測定3批樣品中的異甘草酸鎂含量、滴定分析法測定氯化鈉含量,并轉(zhuǎn)化成鎂離子、鈉離子含量,結(jié)果見表2。

表2 樣品中鎂離子、鈉離子含量的測定結(jié)果

3 討論

3.1 試劑的選擇

因為自然界中普遍存在鈉、鈣、鎂等離子,所以實驗試劑的選擇特別重要,本實驗直接選擇用水溶解、稀釋對照品和供試品,因此考察了實驗用水對鈉離子、鎂離子測定的影響[20]。結(jié)果顯示,本實驗所用的超純水在相應(yīng)的保留時間范圍內(nèi)不出現(xiàn)鎂離子、鈉離子色譜峰,對其測定無干擾。

3.2 色譜條件的選擇

本實驗考察了IonPac CS12、CS12A 2種型號的色譜柱,與CS12比較,CS12A樹脂上鍵合的功能基除了羧基外加入了膦酸基,增加了鈣離子、鎂離子的選擇性,更加適用于樣品中的鈉離子、銨離子、鉀離子、鎂離子和鈣離子的快速等度分離。最終選擇了IonPac CS12A色譜柱,以甲烷磺酸溶液為淋洗液?？疾觳煌鶞?25、30、35 ℃)、不同流速(0.9、1.0、1.1 mL·min-1)、不同淋洗液濃度(15、20、25 mmol·L-1)和不同的推薦抑制電流對各陽離子的分離效果,柱溫和流速對結(jié)果影響不大,甲磺酸淋洗液濃度越低時,各陽離子保留時間越長,結(jié)果顯示淋洗液濃度為20 mmol·L-1、流速為1.0 mL·min-1時,可使鈉離子、銨離子、鉀離子、鎂離子和鈣離子達到有效分離,且出峰時間適中[21]。

3.3 方法的比較

目前,異甘草酸鎂注射液的質(zhì)量標準僅收載于國家藥品標準WS1-(X-062)-2012Z,國外藥典未收載。本法測得的鎂離子、鈉離子含量和法定標準測得的異甘草酸鎂和氯化鈉換算出的鎂離子、鈉離子含量結(jié)果無明顯差異。本實驗用一種方法直接測定鎂離子、鈉離子含量,可以換算成異甘草酸鎂和氯化鈉含量,和法定標準中高效液相法和滴定法分別測定2種成分含量比較,本法操作更簡單、快速。本法用鎂、鈉元素標準溶液作為對照品,減少了對異甘草酸鎂對照品的需要量[22];實驗中的溶劑僅為超純水,無需使用有機溶劑,所用的淋洗液簡單、價廉、環(huán)保。

4 小結(jié)

本實驗建立了同時測定異甘草酸鎂注射液中鎂離子和鈉離子含量的離子色譜法,該方法具有較高的專屬性,前處理簡便、快速,測量結(jié)果準確,且多種成分可同時測定,可用于異甘草酸鎂注射液的質(zhì)量控制。本方法既適用于藥物中鈣離子、鎂離子、鈉離子等離子含量的快速測定,也適用于其雜質(zhì)離子的檢測。