徐 曉,徐 凱,鐘 貞

麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠, 珠海 519045

馬齒莧為馬齒莧科植物馬齒莧PortulacaoleraceaL.的干燥地上部分,具有清熱解毒、涼血止血、止痢的功效,用于治療熱毒血痢、癰腫疔瘡、濕疹、丹毒、蛇蟲(chóng)咬傷、便血、痔血及崩漏下血療效顯著[1]。馬齒莧應(yīng)用廣泛,具有抗炎、抑菌、降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫等作用[2],另外馬齒莧還有一定的營(yíng)養(yǎng)保健作用。馬齒莧藥源豐富,具有廣闊的開(kāi)發(fā)和利用前景。馬齒莧含有多種化學(xué)成分,主要含有香豆素類、有機(jī)酚酸類、黃酮類、生物堿類、萜類以及多糖、揮發(fā)油等成分[3-4]。因中藥材種屬來(lái)源復(fù)雜、成分間相互作用,其產(chǎn)品質(zhì)量直接影響中成藥制劑的質(zhì)量和臨床療效,因此有效控制中藥材的質(zhì)量是保證中醫(yī)臨床療效的前提。多組分定量控制[5]評(píng)價(jià)模式較單指標(biāo)控制能更全面地反映中藥的整體質(zhì)量?；瘜W(xué)計(jì)量學(xué)[6-7]通過(guò)對(duì)多變量數(shù)值進(jìn)行分組歸類,從多指標(biāo)變量中篩選主要指標(biāo),挖掘影響產(chǎn)品質(zhì)量的主要潛在標(biāo)志物;熵權(quán)-逼近理想解排序法(entropy weight-technique for order preference by similarity to an ideal solution,EW-TOPSIS)[8-9]將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理,通過(guò)計(jì)算各評(píng)價(jià)指標(biāo)與理想解之間的接近程度,對(duì)樣品的質(zhì)量?jī)?yōu)劣進(jìn)行排序,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于中藥材及其制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

本研究收集來(lái)自于四川、貴州、河南、遼寧、吉林5個(gè)省的18批馬齒莧,用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)對(duì)馬齒莧中有機(jī)酚酸類(檸檬酸、琥珀酸和咖啡酸等)、黃酮類(染料木苷、木犀草素和槲皮素等)、香豆素類成分(東莨菪亭、6,7-二羥基香豆素、異茴香內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯等)含量進(jìn)行同時(shí)測(cè)定,建立馬齒莧多組分定量控制評(píng)價(jià)模式,再用EW-TOPSIS法挖掘影響馬齒莧產(chǎn)品質(zhì)量的差異性標(biāo)志物,對(duì)不同產(chǎn)地來(lái)源的馬齒莧進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià),以期為馬齒莧有效性的綜合評(píng)價(jià)和內(nèi)在質(zhì)量的全面控制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司);XSR225型電子分析天平(瑞士梅特勒公司);KQ-250B型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

對(duì)照品:咖啡酸(批號(hào)110885-201703,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%)、染料木苷(批號(hào)111709-201702,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)、槲皮素(批號(hào)100081-201610,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%)、佛手柑內(nèi)酯(批號(hào)112078-202101,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%)、檸檬酸(批號(hào)111679-201602,質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.0%)和木犀草素(批號(hào)111520-202107,質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.3%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;琥珀酸(批號(hào)PRF7012622,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)、東莨菪亭(批號(hào)PRF9102221,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)、6,7-二羥基香豆素(批號(hào)PRF8041741,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%)和異茴香內(nèi)酯(批號(hào)PRF9062222,質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.2%)均購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司;乙腈、磷酸和配流動(dòng)相用甲醇均為色譜純,其余試劑為分析純。馬齒莧為馬齒莧科植物馬齒莧PortulacaoleraceaL.的干燥地上部分,經(jīng)鐘貞副主任藥師鑒定為正品,信息見(jiàn)表1。

表1 馬齒莧的藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對(duì)照品溶液的制備

取檸檬酸、琥珀酸、咖啡酸、染料木苷、木犀草素、槲皮素、東莨菪亭、6,7-二羥基香豆素、異茴香內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯對(duì)照品適量,用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.494、0.450、0.142、0.218、1.180、0.374、0.056、0.092、0.170、0.158 g·L-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液,再將儲(chǔ)備液用體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇稀釋20倍制得上述10種對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為24.7、22.5、7.1、10.9、59.0、18.7、2.8、4.6、8.5、7.9 mg·L-1的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取馬齒莧粉末約2.0 g,加體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇超聲處理30 min,放冷,用同一溶劑定容至25 mL,搖勻,過(guò)濾,即得。

2.3 色譜條件

用Alltima HP HiLord C18液相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫為30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)分別為210 nm(0～16 min檢測(cè)檸檬酸、琥珀酸和咖啡酸)[10-13]、360 nm(16～29 min檢測(cè)染料木苷、木犀草素和槲皮素)[14-17]、320 nm(29～50 min檢測(cè)東莨菪亭、6,7-二羥基香豆素、異茴香內(nèi)酯和佛手柑內(nèi)酯)[18-21]。流動(dòng)相為1 mL·L-1磷酸(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0～8 min,18.0% B;8～16 min,18.0%～25.0% B;16～29 min,25.0%～48.0% B;29～42 min,48.0%～90.0% B;42～50 min,90.0%～18.0% B)。流速為1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量為10 μL。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1專屬性實(shí)驗(yàn) 按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣混合對(duì)照品溶液及供試品溶液,記錄色譜圖,見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn),馬齒莧供試品溶液中10種成分與相鄰色譜峰分離良好(分離度均≥1.5),與對(duì)照品溶液色譜峰保留時(shí)間一致。

注:A.混合對(duì)照品;B.馬齒莧供試品;1.檸檬酸;2.琥珀酸;3.咖啡酸;4.染料木苷;5.木犀草素;6.槲皮素;7.東莨菪亭;8.6,7-二羥基香豆素;9.異茴香內(nèi)酯;10.佛手柑內(nèi)酯。

2.4.2線性關(guān)系考察 精密吸取2.1項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL,分別用上述溶劑稀釋200、100、40、20、10、4倍,搖勻制得系列線性工作溶液1～6,按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè),記錄色譜圖,以檸檬酸、琥珀酸、咖啡酸、染料木苷、木犀草素、槲皮素、東莨菪亭、6,7-二羥基香豆素、異茴香內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),以峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 馬齒莧中各成分的線性關(guān)系

2.4.3精密度實(shí)驗(yàn) 按照2.3項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣混合對(duì)照品溶液6次,記錄檸檬酸、琥珀酸、咖啡酸、染料木苷、木犀草素、槲皮素、東莨菪亭、6,7-二羥基香豆素、異茴香內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯色譜曲線的峰面積。計(jì)算得曲線峰面積的RSD值依次為0.89%、1.21%、1.35%、0.91%、0.59%、1.08%、1.52%、1.37%、1.13%、1.42%,表明精密度良好。

2.4.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取一份馬齒莧(編號(hào)S1)供試品溶液,于制備后0、2、5、9、14、20、24 h進(jìn)樣,記錄檸檬酸、琥珀酸、咖啡酸、染料木苷、木犀草素、槲皮素、東莨菪亭、6,7-二羥基香豆素、異茴香內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯色譜曲線的峰面積。計(jì)算得曲線峰面積的RSD值依次為0.92%、1.19%、1.28%、0.71%、0.64%、1.23%、1.22%、1.43%、1.15%、1.32%,表明馬齒莧供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取馬齒莧(編號(hào)S1)適量,按照2.2項(xiàng)下方法制備馬齒莧供試品溶液6份,按照2.3項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)分析,記錄色譜曲線,用外標(biāo)法計(jì)算檸檬酸、琥珀酸、咖啡酸、染料木苷、木犀草素、槲皮素、東莨菪亭、6,7-二羥基香豆素、異茴香內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯的含量。計(jì)算得其含量的RSD值依次為1.19%、1.25%、1.67%、1.79%、1.33%、1.51%、1.86%、1.71%、1.58%、1.44%,表明重復(fù)性良好。

2.4.6準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 取馬齒莧(編號(hào)S1)細(xì)粉9份,每份精密稱定1.0 g,分別按各成分含量的80%、100%、120%加入混合對(duì)照品溶液(檸檬酸、琥珀酸、咖啡酸、染料木苷、木犀草素、槲皮素、東莨菪亭、6,7-二羥基香豆素、異茴香內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為0.361、0.317、0.098、0.169、0.887、0.274、0.043、0.067、0.135、0.117 g·L-1),每個(gè)質(zhì)量濃度平行操作3次,再按照2.2項(xiàng)下方法制得加樣供試品溶液,按照2.3項(xiàng)色譜條件下檢測(cè)。計(jì)算得10種成分的平均加樣回收率分別為100.02%、99.44%、96.97%、98.03%、100.14%、97.89%、97.09%、96.92%、98.17%、99.38%;RSD值分別為0.89%、1.22%、1.42%、1.58%、0.64%、1.60%、1.15%、0.92%、1.39%、0.85%。

2.5 含量測(cè)定

取18批馬齒莧(S1～S18),依法制備馬齒莧供試品溶液,按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,用外標(biāo)法計(jì)算馬齒莧中檸檬酸、琥珀酸、咖啡酸、染料木苷、木犀草素、槲皮素、東莨菪亭、6,7-二羥基香豆素、異茴香內(nèi)酯和佛手柑內(nèi)酯的含量。見(jiàn)表3。

表3 馬齒莧中10種成分含量的測(cè)定結(jié)果 (n=3)

2.6 聚類分析(cluster analysis,CA)

將表3中18批馬齒莧的10種成分含量測(cè)定結(jié)果導(dǎo)入SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件,用平均聯(lián)接(組間)法,用歐氏距離對(duì)樣品的測(cè)度進(jìn)行CA,得聚類樹(shù)狀圖,見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn),當(dāng)間距為10時(shí),18批馬齒莧樣品聚為3類,S1、S5、S2、S4、S3共5批樣品聚為一類,S11、S12、S9、S7、S10、S6、S8共7批樣品聚為一類,S13、S15、S14、S16、S17、S18共6批樣品聚為一類。

圖2 18批馬齒莧樣品聚類樹(shù)狀圖

2.7 主成分分析(principal component analysis,PCA)

將表3中18批馬齒莧的10種成分含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件,用降維的方式進(jìn)行PCA,見(jiàn)表4、表5。由表4可見(jiàn),有2個(gè)主成分特征值大于1,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為85.072%,大于85%,表明選取前2個(gè)主成分即可代表馬齒莧85.072%的信息量。由表5可見(jiàn),第一主成分的信息來(lái)自琥珀酸、咖啡酸、染料木苷、木犀草素、槲皮素、東莨菪亭、6,7-二羥基香豆素、異茴香內(nèi)酯等成分的綜合,第二主成分的信息由檸檬酸、琥珀酸和佛手柑內(nèi)酯提供。同時(shí)用統(tǒng)計(jì)軟件SIMCA 14.1建立PCA模型,18批馬齒莧樣品PCA得分圖見(jiàn)圖3,共提取出2個(gè)主成分,R2x為0.851,大于0.5,所建立的模型穩(wěn)定性較高。由圖3可見(jiàn),S1～S5、S6～S12及S13～S18分別呈一定關(guān)聯(lián)性,與CA結(jié)果一致。

圖3 PCA得分圖

表4 馬齒莧主成分分析的結(jié)果

表5 馬齒莧10種成分的成分矩陣

2.8 正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)

將表3中10種成分含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1統(tǒng)計(jì)軟件,運(yùn)行OPLS-DA程序,見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示,模型的主成分回歸系數(shù)Q2為0.836,大于0.5,表明模型的預(yù)測(cè)能力較強(qiáng),反映樣本具有明確分離的趨勢(shì)。R2y為0.868,表明模型的擬合度較好。對(duì)所建立的OPLS-DA模型中2個(gè)主成分進(jìn)行200次置換檢驗(yàn),見(jiàn)圖5,結(jié)果顯示,R2擬合直線在y軸截距為0.055,小于0.3,表明所建立的模型可靠;Q2擬合直線與y軸交點(diǎn)為-0.421(為負(fù)數(shù)),表明所構(gòu)建的模型未過(guò)度擬合,預(yù)測(cè)能力好,可有效判別18批馬齒莧的質(zhì)量差異。根據(jù)變量重要性投影(variable importance in projection,VIP)值篩選影響馬齒莧化學(xué)成分差異的標(biāo)志性成分,見(jiàn)圖6。由圖6可見(jiàn),木犀草素(VIP=1.841)、槲皮素(VIP=1.255)、琥珀酸(VIP=1.247)和檸檬酸(VIP=1.205)為影響馬齒莧產(chǎn)品質(zhì)量的主要潛在標(biāo)志物(VIP值均>1)。

圖4 18批馬齒莧樣品的OPLS-DA模型得分圖

圖5 OPLS-DA置換檢測(cè)結(jié)果圖

圖6 18批馬齒莧樣品的VIP圖

2.9 EW-TOPSIS法分析

表6 18批馬齒莧樣品中各成分歸一化處理結(jié)果

表7 18批馬齒莧樣品加權(quán)決策矩陣

表8 馬齒莧的質(zhì)量評(píng)價(jià)排序

3 討論與結(jié)論

3.1 提取方法和溶劑的選擇

本實(shí)驗(yàn)在制備供試品溶液時(shí),對(duì)提取方法和溶劑進(jìn)行了考察。選用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇和甲醇,結(jié)果顯示,當(dāng)以體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇為溶劑時(shí),10種成分的提取率均較高。對(duì)提取方式及時(shí)間進(jìn)行了考察,結(jié)果發(fā)現(xiàn),以體積分?jǐn)?shù)為70%的甲醇超聲提取30 min時(shí),10種成分的提取率最高,操作簡(jiǎn)便、高效。

3.2 色譜條件的確定

在選擇流動(dòng)相時(shí),首先考察了甲醇-水和乙腈-水不同梯度洗脫程序,比較各洗脫程序下的色譜曲線,結(jié)果顯示以乙腈-水系統(tǒng)為流動(dòng)相效果較好,但基線略有漂移,檸檬酸、琥珀酸和咖啡酸色譜峰不能正常積分,遂考慮加入不同體積分?jǐn)?shù)磷酸溶液(0.5 mL、1、2 mL·L-1)進(jìn)行改善,最終以乙腈-1 mL·L-1磷酸溶液作為流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí),各峰的分離度較好,且色譜峰保留時(shí)間適中。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)10個(gè)指標(biāo)成分對(duì)照品溶液進(jìn)行190～400 nm全波長(zhǎng)掃描,參考《中華人民共和國(guó)藥典》及相關(guān)文獻(xiàn),綜合基線平穩(wěn)情況、色譜峰分離情況及色譜峰數(shù)量等,最終選擇在210 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)檸檬酸、琥珀酸和咖啡酸,在360 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)染料木苷、木犀草素和槲皮素,在320 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)東莨菪亭、6,7-二羥基香豆素、異茴香內(nèi)酯和佛手柑內(nèi)酯。

3.3 化學(xué)模式識(shí)別結(jié)果分析

CA和PCA分析結(jié)果均顯示,18批不同產(chǎn)地馬齒莧呈明顯的分類趨勢(shì),明顯聚為3類,S1～S5為一類、S6～S12為一類,S13～S18為一類,分析結(jié)果表明不同產(chǎn)地的馬齒莧質(zhì)量有差異,需要綜合整體化學(xué)成分的含量特征進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。OPLS-DA分析找出4個(gè)影響馬齒莧分類的主要生物標(biāo)志物,即木犀草素、槲皮素、琥珀酸和檸檬酸,它們可能是影響馬齒莧產(chǎn)品質(zhì)量的主要潛在標(biāo)志物。EW-TOPSIS結(jié)果顯示,四川和貴州地區(qū)所產(chǎn)馬齒莧的質(zhì)量最優(yōu),其次為河南、遼寧和吉林。

馬齒莧為一種分布較廣的藥食兩用植物,主要含有機(jī)酚酸類、黃酮類、香豆素類及生物堿類成分,其中檸檬酸、琥珀酸和咖啡酸等為有機(jī)酚酸類主要成分,染料木苷、木犀草素和槲皮素等為黃酮類主要成分,東莨菪亭、6,7-二羥基香豆素、異茴香內(nèi)酯和佛手柑內(nèi)酯等為香豆素類主要成分。現(xiàn)代研究表明,馬齒莧黃酮類成分具有降血糖、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗炎、抗纖維化、提高記憶力、抑制黑色素生成等多種生物活性[22],還可以通過(guò)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制治療慢性前列腺炎[23];馬齒莧有機(jī)酚酸類成分具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抑制血小板等作用[24];馬齒莧香豆素類物質(zhì)具有抗細(xì)胞增生、防止血管硬化、抗凝血等作用[25]。王妙穎[26]研究表明檸檬酸能夠改善高脂血癥動(dòng)物的血脂和血糖,提高耐糖能力,減弱胰島素抵抗,影響與糖代謝相關(guān)基因及蛋白的活性,有效改善糖代謝紊亂;同時(shí)檸檬酸可抑制變形鏈球菌產(chǎn)酸,對(duì)副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌均有較強(qiáng)的抑菌作用[27]。黃國(guó)文等[28]研究表明,琥珀酸可顯著改善產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88感染小鼠的腸道炎癥,對(duì)金黃色葡萄球菌、卡他球菌以及傷寒桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌、痢疾桿菌具有抑制作用。槲皮素具有良好的降血糖、降血壓、抗炎、抗流感病毒、抑菌、抗衰老及心血管保護(hù)作用[29]。王琪等[30]研究表明木犀草素抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化及抗病毒作用顯著。上述研究進(jìn)一步驗(yàn)證了本文篩選出的標(biāo)志物檸檬酸、琥珀酸、槲皮素和木犀草素是直接影響馬齒莧產(chǎn)品質(zhì)量的化合物。本研究所建立的多指標(biāo)成分定量控制及化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)合EW-TOPSIS評(píng)價(jià)方法對(duì)穩(wěn)定馬齒莧質(zhì)量、進(jìn)一步探討馬齒莧的藥效差異及資源的合理利用提供了數(shù)據(jù)支持。