蘇 捷,楊賢海,付大清,馬小青,鄭光明,左小明

荊門市中醫(yī)醫(yī)院,荊門 448000

地黃除痹乳膏是由荊楚名老中醫(yī)朱必泉臨床治療痹癥的外用驗(yàn)方痹痛散改變劑型而得,是荊門市中醫(yī)醫(yī)院的擬開發(fā)制劑。地黃除痹乳膏由地黃、當(dāng)歸、三七、丹參、乳香、沒藥組成。方中地黃為君藥,有活血化瘀之效,廣泛應(yīng)用于血熱瘀血證和外傷瘀血證的治療[1]。當(dāng)歸、三七、丹參共為臣藥,具有補(bǔ)血活血、散瘀止痛之功效,用于治療風(fēng)濕痹痛、跌打損傷[2-4]。乳香、沒藥為佐藥,能活血化瘀止痛,二者合用,可用于瘀滯痛證的治療[5]。上述諸藥合用,共奏化瘀通滯、逐痹止痛之功。因缺乏完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),為保障地黃除痹乳膏的臨床療效,本研究用薄層色譜法(thin layer chromatography,TLC)對制劑中的地黃、當(dāng)歸、三七進(jìn)行定性鑒別。并以梓醇、地黃苷D、阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1為質(zhì)量標(biāo)志成分,用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography ,HPLC)測定其含量,以期有效控制地黃除痹乳膏的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1525型高效液相色譜儀、2489型紫外檢測器均購自美國Waters公司;GE0505十萬分之一電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司);KQ-250B臺式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);ZF-6三用紫外分析儀(上海嘉鵬科技有限公司)。

1.2 試藥

對照品:梓醇(批號110808-202112,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.8%)、毛蕊花糖苷(批號111530-201914,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95.2%)、人參皂苷Rg1(批號110703-202034,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為94.0%)、人參皂苷Rb1(批號110704-202028,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.1%)、三七皂苷R1(批號110745-201921,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.4%)、當(dāng)歸(批號120927-201617)、三七(批號120941-201810)均購自中國食品藥品檢定研究院;地黃苷D(批號MUST-21052010,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.19%)、阿魏酸(批號MUST-21060504,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.94%)均購自成都曼斯特生物科技有限公司;HPLC/ACS級乙腈(批號L9A0T49,河北百靈威超精細(xì)材料有限公司);色譜級磷酸(批號C1907082,阿拉丁化學(xué)試劑有限公司);硅膠G薄層板(批號20190307,青島海洋化工廠分廠);水為超純水;其他試劑均為分析純。地黃除痹乳膏(批號:20211101、20211201、20220101、20220102、20220201)及各陰性樣品由荊門市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 地黃、當(dāng)歸、三七的定性鑒別

2.1.1地黃的TLC鑒別 取地黃除痹乳膏1 g,加20 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的甲醇溶液超聲提取15 min,過濾后蒸干濾液,加2.5 mL水溶解殘?jiān)?用5 mL水飽和的正丁醇振搖提取3次,合并正丁醇層并蒸干,殘?jiān)? mL甲醇溶解,即得供試品溶液[6-8]。另取缺地黃陰性樣品1 g同法制成陰性對照溶液。再取毛蕊花糖苷對照品約1 mg,加甲醇1 mL溶解制成對照品溶液。吸取上述溶液各5 μL,點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-甲醇-甲酸(8∶0.25∶1)溶液展開,取出并晾干,于365 nm紫外光燈下觀察,見圖1。由圖1可見,供試品色譜在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),陰性對照無干擾。

注:1.陰性對照溶液;2.毛蕊花糖苷對照品;3～5.供試品。

2.1.2當(dāng)歸的TLC鑒別 取地黃除痹乳膏2.5 g,加乙醚30 mL,超聲15 min,過濾,蒸干濾液,加1 mL乙醇溶解殘?jiān)?作為供試品溶液。另取缺當(dāng)歸陰性樣品2.5 g、當(dāng)歸對照藥材0.5 g,同法制成陰性對照溶液及對照藥材溶液。吸取上述溶液各10 μL,點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-正己烷(1∶4)溶液展開,取出并晾干,于365 nm紫外光燈下觀察[9],見圖2。由圖2可見,供試品色譜在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn),陰性對照無干擾。

注:1.陰性對照溶液;2.當(dāng)歸對照藥材;3～5.供試品。

2.1.3三七的TLC鑒別 取地黃除痹乳膏2.0 g,加2 mL水混勻,加10 mL水飽和的正丁醇振搖10 min,靜置1 h后離心,取上清液,用正丁醇飽和的水溶液以3倍量混勻,靜置,取正丁醇層并蒸干,加甲醇1 mL溶解殘?jiān)瞥晒┰嚻啡芤骸Ａ砣∪比哧幮詷悠?.0 g、三七對照藥材0.5 g,同法制成陰性對照溶液和對照藥材溶液。再取三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1對照品,加甲醇制成質(zhì)量濃度均為0.25 mg·mL-1的對照品溶液。吸取上述溶液各10 μL,點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上,以乙酸乙酯-甲醇-三氯甲烷-水(8∶4.4∶3∶2)在10 ℃以下放置的下層溶液展開,取出晾干,以體積分?jǐn)?shù)為10%的硫酸溶液噴于薄層板,于105 ℃條件下加熱至斑點(diǎn)清晰顯色[10-11],見圖3。由圖3可見,供試品色譜在與對照品及對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn),且陰性對照無干擾。

注:1.人參皂苷Rb1對照品;2.三七皂苷R1對照品;3.人參皂苷Rg1對照品;4.三七對照藥材;5～7.供試品;8.陰性對照溶液。

2.2 含量測定

2.2.1色譜條件 Waters Symmetry C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。以乙腈(A)-1 mL·L-1磷酸溶液(B)為流動相,梯度洗脫(0～15 min,2%～10% A;15～20 min,10%～20% A;20～40 min,20%～35% A;40～45 min,35%～40% A;45～50 min,40%～2% A)。檢測波長為203 nm(梓醇、地黃苷D、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1)和316 nm(阿魏酸);柱溫為30 ℃;流速為1.0 mL·min-1;進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2對照品溶液的制備 精密稱取梓醇對照品0.009 94 g、地黃苷D對照品0.011 98 g、阿魏酸對照品0.002 68 g、三七皂苷R1對照品0.011 77 g、人參皂苷Rg1對照品0.025 79 g、人參皂苷Rb1對照品0.022 43 g,置于50 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得到上述對照品質(zhì)量濃度分別為0.196 4、0.237 6、0.053 6、0.212 8、0.484 8、0.417 6 mg·mL-1的儲備液。精密吸取儲備液2.5 mL,置于10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得混合對照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備 精密稱取地黃除痹乳膏及各陰性樣品2 g,置于錐形瓶中,精密加入體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇溶液50 mL,稱定質(zhì)量,加熱回流提取30 min,冷卻至室溫后稱定質(zhì)量,以體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,即得供試品溶液及各陰性對照溶液。

2.2.4系統(tǒng)適用性及專屬性實(shí)驗(yàn) 精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及各陰性溶液,按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,記錄色譜圖。見圖4。由圖4可見,各目標(biāo)成分峰與其他雜質(zhì)峰均能達(dá)到基線分離,陰性對照溶液對各目標(biāo)成分的測定無干擾。

注:A.203 nm;B.316 nm。a.混合對照品溶液;b.供試品溶液;c.缺地黃陰性對照溶液;d.缺三七陰性對照溶液;e.缺當(dāng)歸陰性對照溶液。1.梓醇;2.地黃苷D;3.阿魏酸;4.三七皂苷R1;5.人參皂苷Rg1;6.人參皂苷Rb1。

2.2.5線性關(guān)系考察 精密量取2.2.2項(xiàng)下儲備液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL,分別置于10 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,得到6個不同質(zhì)量濃度的溶液。按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,以峰面積為縱坐標(biāo)(y)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x),進(jìn)行線性回歸分析,結(jié)果見表1。

表1 各成分的回歸方程及線性范圍

2.2.6精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.2.2項(xiàng)下混合對照品溶液10 μL,按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測定6次,測得梓醇、地黃苷D、阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積的RSD值分別為1.13%、1.36%、0.86%、1.19%、0.98%、1.06%,表明儀器的精密度良好。

2.2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取2.2.3項(xiàng)下供試品溶液,按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定,分別于0、2、4、8、12、24 h測得溶液梓醇、地黃苷D、阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積的RSD值分別為1.81%、1.65%、1.55%、1.34%、1.29%、1.83%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取2 g地黃除痹乳膏6份,按照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,測得梓醇、地黃苷D、阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1峰面積的RSD值分別為1.64%、1.36%、1.74%、1.89%、1.51%、1.98%,表明該方法的重復(fù)性較好。

2.2.9回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取1 g含量已知的地黃除痹乳膏6份,分別置于錐形瓶中,精密加入配制的混合對照品溶液(梓醇、地黃苷D、阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1質(zhì)量濃度分別為0.452 1、0.373 6、0.032 2、0.331 5、1.057 3、0.195 1 mg·mL-1)1 mL,精密加入體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇溶液49 mL,按照2.2.3項(xiàng)下方法加熱回流提取,制備供試品溶液,按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定,各成分的回收率見表2。

表2 地黃除痹乳膏各成分的回收率

2.2.10供試品含量的測定 精密稱取5批地黃除痹乳膏,按照2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測定,計算各成分的含量。見表3。

表3 地黃除痹乳膏各成分的含量測定結(jié)果 (n=3)

3 討論

3.1 地黃除痹乳膏TLC鑒別藥材的選擇

地黃除痹乳膏由6味藥組成,為保證制劑質(zhì)量及有效性,本研究用TLC對方中君藥地黃和臣藥當(dāng)歸、三七3味藥進(jìn)行定性鑒別,并進(jìn)行專屬性、系統(tǒng)適用性考察。建立的TLC鑒別方法能準(zhǔn)確鑒別地黃除痹乳膏中的上述3味藥。

3.2 含量測定質(zhì)量標(biāo)志成分的確定

地黃中含量最高的是環(huán)烯醚萜類化合物,而環(huán)烯醚萜類化合物中梓醇和地黃苷D為地黃的重要藥效成分[12-13]。當(dāng)歸中有機(jī)酸類成分可作為當(dāng)歸質(zhì)量標(biāo)志物[14],有機(jī)酸類阿魏酸為當(dāng)歸補(bǔ)血活血的物質(zhì)基礎(chǔ)[15]。三七的主要活性成分及主要活血成分為三七總皂苷[16],《中華人民共和國藥典》規(guī)定,三七中三七皂苷R1和人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1的總含量不得低于5.0%[11]。為確保制劑的療效穩(wěn)定可靠,本研究將上述6個成分確定為地黃除痹乳膏含量測定的質(zhì)量標(biāo)志成分。

3.3 供試品溶液制備方法的選擇

本研究前期考察體積分?jǐn)?shù)為45%、60%、75%的甲醇溶液的提取效果,結(jié)果顯示,在超聲處理相同時間(30 min)后,體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇溶液提取效果最好。確定提取溶劑后,本研究還考察了超聲30、45 min與加熱回流30 min的提取效果,結(jié)果顯示,與超聲30、45 min比較,加熱回流30 min對阿魏酸和人參皂苷Rb1的提取更完全。結(jié)果表明,加熱回流30 min提取效果最優(yōu)。

3.4 流動相的確定

本研究參考文獻(xiàn)方法[17-20],考察了1 mL·L-1磷酸溶液-甲醇與1 mL·L-1磷酸溶液-乙腈為流動相的洗脫效果。結(jié)果顯示,相比于1 mL·L-1磷酸溶液-甲醇,當(dāng)以1 mL·L-1磷酸溶液-乙腈為流動相時,6個指標(biāo)成分的保留時間均較短,且峰形佳;在低檢測波長(203 nm)條件下,鬼峰數(shù)量少,故確定1 mL·L-1磷酸溶液-乙腈為流動相。

綜上所述,本研究建立的TLC能對地黃除痹乳膏中的地黃、當(dāng)歸及三七進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別,且方法簡便、可靠、專屬性強(qiáng)。雖未對制劑處方中的所有藥味進(jìn)行定性鑒別,不能完全評價其質(zhì)量,但定性鑒別的藥味中包含了君藥地黃以及相對較貴重的三七,故能夠部分評價和控制其質(zhì)量。建立了新的能同時測定地黃除痹乳膏中梓醇、地黃苷D、阿魏酸、三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1含量的HPLC新方法,可用于地黃除痹乳膏的質(zhì)量評價。