■ 盧麗枝 雷麗莉 章岳軍 高秋玲 吳永峰 吳忠才 沈水寶 張淑芳*

（1.廣西壯族自治區(qū)畜牧站，廣西南寧 530022；2.廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧 530004；3.英杰（長沙）生物科技有限公司，湖南長沙 410000；4.廣西桂柳牧業(yè)集團，廣西桂林 541000）

我國農業(yè)農村部公告第194 號規(guī)定，自2020 年7 月1 日起停止生產(chǎn)使用含有生長類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料。自此，我國正式迎來了飼料無抗時代[1]。但隨著禁抗時代的到來，我國養(yǎng)殖業(yè)面臨的新問題是畜禽抵抗力降低，患病率有所增加，生產(chǎn)效益降低，給養(yǎng)殖場（戶）帶來不小的經(jīng)濟損失，因此尋找新的替抗產(chǎn)品勢在必行。益生菌作為一種活的微生物，當宿主體內積累到一定劑量時可以起到增強機體免疫力，減少腸道疾病的效果[2]。益生菌被廣泛應用在食品、醫(yī)藥和農業(yè)生產(chǎn)，通過定植在動物體內調節(jié)宿主黏膜與免疫系統(tǒng)，調節(jié)腸道菌群，促進營養(yǎng)物質吸收保持腸道健康[3]。因此，益生菌對養(yǎng)殖動物的影響研究也受到廣泛關注。阮勝鋼等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在雛鴨飼料中添加枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的復合益生菌，增加了雛鴨的免疫能力，并顯著提高了28 日齡雛鴨的平均日增重；Song等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在熱應激的肉雞飼糧中添加由植物乳酸桿菌、地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌組成的復合益生菌可有效增加小腸中乳酸桿菌等有益菌群定植。鴨具有耐寒、耐粗飼、免疫力強，早期生長較快，但是由于現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖條件，養(yǎng)殖密度大、飲水條件差和冷熱應激較大，造成鴨容易出現(xiàn)腸道問題[6]。研究旨在探究嗜酸乳桿菌、屎腸球菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌組成的復合益生菌在不同添加量下對紹興鴨血清生化、盲腸短鏈脂肪酸及微生物區(qū)系的影響，為益生菌在改善鴨腸道健康以及免疫方面提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用復合益生菌購自英杰（長沙）生物科技有限公司提供，主要有效成分為嗜酸乳桿菌1×109CFU/g、屎腸球菌1×109CFU/g、枯草芽孢桿菌1×109CFU/g、地衣芽孢桿菌1×109CFU/g。試驗所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所有限公司。試驗動物和養(yǎng)殖場地均由廣西桂柳牧業(yè)集團提供。

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理

試驗采用單因素完全隨機設計，選取同一批次健康、體重相近1日齡的紹興鴨1 200只，隨機分4組，每組5個重復，每個重復60只。對照組飼喂基礎飼糧，A組在基礎飼糧基礎上添加100 mg/kg 復合益生菌，B 組在基礎飼糧基礎上添加200 mg/kg 復合益生菌，C 組在基礎飼糧基礎上添加300 mg/kg 復合益生菌。預試期3 d，正試期30 d。飼養(yǎng)試驗在廣西桂柳牧業(yè)集團養(yǎng)殖場進行，均采用網(wǎng)上平養(yǎng)方式，自由采食和飲水，免疫程序按照鴨場現(xiàn)行常規(guī)免疫進行。

1.3 基礎飼糧

基礎飼糧為玉米-豆粕型飼糧，參考NY/T 827—2004《紹興鴨飼養(yǎng)技術規(guī)程》[7]并結合試驗鴨場企業(yè)標準設計。試驗全期飼喂顆粒料，基礎飼糧組成以及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平（風干基礎）

1.4 樣品采集

于正試期第30 天，試驗鴨禁食12 h，正常飲水，每個重復隨機選取1 只紹興鴨進行翅下靜脈采血，3 000 r/min離心15 min后，用移液槍將血清移到1.5 mL離心管中，-20 ℃保存，用于測定血清生化指標和免疫指標；隨后進行安樂死屠宰，取盲腸內容物，-80 ℃保存，用于測定盲腸短鏈脂肪酸和微生物區(qū)系。

1.5 檢測指標與方法

1.5.1 生長性能

分別在試驗開始和結束當天以重復為單位對其進行空腹稱重，用于計算平均日增重；以每組每個重復為單位記錄試驗鴨的投料量以及剩余料量，用于計算平均日采食量和料重比。

平均日增重（g）=（末體重-初體重）/試驗天數(shù)

平均日采食量（g）=（投料量-剩余料量）/試驗天數(shù)/試驗鴨數(shù)

料重比=平均日采食量/平均日增重

1.5.2 血清生化指標

采用購自南京建成生物工程研究所有限公司的ELISA 試劑盒，使用酶標儀測定血清中總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、葡萄糖（GLU）、尿素氮（BUN）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）等血清生化指標以及血清免疫球蛋白M、A、G（IgM、IgA、IgG）指標含量，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.5.3 盲腸短鏈脂肪酸

測定盲腸內容物中短鏈脂肪酸（SCFAs）的含量；采用直接進樣的氣相色譜法和內標定量能計算法測定分析盲腸內容物中短鏈脂肪酸的含量。

1.5.4 盲腸微生物區(qū)系

試驗結束當天，在無菌的操作下取盲腸內容物1.5～2.0 mL裝入凍存管，-80 ℃保存，然后干冰送往上海生物醫(yī)藥科技有限公司委托進行16S rRNA V3～V4微生物區(qū)系檢測。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 簡單整理后，使用SPSS 23.0 軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），并以Duncan’s法進行多重比較。結果以“平均數(shù)±標準誤”表示，以P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著判斷標準。

2 結果與分析

2.1 復合益生菌對紹興鴨生長性能的影響

由表2 可知，與對照組相比，A、B、C 組紹興鴨的平均日增重和平均日采食量差異不顯著（P>0.05），但3個試驗組平均日增重分別增加2.4%、5.3%、4.6%，平均日采食量分別增加2.0%、2.5%、3.1%；A、B、C 組紹興鴨的料重比均低于對照組，其中B、C 組顯著低于對照組（P<0.05），A、B、C組分別降低0.5%、4.2%、1.6%。

表2 復合益生菌對紹興鴨生長性能的影響

2.2 復合益生菌對紹興鴨血清生化指標的影響

由表3 可知，與對照組相比，A、B、C 組紹興鴨總蛋白、白蛋白、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、堿性磷酸酶、葡萄糖、尿素氮、三酰甘油、總膽固醇等血清生化指標差異不顯著（P>0.05）；A、B、C 組紹興鴨的IgM 和IgA含量極顯著提高（P<0.01），但各試驗組中IgG 含量與對照組差異不顯著（P>0.05）。

表3 復合益生菌對紹興鴨血清生化指標的影響

2.3 復合益生菌對紹興鴨盲腸短鏈脂肪酸含量的影響

由表4可知，與對照組相比，A、B、C組紹興鴨盲腸乙酸含量顯著提高（P<0.05），分別增加14.3%、7.14%；A、B、C組紹興鴨盲腸丙酸、丁酸含量與對照組差異不顯著（P>0.05）；A組紹興鴨盲腸異戊酸含量顯著提高（P<0.05），盲腸異戊酸含量顯著降低50%（P<0.05）。

表4 復合益生菌對紹興鴨盲腸短鏈脂肪酸含量的影響（mmol/g）

2.4 復合益生菌對紹興鴨盲腸微生物區(qū)系的影響

2.4.1 復合益生菌對紹興鴨盲腸微生物區(qū)系的OTU分析

由表5和圖1可知，對照組的OTU數(shù)量為1 046個，A、B、C 組分別為988、971、1 058 個；其中對照組特有OTU 數(shù)量為66 個，A 組特有OTU 數(shù)量為65 個，B 組特有OTU數(shù)量為33個，C組特有OUT數(shù)量為34個。

圖1 復合益生菌對紹興鴨盲腸OTU數(shù)量韋恩圖

表5 復合益生菌對紹興鴨盲腸微生物區(qū)系OTU數(shù)量的影響

2.4.2 復合益生菌對紹興鴨盲腸微生物區(qū)系門水平物種分布的影響

由圖2 可知，紹興鴨盲腸微生物門水平物種組成相對豐度排行前7 位的微生物。各組盲腸菌群組成主要由擬桿菌門、厚壁菌門、放線菌門（Actinobacteriota）、脫硫菌門、延葉桿菌門、螺旋藻門等組成。其中差異菌門為擬桿菌門和厚壁菌門。擬桿菌門占整個菌群的比例，對照、A、B、C 組分別為46.4%、56.9%、47.1%、51.1%；厚壁菌門占整個菌群比例，對照、A、B、C 組分別為47.9%、38.2%、40.1%、42.2%。從圖3 可以看出，與對照組相比，各試驗組差異菌門擬桿菌門和厚壁菌門相對豐度均差異顯著（P<0.05）。

圖2 門水平上物種分布

2.4.3 復合益生菌對紹興鴨盲腸微生物區(qū)系屬水平物種分布的影響

由圖4 可知，紹興鴨盲腸微生物屬水平物種組成相對豐度排名前34 位微生物，其中對照、A、B、C 組總和占總菌屬的比例分別是78.5%、84.2%、79.7%、80.2%，優(yōu)勢菌屬擬桿菌屬占總菌屬比例分別為25.9%、38.2%、40.1%、42.2%。其中差異菌群為瘤胃球菌屬和拉氏鱗毛蕨屬，從圖5 可以看出，與對照組相比，各試驗組差異菌屬瘤胃球菌屬和拉氏鱗毛蕨屬差異顯著（P<0.05）。

圖5 屬水平差異菌群相對豐度

3 討論

3.1 復合益生菌對紹興鴨生長性能的影響

注：Bacteroides，擬桿菌屬；Prevotellaceae_Ga6A1_group，普雷沃氏菌Ga6A1；unclassified_f＿Lachnospiraceae，未分類的毛螺菌屬；Prevotella，普氏菌屬；Faecalibacterium，糞桿菌屬；Rikenellaceac_RC9_gut_group，理研菌RC9；unclassified_f＿Oscillospiraceae，未分類的顫螺旋菌屬；Parabacteroides，青春雙歧桿菌屬；Prevotellaceae_UCG-001，普雷沃氏菌屬UCG001；norank_f＿norank_o＿Clostridia_UCG-014，梭狀芽孢桿菌屬UCG014；UCG-005，擬普雷沃氏菌屬UCG-005； Prevotellaceae_NK3B31_group，普雷沃氏菌科NK3B31；unclassified_o＿Bacteroidales，未分類的擬桿菌屬；Shutteworthia，梭狀花屬；Ruminococcus_torques＿group，瘤胃球菌屬；norank_f＿Eubacterium_coprostanoligenes_group，未分類的糞真桿菌屬；norank_f＿Prevotellaceae，未分類的普雷沃氏菌屬；Lachnoclostridium，拉氏鱗毛蕨屬；Subdoligranulum，罕見小球菌屬；norank_f＿Oscillospiraceae，顫螺旋菌科；Butyricicoccus，丁酸桿菌屬；Mucispirillum，黏液螺旋菌屬；Desulfovibrio，脫硫弧菌屬；Alistipes，另枝菌屬；Romboutsia，郎布特西亞屬；norank_f＿norank_o＿Bacteroidales，未分類的擬桿菌目；Oribacterium，假丁酸弧菌屬；Megamonas，巨單胞菌屬；Christensenellaceae_R-7_group，克里斯滕森菌科R-7；Treponema，密螺旋體屬；others，其他。

畜禽生長發(fā)育狀況是畜禽養(yǎng)殖場（戶）衡量生產(chǎn)水平和經(jīng)濟效益的重要指標[8]。李小芬等[9]研究表明，在飼料中添加乳酸桿菌、納豆芽孢桿菌均可以提高櫻桃谷肉鴨的平均日增重和終末體重，降低料重比，從而增加經(jīng)濟效益；劉曉琳等[10]研究表明，在日糧中添加0.05%枯草芽孢桿菌可提高櫻桃谷鴨的育成率，降低料重比。本研究結果與前人研究結果相同，飼糧中添加復合益生菌可顯著降低紹興鴨的料重比，且添加量200 mg/kg效果較好。

3.2 復合益生菌對紹興鴨血清生化指標的影響

動物的血液指標反映動物在其內外部環(huán)境中營養(yǎng)配制的生理變化[11]。血清中白蛋白是最豐富的血漿蛋白，約占血清蛋白的55%～56%，其中白蛋白主要與其合成和分解代謝有關，并起到維持血液滲透壓的作用，球蛋白則是血清免疫球蛋白的主要成分，主要參與動物機體營養(yǎng)運輸以及免疫等功能，共同參與機體的代謝和內環(huán)境的穩(wěn)定。總蛋白可以為動物生長提供良好的營養(yǎng)物質，其含量也是反映動物機體營養(yǎng)狀況的指標之一[12-13]。許運岑[14]研究表明，枯草芽孢桿菌可以顯著提高AA肉雞血清中的總蛋白和球蛋白含量，但對血清中白蛋白含量影響不大。蔣山翊等[15]研究表明，0.02%枯草芽孢桿菌可以顯著提高白羽肉雞血清中白蛋白、總蛋白和球蛋白的含量。劉小龍等[16]研究表明，添加單獨或者聯(lián)合使用抗菌肽或合生素（植物乳桿菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和殼寡糖）可顯著提高AA 肉雞血清中白蛋白和總蛋白含量。本研究結果與前人研究結果相悖，飼糧中添加復合益生菌對紹興鴨血清中白蛋白、總蛋白和球蛋白均無顯著影響，其可能原因是益生菌菌株種類以及含量不同，或者是試驗動物種類以及試驗環(huán)境差異影響。

益生菌對動物機體有免疫調節(jié)作用，可促進IgA發(fā)揮免疫調節(jié)作用，從而增強機體抵御入侵病原體的免疫作用[17]。Tana 等[18]研究表明，添加1%的乳桿菌復合物可顯著提高肉仔雞血清中IgG 和IgA 的含量。陳輝[19]研究表明，添加0.4%、0.6%、0.8%的復合益生菌可顯著提高肉仔雞21 日齡和42 日齡血清中IgG 的含量。本研究結果與前人研究結果相同，添加復合益生菌可極顯著提高紹興鴨血清中IgM 和IgA 的水平，但是對血清中IgG 含量的影響不大，但相比對照組有增加趨勢，在配合飼糧中添加量為200 mg/kg 效果較好。

3.3 復合益生菌對紹興鴨盲腸短鏈脂肪酸含量的影響

腸道屏障是抵抗腸道中病原微生物和有毒有害氣體的第一道防線，對維持機體發(fā)揮正常功能至關重要。短鏈脂肪酸是腸道微生物代謝產(chǎn)物之一，對維持腸道健康發(fā)揮至關重要的作用[20]。短鏈脂肪酸是由腸道菌群通過糖酵解和磷酸戊糖途徑降解不易消化的膳食纖維產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，短鏈脂肪酸是由1～6 個碳原子的有機脂肪酸組成，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，其中乙酸是腸道中含量最豐富的短鏈脂肪酸[21-22]。若短鏈脂肪酸濃度過高可引起動物食欲減退、免疫力降低，導致發(fā)生群體性呼吸道疾病，嚴重時導致呼吸困難肺水腫和充血等癥狀[23]。本研究表明，飼糧中添加復合益生菌顯著增加腸道中乙酸的含量，其中復合益生菌添加100 mg/kg 時紹興鴨盲腸異戊酸含量較對照組差異顯著，且盲腸異戊酸較對照組含量降低50%。由此可見，飼糧中添加復合益生菌可增加盲腸乙酸含量而降低盲腸異戊酸的含量。

3.4 復合益生菌對紹興鴨盲腸微生物區(qū)系的影響

盲腸微生物群在動物健康和生產(chǎn)性能中起著關鍵作用，影響營養(yǎng)物質的消化吸收，并有助于預防有害病原體的定植。大量研究表明，家禽盲腸中擬桿菌門、厚壁菌門和放線菌門為高相對豐度菌門[24-26]，而本研究結果與前人研究結果相同。李寧等[27]研究表明，益生菌通過競爭、抑制腸道內有害細菌，增加有益菌從而穩(wěn)定腸道菌群。盲腸對動物機體糖代謝和氮代謝起重要作用，食糜進入盲腸可被腸道中的微生物吸收利用，其中發(fā)現(xiàn)擬桿菌門具有促進營養(yǎng)物質吸收作用，厚壁菌門具有抑制營養(yǎng)物質吸收作用，擬桿菌門降低或厚壁菌門增加都有助于脂肪的吸收和積累[28]，因此擬桿菌門和厚壁菌門在盲腸門水平分析中占比較高。研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門和擬桿菌門參與腸道中短鏈脂肪酸代謝，其中厚壁菌門參與丙酸和丁酸合成，而擬桿菌門主要參與丙酸合成[29]，進而參與盲腸的代謝。張孟陽等[30]研究表明，在56 日齡仔雞腸道中優(yōu)勢菌門為厚壁菌門（48.61%）和擬桿菌門（31.10%）。趙彥光等[31]研究表明，飼糧中添加復合益生菌極顯著提高門水平上擬桿菌門的相對豐度。本試驗基于門水平研究結果表明，腸道菌群具有多樣性豐富的特點，擬桿菌門、厚壁菌門為兩個豐度最高的菌門，同時也是差異最大的菌門，與對照組相比各試驗組擬桿菌門占比均高于對照組，厚壁菌門均低于對照組。郝永勝等[32]研究表明，擬桿菌屬是鴨盲腸主要菌屬，是短鏈脂肪酸主要生產(chǎn)者，主要影響盲腸菌群和盲腸發(fā)育。基于屬水平的研究結果表明，優(yōu)勢菌屬是擬桿菌屬，差異菌屬為瘤胃菌屬和拉氏鱗毛蕨屬，本試驗研究結果與前人研究結果相同。說明添加復合益生菌對盲腸門水平和屬水平上的擬桿菌有增加作用。

4 結論

添加復合益生菌可降低紹興鴨的料重比，同時增加紹興鴨血清中IgM 和IgA 含量，且在配合飼料中添加量200 mg/kg 較好。添加復合益生菌可增加盲腸中乙酸含量，增加擬桿菌門和擬桿菌屬的相對豐度，同時降低厚壁菌門的相對豐度，穩(wěn)定腸道菌群，且在配合飼糧中添加量100 mg/kg較好。