李 雪, 孫宇佳, 劉 瑞, 付忠舉, 靳學(xué)慧, 華麗霞, 張亞玲

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)/黑龍江省植物抗性研究中心,黑龍江大慶 163319; 2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所,四川成都 610300)

水稻穗腐病(rice spikelet rot disease,簡(jiǎn)稱RSRD)是一種由多種真菌引起的水稻穗部病害[1],該病在水稻種植區(qū)均有不同程度的發(fā)生,嚴(yán)重地塊發(fā)病率可達(dá)100%,受害稻穗結(jié)實(shí)率下降,千粒質(zhì)量降低,減產(chǎn)5%～10%,嚴(yán)重可達(dá)30%以上,甚至絕收[2]。國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者認(rèn)為,造成水稻穗腐病的主要病原菌有多種,如鐮孢菌屬(Fusariumsp.)、鏈格孢菌屬(Alternariasp.)、彎孢菌屬(Curvulariasp.)、蠕孢菌屬(Bipolarissp.)[3-6]。張俊華等于2018年對(duì)黑龍江省穗腐病病原進(jìn)行鑒定,從水稻穗腐病樣本上分離純化得到119個(gè)菌株,其中鏈格孢屬有112株,認(rèn)為該菌屬為主要致病菌,經(jīng)ITS鑒定為鏈格孢[7]。研究表明,不同區(qū)域的鏈格孢屬優(yōu)勢(shì)致病菌有差異,費(fèi)丹等將安徽省穗腐病病原菌鑒定為細(xì)交鏈格孢菌[8];胡頌平等將江西省穗腐病病原菌鑒定為細(xì)交鏈格孢菌[9]。

黑龍江省是我國(guó)水稻主產(chǎn)區(qū),水稻穗腐病每年都有不同程度的發(fā)生,且有逐年加重的趨勢(shì)。雖然前人研究表明,黑龍江省水稻穗腐病的病原菌主要是以鏈格孢菌為主[10-11],但前人對(duì)鏈格孢屬菌株的鑒定大部分基于形態(tài)學(xué)鑒定或者是單一菌株的ITS分子鑒定,關(guān)于黑龍江省水稻穗腐病致病菌鏈格孢屬的多樣性尚未見(jiàn)報(bào)道,對(duì)于鏈格孢屬致病機(jī)制亦研究較少。

有研究報(bào)道,當(dāng)病菌侵染菌絲通過(guò)組織的細(xì)胞侵入時(shí),會(huì)產(chǎn)生一些細(xì)胞壁降解酶降解植物組織,使病菌在細(xì)胞間迅速擴(kuò)展,病菌侵入組織后,需要大量的能源,病原菌產(chǎn)生的纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶和其他酶類(lèi)在致病過(guò)程中通過(guò)分解細(xì)胞壁和細(xì)胞內(nèi)含物為病原菌提供了豐富的碳氮源,相關(guān)外泌酶在病原菌致病過(guò)程中起重要作用[12-13]。本研究旨在分析黑龍江省水稻主產(chǎn)區(qū)水稻穗腐病致病菌鏈格孢屬的多樣性,明確不同類(lèi)型鏈格孢屬真菌的生物學(xué)特性,同時(shí)對(duì)各菌株的外泌酶產(chǎn)生情況進(jìn)行比較分析,以此初步探索鏈格孢菌屬各類(lèi)菌種的致病機(jī)制,為該病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021年9月至2022年11月于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)植物抗性研究中心實(shí)驗(yàn)室與四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所完成。

1.1 試驗(yàn)材料

水稻穗腐病病樣采集于黑龍江省水稻主產(chǎn)區(qū)建三江科研所水稻實(shí)驗(yàn)田、綏化市北林區(qū)、慶安縣、通河縣、綏濱縣等5個(gè)地區(qū)。接種鑒定供試水稻品種為龍粳31。

1.2 病原菌的分離與純化

采用組織分離法[14]對(duì)病原菌進(jìn)行分離和純化。采集得到的具有水稻穗腐病癥狀的稻谷用自來(lái)水反復(fù)沖洗干凈放在濾紙上晾干,將其內(nèi)外穎殼分離,用滅菌剪刀在病健交界處剪取2 mm×2 mm的病組織,先經(jīng)乙醇消毒5 s后經(jīng)漂白粉溶液(水溶液與漂白粉比例為14 mL ∶1 g)浸泡5 min進(jìn)行表面消毒, 再用無(wú)菌水漂洗3次,置于無(wú)菌濾紙上吸干水分,呈“品”字形轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上,于28 ℃在黑暗條件下培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后,進(jìn)行初次鏡檢,用單孢分離法[15]從菌落上挑取單個(gè)孢子,移至PDA培養(yǎng)基上進(jìn)一步培養(yǎng),將獲得的純化菌株用濾紙片法[16]保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌致病性驗(yàn)證

將供試水稻種植于直徑為27 cm的花盆內(nèi),待水稻長(zhǎng)至孕穗期時(shí),制備濃度為1×105個(gè)/mL的新鮮孢子懸浮液,使用2 mL的醫(yī)用注射器將孢懸液注入穗苞上部,直至注射部位有3～5滴菌液溢出[17],接種后的水稻放置于溫室內(nèi)28 ℃保濕培養(yǎng)24 h,光—暗周期為12 h—12 h,對(duì)照組注射無(wú)菌水。6 d后觀察植株發(fā)病情況。取發(fā)病谷粒,重新分離純化,將分離純化得到的菌株與原接種菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)比較,驗(yàn)證是否與原接種病原菌相同,從而完成柯赫氏法則驗(yàn)證病原菌的致病性。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 形態(tài)鑒定 將菌株接種于PDA培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后觀察菌落形態(tài),用無(wú)菌接種刀刮取菌絲,制作臨時(shí)玻片,使用ECLIPSE 80i顯微鏡觀察各菌株分生孢子形態(tài)。

1.4.2 分子生物學(xué)鑒定 采用CTAB法[18]提取病原菌的基因組DNA,利用5.8S rDNA核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacers,ITS)引物對(duì)菌株DNA進(jìn)行擴(kuò)增,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[19]。

擴(kuò)增體系：正反引物各1.00 μL,9.00 μL ddH2O,1.50 μL DNA 模板,12.50 μL 2×EsTaqMaster Mix (Dye),總體積25.00 μL。

擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min后4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果在NCBI GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中進(jìn)行BLAST比對(duì)。選擇相關(guān)鏈格孢種菌株的ITS序列與供試菌株ITS序列作BLASTn對(duì)比分析,用MEGA 7.0軟件中的Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行系統(tǒng)演化分析,檢驗(yàn)重復(fù)次數(shù)(Bootstrap test)為1 000次。供試菌株的核酸序列數(shù)據(jù)NMDCN0001CE1-NMDCN0001CE8存儲(chǔ)在國(guó)家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心(NMDC),鏈接為https://nmdc.cn/resource/genomics/sequence/detail/ NMDCXXXX XXXX。根據(jù)分析結(jié)果確定病原菌的分類(lèi)學(xué)種名。

1.5 鏈格孢菌屬不同菌株的生物學(xué)特性分析

1.5.1 測(cè)定不同培養(yǎng)基、溫度、pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 從培養(yǎng)5 d的菌落邊緣取直徑為5 mm的菌餅,接種于以下條件進(jìn)行培養(yǎng)：(1) 培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)培養(yǎng)基、米糠培養(yǎng)基和查氏(Czapek)培養(yǎng)基,28 ℃恒溫培養(yǎng);(2)溫度選用15、20、26、28、30、32 ℃,進(jìn)行恒溫培養(yǎng);(3)選用pH值為5、6、7、8、9、10、11和12的PDA培養(yǎng)基,28 ℃恒溫培養(yǎng)。每個(gè)處理重復(fù)3次,5 d 后采用十字交叉法[20]測(cè)量菌落直徑。

1.5.2 測(cè)定不同碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 以Czapek培養(yǎng)基[21]為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,將直徑為5 mm 的菌餅分別接種于8種不同的碳源培養(yǎng)基：葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、甘油、甘露醇及6種不同的氮源培養(yǎng)基：牛肉膏、蛋白胨、尿素、硝酸銨、硝酸鈉、氨基乙酸[7],28 ℃恒溫培養(yǎng),每個(gè)處理重復(fù)3次,測(cè)定方法同“1.5.1”節(jié)。

1.6 外分泌酶活性檢測(cè)

參考賈熙超等的方法[22]將直徑為5 mm的菌餅接種于蛋白酶檢測(cè)培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫培養(yǎng),每個(gè)處理重復(fù)3次,培養(yǎng)3 d,觀察是否產(chǎn)生透明水解圈;纖維素酶與淀粉酶的檢測(cè)分別參考張荷花、蔡鴻杰等的方法[23-24]并在其基礎(chǔ)上加以改進(jìn),如圖1所示在相應(yīng)檢測(cè)培養(yǎng)基上鋪1層邊長(zhǎng)為6 cm 的正方形無(wú)菌干燥濾紙片,再將直徑為5 mm的菌餅接種于濾紙片中心,28 ℃恒溫培養(yǎng),每個(gè)處理重復(fù)3次,培養(yǎng)3 d,揭掉濾紙片進(jìn)行染色觀察。纖維素酶檢測(cè)使用0.10%剛果紅染液對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行染色,染色 10 min,用1 mol/L NaCL溶液脫色2～3次,觀察是否產(chǎn)生黃色透明的水解圈,淀粉酶檢測(cè)使用碘液進(jìn)行染色, 觀察是否產(chǎn)生明顯的水解圈。通過(guò)測(cè)定水解圈大小與菌落直徑的關(guān)系,確定各菌株對(duì)蛋白質(zhì)、纖維素和淀粉的分解效率。分解效率=水解圈直徑/菌落直徑×100%[24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離與形態(tài)比較

對(duì)采集到的39個(gè)樣本進(jìn)行分離純化,共獲得181個(gè)菌株,根據(jù)分生孢子形態(tài)鑒定到鏈格孢屬菌株151個(gè),占83.43%。選取其中37個(gè)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)比較,根據(jù)菌落形態(tài),劃分為8個(gè)類(lèi)型,分別記錄為 A1～A8。

由圖2可知,8個(gè)類(lèi)型的菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)狀態(tài)和顏色各不相同,A1為綠色,A2為深棕色,A3為棕色,A4為灰綠色,A5中心淺綠色邊緣大部分為白色,A6為白色,A7為深綠色,A8為淺綠色。A1、A2、A3、A6在PDA平板上菌落表面平整,邊緣整齊,菌絲埋生;A4、A5、A7、A8在PDA平板上菌落平展,棉絮狀,氣生菌絲發(fā)達(dá);8個(gè)類(lèi)型的分生孢子均為淡褐色或褐色,有橫隔和縱隔,在孢子形態(tài)上有差異,A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7分生孢子呈棍棒狀或倒梨形,具有橫隔1～6個(gè),縱隔1～5個(gè),分隔處有縊縮,頂端喙?fàn)罴?xì)胞較短,圓柱形或錐形;A8分生孢子呈倒棍棒狀,具有橫隔4～8個(gè),縱隔 1～4個(gè),橫隔分隔處有縊縮,短喙柱形。

2.2 致病力驗(yàn)證

從8個(gè)類(lèi)型中分別選取1個(gè)代表性菌株進(jìn)行致病力驗(yàn)證,接種結(jié)果表明,8株分離菌株均可使水稻表現(xiàn)出和田間水稻病害相同或相近的癥狀(圖3),穎殼上有鐵銹色圓形或不規(guī)則狀的斑點(diǎn)。再次分離收集接種感病稻谷,和初次分離純化病原菌的方法一樣。再次分離純化均得到與初接菌株相同的分離物,符合柯赫氏法則,證實(shí)8株分離菌株均為引起水稻穗腐病的致病菌。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

利用真菌通用引物ITS1/ITS4對(duì)37個(gè)菌株進(jìn)行分子鑒定,同源性比對(duì)結(jié)果表明,18個(gè)菌株的ITS序列與細(xì)交鏈格孢菌(Alternariatenuissima)同源性高達(dá)99.82%,可確定為細(xì)交鏈格孢菌,記為Ⅰ類(lèi)菌;18個(gè)菌株與鏈格孢菌(Alternariaalternata)同源性高達(dá)99.45%,確定為鏈格孢菌,記為Ⅱ類(lèi)菌;僅1個(gè)菌株與蕓薹鏈格孢菌(Alternariabrassicae)同源性高達(dá)100.00%,確定為蕓薹鏈格孢菌,記為Ⅲ類(lèi)菌。其中,上述接種驗(yàn)證的8個(gè)菌株,A1～A4分子鑒定為細(xì)交鏈格孢菌,屬于Ⅰ類(lèi)菌,A5～A7為鏈格孢菌,屬于Ⅱ類(lèi)菌,A8為蕓薹鏈格孢菌,屬于Ⅲ類(lèi)菌,這8個(gè)致病菌與已報(bào)道的鏈格孢菌屬的親緣關(guān)系見(jiàn)圖4。

2.4 不同類(lèi)型鏈格孢屬菌株的生物學(xué)特性比較

以A1～A8這8個(gè)致病菌作為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)菌的代表菌,比較不同鏈格孢屬菌株的生物學(xué)特性。

2.4.1 不同培養(yǎng)基、溫度、pH值對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)菌均能在PDA、米糠、Czapek、PSA等4種培養(yǎng)基上生長(zhǎng),但生長(zhǎng)速率不同(圖5)。Ⅰ類(lèi)菌的最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基為PDA或米糠培養(yǎng)基,在Czapek培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度最慢;Ⅱ類(lèi)菌和Ⅲ類(lèi)菌的最適培養(yǎng)基同為米糠培養(yǎng)基,Ⅱ類(lèi)菌在PSA培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最弱;Czapek培養(yǎng)基不利于Ⅲ類(lèi)菌的菌絲生長(zhǎng)。

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)菌均能在15～32 ℃與pH值范圍為5～12時(shí)生長(zhǎng),但生長(zhǎng)速率有差異(圖6)。Ⅰ類(lèi)菌A1、A2的菌絲最適生長(zhǎng)溫度為26 ℃,最適pH值為7,A3的最適生長(zhǎng)溫度范圍為26～30 ℃,最適pH值范圍為7～10,A4的最適生長(zhǎng)溫度范圍為28～30 ℃,pH值為9;Ⅱ類(lèi)菌中A5和A7的最適生長(zhǎng)溫度范圍為26～30 ℃,最適pH值分別為7、8,A6、A8的最適生長(zhǎng)溫度范圍同為28～30 ℃,最適pH值范圍分別為8～10、8～9。

同一菌種的不同菌株同樣存在生物學(xué)特性差異(表1)。Ⅰ類(lèi)菌中的4個(gè)菌株在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度存在顯著性差異,Ⅱ類(lèi)菌中的3個(gè)菌株在最優(yōu)生長(zhǎng)培養(yǎng)基米糠培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度也具有顯著性差異;在最適生長(zhǎng)溫度范圍26～30 ℃內(nèi),Ⅰ類(lèi)菌的4個(gè)菌株在各個(gè)溫度條件下的生長(zhǎng)速度均存在顯著性差異,Ⅱ類(lèi)菌的3個(gè)菌株在溫度為28、30 ℃時(shí)的生長(zhǎng)速度存在顯著性差異;Ⅰ類(lèi)菌中的4個(gè)菌株在最適生長(zhǎng)pH值范圍為8～10時(shí)的生長(zhǎng)速度存在顯著性差異,Ⅱ類(lèi)菌的3個(gè)菌株在最適生長(zhǎng)pH值范圍為7～10時(shí)的生長(zhǎng)速度存在顯著性差異。

表1 同一菌種不同菌株之間的生物學(xué)特性比較

2.4.2 不同碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)菌在不同的碳、氮源培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng),但生長(zhǎng)速率不同(圖7),Ⅰ類(lèi)菌不同菌株對(duì)不同碳源的利用效率不同,A1在葡萄糖中生長(zhǎng)最快,A2在葡萄糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖中生長(zhǎng)較快,無(wú)顯著性差異,A3的最適碳源為甘露醇,A4在葡萄糖、果糖和可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最快,無(wú)顯著性差異。Ⅱ類(lèi)菌中A5的最適碳源為可溶性淀粉,A6為葡萄糖、A7為甘露醇。Ⅲ類(lèi)菌A8在以葡萄糖和可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最快,菌落直徑最大。

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)菌在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最差,A6在硝酸鈉和硝酸銨為氮源的培養(yǎng)上生長(zhǎng)最好,其他菌株以牛肉膏和蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最好。

2.4.3 外分泌酶檢測(cè)結(jié)果 在蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶檢測(cè)培養(yǎng)基上均觀察到透明水解圈的產(chǎn)生(圖8),說(shuō)明Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)菌均能產(chǎn)生蛋白酶、纖維素酶及淀粉酶分解利用蛋白質(zhì)、纖維素和淀粉。菌株對(duì)3類(lèi)物質(zhì)分解效率的測(cè)定結(jié)果(表2)表明,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)菌對(duì)3類(lèi)物質(zhì)的分解能力存在差異,其中A1、A3、A5、A8對(duì)纖維素的分解效率最強(qiáng),分別為169.14%、151.15%、165.23%、148.22%;A5對(duì)淀粉的分解效率最強(qiáng),為169.38%,A1最差,為66.04%;A1對(duì)蛋白質(zhì)的分解效率最強(qiáng),為104.53%,A8最差,為83.19%。

表2 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類(lèi)菌產(chǎn)生的外分泌酶的分解效率

3 討論

鏈格孢屬是引起水稻穗腐病的重要病原物,《中國(guó)真菌志 第十六卷 鏈格孢屬》[25]記錄有123個(gè)種及變種。目前對(duì)于鏈格孢屬真菌種的鑒定主要是以形態(tài)鑒定為主。本研究在相同條件下分離培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)8類(lèi)不同生長(zhǎng)狀態(tài)的菌體,通過(guò)孢子形態(tài)觀察其均符合鏈格孢屬形態(tài)特征,用通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行分子鑒定時(shí),將其分為3類(lèi), 但是在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)時(shí)并沒(méi)有將3類(lèi)菌完全分在不同分枝上,說(shuō)明通過(guò)核糖體DNA-ITS序列分析來(lái)確定鏈格孢屬種間分類(lèi)是有局限性的。

對(duì)于黑龍江省鏈格孢屬真菌引起的穗腐病多認(rèn)為是由鏈格孢菌引起的[10],而胡頌平等研究發(fā)現(xiàn)新疆省、河南省和江西省水稻穗腐病是由細(xì)交鏈格孢菌引起[9,26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)引起黑龍江省水稻穗腐病的鏈格孢屬有3種,分別為細(xì)交鏈格孢菌、鏈格孢菌和蕓薹鏈格孢菌,均是黑龍江省水稻穗腐病的致病菌。其中細(xì)交鏈格孢菌和鏈格孢菌為該病害主要致病菌,均占鏈格孢屬總數(shù)的48.65%,僅分離得到1株蕓薹鏈格孢菌。

本試驗(yàn)將分屬于3類(lèi)不同菌種的8個(gè)代表菌株進(jìn)行生物學(xué)特性研究。結(jié)果表明,溫度、 pH值、培養(yǎng)基和碳、氮源等不同條件對(duì)3類(lèi)菌的菌絲生長(zhǎng)均有顯著影響。本研究還發(fā)現(xiàn),同一類(lèi)菌在同一條件下的生長(zhǎng)情況不同,如Ⅰ類(lèi)菌中A3和A4的最適生長(zhǎng)溫度范圍分別為26～30 ℃、28～30 ℃,A1和A2的最適溫度為26 ℃,與黃世文等研究的細(xì)交鏈格孢菌最適溫度范圍為25～28 ℃[2]存在差異。Ⅰ類(lèi)菌中A3的最適培養(yǎng)基為米糠培養(yǎng)基,其余3個(gè)菌株的最適培養(yǎng)基均是PDA和米糠培養(yǎng)基,這暗示著同一菌屬的不同菌種生物學(xué)特性存在差異。本研究還發(fā)現(xiàn),同一菌種不同菌株在同一類(lèi)型的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度存在顯著差異,且對(duì)pH值、溫度的需求亦存在差異,暗示著同一菌種不同菌株同樣存在生物學(xué)特性的差異,然而這種種間以及種內(nèi)的生物學(xué)特性差異是否與致病力有相關(guān)性需進(jìn)一步研究論證。8個(gè)菌株的最適碳源為葡萄糖和可溶性淀粉,氮源為牛肉膏和蛋白胨,這與胡頌平等報(bào)道的適合細(xì)交鏈格孢菌生長(zhǎng)的碳源[9]一致,與其報(bào)道的最適氮源存在差異。

在與寄主互作過(guò)程中,病原微生物產(chǎn)生的外分泌酶對(duì)成功侵染寄主具有重要的作用[28]。纖維素是植物細(xì)胞壁的主要成分,是阻礙病原物侵染的第一道屏障[29-32]。淀粉是水稻籽粒重要的營(yíng)養(yǎng)成份,水稻抽穗后進(jìn)入灌漿期,這一時(shí)期穎殼內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的淀粉,從而為病原菌提供了良好的營(yíng)養(yǎng)條件;候恩慶等研究發(fā)現(xiàn),凡是這一時(shí)期利用淀粉進(jìn)行繁殖的植物病原菌,幾乎都能使谷粒感病[33]。本研究發(fā)現(xiàn),8個(gè)致病菌生長(zhǎng)最佳碳源為可溶性淀粉,且均能產(chǎn)生淀粉酶和纖維素酶,這2種酶的產(chǎn)生可能是鏈格孢屬菌株重要的致病機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)不同菌株產(chǎn)生的淀粉酶及纖維素酶總量或活性存在顯著差異,是否與致病力具有相關(guān)性需要進(jìn)一步通過(guò)接種驗(yàn)證。

有趣的是,本研究從水稻穗腐病病樣中分離得到1株致病菌蕓薹鏈格孢菌(A8),該菌種為十字花科黑斑病的主要致病菌[34],關(guān)于蕓薹鏈格孢菌侵染水稻的報(bào)道尚未見(jiàn)報(bào)道。A8經(jīng)淀粉酶活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生淀粉酶分解利用淀粉,這可能是因?yàn)槭|薹鏈格孢菌能利用淀粉進(jìn)行繁殖從而使植株感病,后續(xù)將通過(guò)分離鑒定更多的鏈格孢屬菌株來(lái)驗(yàn)證這一假設(shè)。

4 結(jié)論

黑龍江省水稻主產(chǎn)區(qū)穗腐病的致病菌為鏈格孢屬菌株,其中細(xì)交鏈格孢菌、鏈格孢菌為優(yōu)勢(shì)菌種,均占菌株數(shù)量的48.65%,只有1株為蕓薹鏈格孢菌。水稻穗腐病病原菌的菌絲生長(zhǎng)受培養(yǎng)基、溫度、pH值和碳、氮源的影響,其中溫度和碳、氮源的影響較突出。不同的生理小種在不同的碳、氮源培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速率存在差異,較適合所有菌株菌絲生長(zhǎng)的碳源為葡萄糖和可溶性淀粉,氮源為牛肉膏和蛋白胨。8個(gè)菌株均能分泌3種外分泌酶。分析結(jié)果表明,鏈格孢菌屬不同菌種存在生物學(xué)特性差異,同一菌種的不同菌株也存在生物學(xué)特性差異。