王澤亮 ,楊勇智,杜晉城,陳炙,黃振,郭洪英,2

1.四川省林業(yè)科學(xué)研究院,四川 成都,610081；2.四川省草原科學(xué)研究院,四川 成都, 611731

榿木屬（AlnusMill.）為非豆科固氮樹(shù)種，根系富含根瘤，可改良土壤，是重要的先鋒造林與生態(tài)功能樹(shù)種。榿木屬是現(xiàn)存樺木科植物中最原始的屬，也是北半球新生代植物區(qū)系的重要植物類(lèi)群，主要分布在歐亞和北美，拉丁美洲與非洲有少量分布[1-2]。四川省及鄰近地區(qū)是榿木屬的重要分布區(qū)，原生分布有榿木（Alnus cremastogyne,又名四川榿木）、川滇榿木（A.ferdinandi-coburgii）、毛榿木（A.lanata）、尼泊爾榿木（A.nepalensis），可能是榿木屬植物起源與分化的中心[1]，其中榿木是我國(guó)最重要的一個(gè)特有種，也是研究最廣泛的一個(gè)種，生長(zhǎng)迅速、適應(yīng)性強(qiáng)、童期短且結(jié)實(shí)量大，目前其適生栽培區(qū)域已擴(kuò)大至長(zhǎng)江中下游地區(qū)，是中國(guó)長(zhǎng)江流域退耕還林工程、生態(tài)建設(shè)工程和混交造林的重要樹(shù)種。

SSR（Simple sequence repeat，簡(jiǎn)單序列重復(fù)）分子標(biāo)記具有分布廣泛、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定、共顯性等特點(diǎn)，自從被開(kāi)發(fā)以來(lái)，在物種遺傳改良上獲得了廣泛的應(yīng)用。在榿木屬植物SSR 研究方面，Zhuk 等最早開(kāi)發(fā)出了榿木SSR 引物[3]。隨后，Lance等通過(guò)篩選海岸榿木（A.maritima）基因組文庫(kù)獲得了19 條榿木SSR 引物[4]。使用Lance 開(kāi)發(fā)的引物，Jones 等人系統(tǒng)研究了美國(guó)瀕危物種海岸榿木的遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)等，為其提供了的瀕危保護(hù)理論基礎(chǔ)[5,6]。隨后SSR 技術(shù)逐漸的應(yīng)用到其他榿木屬樹(shù)種中，這些樹(shù)種的群體遺傳變異基礎(chǔ)與進(jìn)化史也逐漸被深入揭示[7-10]。目前國(guó)內(nèi)榿木遺傳改良研究主要集中于育苗、栽培等常規(guī)育種方面，在群體遺傳變異研究上，主要通過(guò)表型鑒定方法進(jìn)行[11-14]，采用分子標(biāo)記手段的研究較少，僅有卓仁英等建立了RAPD 體系[15]。在SSR 分子標(biāo)記方面，也僅有饒龍兵等基于榿木、歐洲榿木（A.glutinosa）、硬榿木（A.firma）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)了適用于榿木屬的SSR標(biāo)記[16]?？傊畼伳救后w遺傳變異缺乏分子水平上的數(shù)據(jù)支撐，影響了其保護(hù)與進(jìn)一步的推廣利用。

此外，SSR 分子標(biāo)記從來(lái)源上說(shuō)包括Genomic-SSR 與EST-SSR，分別來(lái)源于基因組數(shù)據(jù)與表達(dá)序列標(biāo)簽（Express sequence tags，EST）數(shù)據(jù)。本研究分析了2 種來(lái)源的榿木SSR 標(biāo)記的差異，以期推動(dòng)其在國(guó)內(nèi)榿木遺傳變異研究上的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 植物材料

采樣群體為天然次生林，共包括13 個(gè)群體（表1）。群體范圍包括成都平原區(qū)、盆周山地區(qū)、盆地丘陵區(qū)、川西高山峽谷區(qū)和川西南山地區(qū)。群體取樣單株之間相距至少50m，采集榿木新鮮葉片，硅膠干燥保存帶回實(shí)驗(yàn)室。

表1 榿木群體基本信息Tab.1 Location and number of trees sampled in 13 Alnus Cremastogyne populations

1.2 DNA 提取與PCR 擴(kuò)增

使用天根植物基因組提取試劑盒DNA（DP305）提取基因組DNA。

SSR 擴(kuò)增所用引物來(lái)源于2 部分：（1）Genomic-SSR，公開(kāi)發(fā)表文獻(xiàn)中其它榿木屬樹(shù)種相關(guān)研究中使用的SSR 引物[3-4,17-18]，10 對(duì)引物；（2）EST-SSR[19]，6 對(duì)引物。具體信息見(jiàn)表2。

表2 榿木10 個(gè)Genomic-SSR 與6 個(gè)EST-SSR 標(biāo)記遺傳參數(shù)Tab.2 Genetic diversity of 164 trees in A.cremastogyne revealed by 10 Genomic-SSRs and 6 EST-SSRs

SSR 上游引物添加FAM 熒光標(biāo)記。PCR 擴(kuò)增使用Takara Taq 聚合酶(Takara,Dalian,China)，20 uL反應(yīng)體系包括：13.85 μL ddH2O,2.0 μL 10 × buffer,2.0 μL 2.0 mM dNTP,0.5 μL of each primer (at 10 μM),1 μL 基因組DNA 模版（30-50ng），and 0.75 U Taq DNA 聚合酶。擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s，退火溫度退火20 s，72 ℃延伸40 s，25-30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延長(zhǎng)5 min，4 ℃保存。退火溫度根據(jù)文獻(xiàn)或引物設(shè)計(jì)軟件給出的數(shù)據(jù)。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管熒光電泳分型，SSR 片段長(zhǎng)度由軟件GeneMarker version 2.2.0 (SoftGenetics,USA)判讀。

1.3 SSR 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

首先利用Excel2007 整理整合GeneMarker 輸出的基因型分子量數(shù)據(jù)，隨后數(shù)據(jù)輸入基于R 環(huán)境的Polysat 1.6 軟件[20]，整合相關(guān)信息后，最后輸出為GenoDive 格式文件進(jìn)行進(jìn)一步分析。利用GenoDive 2.0b27[21]計(jì)算等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、觀測(cè)雜合度（Ho）、總望雜合度（Ht）、固定系數(shù)（Gst，同F(xiàn)st）等遺傳參數(shù)，評(píng)價(jià)各群體的遺傳多樣性水平。基因流值（Nm）根據(jù)公式（1-GST）/（4GST）估算[22]。

利用GenoDive 2.0b27 計(jì)算Nei’s（1978）遺傳距離，運(yùn)用NTSYS-pc 2.10s 軟件生成UPGMA 聚類(lèi)圖并計(jì)算各遺傳距離的相關(guān)系數(shù)[23-24]。

2 結(jié)果與分析

2.1 榿木Genomic-SSR 與EST-SSR 多態(tài)性比較

利用10 個(gè)Genomic-SSR 位點(diǎn)與6 個(gè)EST-SSR個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)了13 個(gè)榿木群體164 個(gè)個(gè)體的遺傳多樣性參數(shù)，16 個(gè)位點(diǎn)全部具有多態(tài)性。進(jìn)一步分析結(jié)果表明（表2），在10 個(gè)Genomic-SSR 位點(diǎn)中，平均等位基因數(shù)為13.10，平均有效等位基因數(shù)為3.779，平均觀察雜合度為0.849，平均期望雜合度為0.754；對(duì)EST-SSR 來(lái)說(shuō)，平均等位基因數(shù)為13.33，平均有效等位基因數(shù)為4.033，平均觀察雜合度為0.768，平均期望雜合度為0.643。平均等位基因數(shù)EST-SSR 位點(diǎn)高于Genomic-SSR 位點(diǎn)，而對(duì)檢測(cè)的雜合度來(lái)說(shuō)，Genomic-SSR 位點(diǎn)高于EST-SSR 位點(diǎn)。就單個(gè)位點(diǎn)而言，揭示遺傳多性度最高的為EST-SSR 位點(diǎn)Ace29，其等位基因數(shù)達(dá)到27，有效等位基因數(shù)為8.467，觀察雜合度為0.994。在10 個(gè)基因組SSR 位點(diǎn)中，等位基因數(shù)≥20 的位點(diǎn)有2 個(gè)，在10 與20 之間的位點(diǎn)有4 個(gè)，10 以下的位點(diǎn)有4 個(gè)；而6 個(gè)EST-SSR 位點(diǎn)中，有1 個(gè)超過(guò)20，在10（包括等于）與20 之間的位點(diǎn)有4 個(gè)，10 以下的位點(diǎn)有1 個(gè)。

針對(duì)13 個(gè)榿木群體來(lái)說(shuō)，除了平均有效等位基因數(shù) EST-SSR 位點(diǎn)高于 Genomic-SSR（4.251>3.941）之外，其余3 個(gè)遺傳參數(shù)（平均等位基因數(shù)、觀察雜合度、期望雜合度）Genomic-SSR 位點(diǎn)均高于EST-SSR。對(duì)于具體群體來(lái)說(shuō)，Genomic-SSR 與EST-SSR 位點(diǎn)分析均顯示F（冕寧）群體遺傳多樣性水平最高，但是Genomic-SSR 位點(diǎn)顯示I（平武、Ne 值最?。?、J（青川、Na 與Ho 值最?。?、Q（宣漢、Ht 值最?。┤后w遺傳多樣性水平最低，EST-SSR 位點(diǎn)顯示I（平武、Na、Ne、Ho 值最?。?、U（沐川、Ht 值最?。┤后w遺傳多樣性水平最低。

2.2 聚類(lèi)分析

為確定兩種標(biāo)記對(duì)榿木群體遺傳關(guān)系的鑒定準(zhǔn)確度，本研究基于Nei’s 遺傳距離使用UPGMA 方法對(duì)參試材料進(jìn)行聚類(lèi)分析，由圖1（A、B）可知，Genomic-SSR 與EST-SSR 均將AA 與F 群體歸為1 類(lèi)，進(jìn)一步Genomic-SSR 標(biāo)記將其余群體歸為3 類(lèi)：AC、B；I、S、T、V；J、Q、U、K、N，而EST-SSR 劃分的3 類(lèi)為：AC；B、T；I、J、K、N、Q、U、V、S。說(shuō)明在大的區(qū)域分類(lèi)上，Genomic-SSR 與EST-SSR 相一致，而在小的分類(lèi)上有差異。

圖1 基于Nei’s 遺傳距離的榿木群體UPGMA 聚類(lèi)Fig.1 Unweighted pair-group method with arithmetic means (UPGMA) cluster analysis of 13 A.cremastogyne populations based on Nei’s genetic distance (A:Genomic-SSR;B:EST-SSR;C:Genomic-SSR+EST-SSR)

基于Genomic-SSR 與EST-SSR 總的16 個(gè)標(biāo)記的Nei’s 遺傳距離構(gòu)建的UPGMA 聚類(lèi)樹(shù)顯示榿木群體可明顯地分為4 個(gè)類(lèi)群（AA 與F、B、I、其它）（圖1 C），與Genomic-SSR 標(biāo)記結(jié)果更為相似，說(shuō)明本研究中Genomic-SSR 更能精確地鑒別出榿木群體遺傳關(guān)系。

對(duì) Genomic-SSR、EST-SSR 以及 Genomic-SSR+EST-SSR 計(jì)算出的遺傳距離進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示（表3）：3 部分相關(guān)系數(shù)呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），但是Genomic-SSR 與Genomic-SSR+EST-SSR 相關(guān)系數(shù)稍高，即兩種標(biāo)記計(jì)算的綜合相關(guān)系數(shù)與Genomic-SSR 標(biāo)記更為相似，表明本研究中Genomic-SSR 能更準(zhǔn)確地揭示不同榿木個(gè)體間的遺傳關(guān)系，與上述聚類(lèi)分析結(jié)果相一致。

3 討論

3.1 榿木倍性

在相關(guān)研究中，歐洲榿木是被作為二倍體樹(shù)種進(jìn)行研究的，隨后Lepais 等[7]與Mandák 等[25]在非洲與歐洲分別發(fā)現(xiàn)了四倍體群體（2n=4x=56）。在染色體水平上，任保青等[26]與楊漢波等[27]通過(guò)核型研究發(fā)現(xiàn)榿木染色體數(shù)為56，根據(jù)洪德元提到榿木屬的染色體基數(shù)為x=14[28]，或Murai 認(rèn)為的X=7[29]，則榿木可能是四倍體或八倍體。而核型分析顯示榿木染色體結(jié)構(gòu)相同的染色體對(duì)數(shù)多數(shù)為2 對(duì)[27]，表明榿木可能正在進(jìn)行或接近完成二倍體化。由于本研究種榿木SSR 分型數(shù)據(jù)表現(xiàn)出了四倍體特性，因此本研究以多倍體分析軟件Polysat、Genodive 為基礎(chǔ)[20,21]，結(jié)合NTSYS 軟件進(jìn)行了榿木群體遺傳參數(shù)估算與分析。

3.2 榿木Genomic-SSR 與EST-SSR 差異比較

本研究對(duì)兩種來(lái)源SSR 標(biāo)記的遺傳差異進(jìn)行了比較分析，結(jié)果顯示：平均等位基因數(shù)與有效等位基因數(shù)EST-SSR 標(biāo)記高于Genomic-SSR 標(biāo)記，而兩種雜合度Genomic-SSR 位點(diǎn)高于EST-SSR 位點(diǎn)，與前人研究結(jié)果均不完全一致。如在宋躍朋等與劉果等分別對(duì)楊樹(shù)與桉樹(shù)的研究中，均顯示Genomic-SSR 標(biāo)記的等位基因數(shù)、多態(tài)性、雜合度高于ESTSSR 標(biāo)記[30,31]，而在張亞?wèn)|等對(duì)楊樹(shù)研究則顯示EST-SSR 標(biāo)記等位基因數(shù)、多態(tài)性、雜合度高于Genomic-SSR 標(biāo)記[32]，而大豆相關(guān)研究則顯示Genomic-SSR 的等位基因數(shù)高于EST-SSR 標(biāo)記，但是EST-SSR 標(biāo)記的多態(tài)性稍高于Genomic-SSR[33]。在對(duì)榿木群體遺傳多樣性的解析中，Genomic-SSR與EST-SSR 分析結(jié)果也不一致。盡管理論上由于EST-SSR 引物來(lái)自高度保守的DNA 轉(zhuǎn)錄區(qū)，其揭示的多態(tài)性在理論上應(yīng)低于基因組SSR 標(biāo)記，但由于試驗(yàn)材料與參試標(biāo)記的不同，其顯示的遺傳差異可能不同。因此，在物種遺傳多樣性的研究中，應(yīng)利用不同來(lái)源的分子標(biāo)記進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以獲得更加客觀的結(jié)論。

在對(duì)榿木群體遺傳關(guān)系的分析中，在大的類(lèi)群上Genomic-SSR 與EST-SSR 標(biāo)記相一致，而在進(jìn)一步的小類(lèi)群上則顯示出差異，而且本研究中兩種標(biāo)記計(jì)算的綜合相關(guān)系數(shù)與Genomic-SSR 標(biāo)記更為相似，表明本研究中Genomic-SSR 能更準(zhǔn)確地揭示榿木不同群體或個(gè)體間的遺傳關(guān)系，與前述宋躍朋等、劉果等與張亞?wèn)|等研究結(jié)果不一致，這3 項(xiàng)研究均顯示EST-SSR 能更準(zhǔn)確地揭示基因型之間的遺傳關(guān)系[30-32]。這可能與研究所用材料有關(guān)，這3 項(xiàng)研究分析的均是楊樹(shù)與桉樹(shù)不同種間的遺傳關(guān)系，而本研究材料為榿木的不同群體，由于EST-SSR 來(lái)自DNA 轉(zhuǎn)錄區(qū)，保守性強(qiáng)，對(duì)親緣關(guān)系較近的基因型靈敏度不及基因組SSR，但在近鄰的種間具有通用性，對(duì)不同種屬系統(tǒng)演化研究、加密遺傳連鎖圖譜、基因精細(xì)定位、標(biāo)記功能研究等具有重要作用。

總之，本研究表明榿木Genomic-SSR 與EST-SSR標(biāo)記在解析群體遺傳多樣性與遺傳關(guān)系方面有一定差異，要得到更準(zhǔn)確的結(jié)果，需要綜合使用兩種標(biāo)記。