劉娟,韋華,魏榮平,魏明,殷濤,鄧濤

中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心，大熊貓國(guó)家公園珍稀動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，邛崍山瀕危野生動(dòng)植物保護(hù)生物學(xué)國(guó)家長(zhǎng)期科研基地，四川 都江堰 611830

大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)作為我國(guó)野生動(dòng)物保護(hù)領(lǐng)域的旗艦物種，因其數(shù)量稀少曾一度瀕臨滅絕，多年來(lái)一直受到眾多野生動(dòng)物保護(hù)工作者的關(guān)注。近年來(lái)得益于大熊貓遷地保護(hù)政策的實(shí)行，曾經(jīng)的“三難”問(wèn)題被逐一攻克，圈養(yǎng)大熊貓的繁殖成功率大幅提升，種群數(shù)量有了顯著增加。由于對(duì)大熊貓內(nèi)在生殖機(jī)理缺乏深入清晰的認(rèn)識(shí)，在大熊貓的發(fā)情和妊娠過(guò)程中仍存在一些現(xiàn)象缺乏科學(xué)合理的解釋，為實(shí)行圈養(yǎng)大熊貓優(yōu)生優(yōu)育帶來(lái)了一定的阻礙，不利于提高種群質(zhì)量。

亞成體大熊貓“暖暖”2015 年8 月日出生于馬來(lái)西亞國(guó)家動(dòng)物園，2017 年11 月返回中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心都江堰青城山基地，在2018 年和2019 年連續(xù)兩年出現(xiàn)明顯的如：外陰開(kāi)口外翻、水腫，同時(shí)出現(xiàn)減食、活動(dòng)量增大、蹭陰、咩叫等大熊貓發(fā)情期的典型行為。本文通過(guò)行為觀察記錄和收集到的一些尿液進(jìn)行激素監(jiān)測(cè)，從遺傳基因、個(gè)體狀況、環(huán)境條件等方面探討導(dǎo)致雌性大熊貓?zhí)嵩绨l(fā)情的潛在原因，旨在為探索大熊貓的生殖生理提供有用信息，有助于大熊貓飼養(yǎng)管理和繁育工作的開(kāi)展。

1 觀察對(duì)象與方法

1.1 研究地點(diǎn)

中國(guó)大熊貓保護(hù)研究中心青城山基地(103°34′06"—103°34′37" E，30°51′36"—30°51′56" N)位于四川省都江堰市青城山鎮(zhèn)，面積約50.7 hm2，屬中亞熱帶濕潤(rùn)氣候區(qū)，館舍周邊是次生的常綠、落葉闊葉混交林。

1.2 觀察對(duì)象

大熊貓“暖暖”，系譜號(hào)977。

1.3 研究方法

采用外部觀察法進(jìn)行行為觀察記錄，將活動(dòng)量、戲水、蹭陰等與發(fā)情密切相關(guān)的行為依據(jù)活動(dòng)強(qiáng)度分為5 個(gè)等級(jí)，由飼養(yǎng)師每日記錄。在出現(xiàn)明顯發(fā)情行為后，收集尿液進(jìn)行激素監(jiān)測(cè)(2018 年未收集到尿液)。

2 結(jié)果

2.1 行為表現(xiàn)

“暖暖”在2018 年4 月首次出現(xiàn)了活動(dòng)量增加，戲水等行為，期間精神狀態(tài)良好，食欲未見(jiàn)明顯變化。2019 年3 月再次出現(xiàn)了上述情況，其后有所恢復(fù),在4 月開(kāi)始出現(xiàn)采食量明顯下降并伴有戲水、蹭陰、咩叫等典型的發(fā)情行為（具體行為見(jiàn)表1）。

表1 發(fā)情期行為比較Tab.1 Comparison of estrus behavior

2.2 生殖器與激素變化

在兩次行為異常時(shí)期，“暖暖”的外陰均有變化。2018 年有輕度開(kāi)口，未見(jiàn)明顯腫脹。2019 年則變化極為明顯，外陰由前期出現(xiàn)開(kāi)口；后逐漸外翻，水腫，呈粉紅色或潮紅色，偶有乳白色液體流出；后期腫脹逐漸消退并向內(nèi)收縮，顏色變粉變淡。在出現(xiàn)明顯的發(fā)情行為后收集檢測(cè)“暖暖”尿液中的雌激素含量，顯示有較大幅度的變化，因此認(rèn)為亞成體大熊貓“暖暖”處于發(fā)情狀態(tài)。

3 分析與討論

動(dòng)物的初次發(fā)情是生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要階段，這意味著個(gè)體生殖系統(tǒng)發(fā)育成熟開(kāi)始具有繁殖能力。初情期的內(nèi)在機(jī)制十分復(fù)雜，是動(dòng)物個(gè)體在遺傳基因調(diào)控的基礎(chǔ)上與外界環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，除遺傳因素外，營(yíng)養(yǎng)和個(gè)體發(fā)育狀況、環(huán)境與氣候的變化均會(huì)導(dǎo)致初情期的提前或推遲。

3.1 遺傳和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)

動(dòng)物的生殖性能主要受生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)控，而在內(nèi)分泌激素發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的過(guò)程中又會(huì)受到遺傳基因表達(dá)的影響。下丘腦促性腺激素釋放激素（gonadotropin releasing hormone,GnRH ）是啟動(dòng)動(dòng)物初情期的關(guān)鍵物質(zhì)，作用于垂體使其分泌釋放促性激素，促進(jìn)卵泡發(fā)育和精子產(chǎn)生，并產(chǎn)生性激素。在初情期以前的下丘腦GnRH 神經(jīng)元對(duì)性激素的負(fù)反饋?zhàn)饔枚恢碧幱谝种茽顟B(tài)分泌量較少，在初情期啟動(dòng)時(shí)與之密切相關(guān)的KISS-1 等相關(guān)基因表達(dá)急劇升高，直接刺激釋放大量GnRH，促使FSH和LH 的釋放，進(jìn)而促進(jìn)初情期的產(chǎn)生。KISS-1 基因自身的突變或缺失亦會(huì)導(dǎo)致性早熟或無(wú)法啟動(dòng)初情期[1，2]。DNA 甲基化作為表觀遺傳修飾方法的方式之一，可以通過(guò)影響基因的表達(dá)從而對(duì)動(dòng)物的生殖狀態(tài)產(chǎn)生調(diào)控作用。哺乳動(dòng)物中DNA 甲基化主要發(fā)生在CpG 部位，通常位于啟動(dòng)子區(qū)域，也可擴(kuò)展到基因的內(nèi)含子和外顯子區(qū)域。對(duì)大鼠注射一種DNA 甲基化抑制劑后，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)DNA 甲基化水平降低，大鼠陰門(mén)開(kāi)啟的時(shí)間有明顯推遲，且性腺發(fā)育遲緩，其初次發(fā)情過(guò)程明顯被延遲[[3]。進(jìn)入青春期和成年期的恒河猴與幼年時(shí)期相比較，下丘腦內(nèi)側(cè)GnRH 基因表達(dá)有顯著升高的趨勢(shì)，同時(shí)5’端CpG島甲基化水平顯著降低，由此可以認(rèn)為GnRH 神經(jīng)元體外成熟過(guò)程中肽釋放的增加可能是GnRH 中CGI 的DNA 去甲基化的結(jié)果[[4-5]。在山羊的初情期前后發(fā)現(xiàn)，下丘腦全基因組甲基化總體水平保持不變，而不同基因中CpG 位點(diǎn)上甲基化的狀態(tài)有較明顯差異，相較而言，單個(gè)基因的甲基化狀態(tài)比整體甲基化水平對(duì)發(fā)情啟動(dòng)的影響更大[6]。因此，在動(dòng)物初次發(fā)情的過(guò)程中神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)并不是唯一途徑，以DNA 甲基化代表的遺傳基因調(diào)控機(jī)制也發(fā)揮著不可忽視的重要作用，雖然目前還未出現(xiàn)與大熊貓有關(guān)的報(bào)道，但可作為后期研究關(guān)注的新方向。

3.2 營(yíng)養(yǎng)與發(fā)育

營(yíng)養(yǎng)水平與動(dòng)物繁殖機(jī)能存在直接聯(lián)系，是影響動(dòng)物發(fā)情或不發(fā)情的主要外在因素之一。營(yíng)養(yǎng)不足可導(dǎo)致代謝機(jī)能減弱，影響生殖激素分泌，大多數(shù)營(yíng)養(yǎng)不良的動(dòng)物都會(huì)出現(xiàn)初情期推遲甚至不發(fā)情；營(yíng)養(yǎng)過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致肥胖和初情期提前。在部分地區(qū)有關(guān)少年兒童性成熟調(diào)查的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，肥胖和體重超標(biāo)的兒童發(fā)育較為提前，出現(xiàn)性早熟的幾率顯著高于正常體重的兒童，高熱量飲食習(xí)慣導(dǎo)致的營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩是誘發(fā)這一現(xiàn)象的主要因素[7-9]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)以高熱量飼料飼喂的肥胖大鼠較正常體重的大鼠體內(nèi)的雌激素水平更高，性發(fā)育有明顯的提前傾向[[10]。在家畜牛、羊等反芻動(dòng)中營(yíng)養(yǎng)水平與體重對(duì)初情期的出現(xiàn)影響更大[11]。與野外相比較，圈養(yǎng)條件下沒(méi)有復(fù)雜多變的外在威脅且有穩(wěn)定豐富的食物供給，人工飼養(yǎng)的大熊貓各方面的生長(zhǎng)發(fā)育明顯優(yōu)于野生大熊貓，其中以體重這一項(xiàng)尤為明顯。1.5 歲的雌性大熊貓平均體重可達(dá)47.7±5.4 kg，3 歲為84±3 kg[12]，而本文研究對(duì)象大熊貓“暖暖”兩歲半時(shí)體重已達(dá)98 kg。此前也曾有過(guò)亞成體大熊貓?zhí)嵩绨l(fā)情的報(bào)道[[13]，同樣存在體重超重的現(xiàn)象，它們的體重超出同齡大熊貓，接近甚至達(dá)到成年大熊貓的體重（表2）。由此可見(jiàn)，營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩導(dǎo)致體重超重是影響大熊貓初情期的一個(gè)重要因素。

表2 過(guò)早發(fā)情大熊貓的比較Tab.2 Comparison of premature estrus in giant pandas

圖1 2019 年發(fā)情期外生殖器的變化Fig.1 Changes of vulva during oestrus in 2019

圖2 2019 年尿中雌激素的變化Fig.2 Changes of estrogen in urine in 2019

3.3 氣候與環(huán)境

大熊貓分布具有一定的地域?qū)傩裕鼈兊纳盍?xí)性受環(huán)境氣候影響較大。曾有圈養(yǎng)大熊貓因科研和文化合作交流的需要前往其他國(guó)家和地區(qū)，由于當(dāng)?shù)嘏c原分布區(qū)和飼養(yǎng)地迥然不同的氣候?qū)е麓笮茇埑霈F(xiàn)了一定的應(yīng)激反應(yīng)，性周期紊亂，出現(xiàn)不發(fā)情或者異常發(fā)情的情況，在采取人為調(diào)整光周期和溫濕度等改善措施后，逐漸恢復(fù)正常[14-17]。暖暖出生于馬來(lái)西亞吉隆坡，并在當(dāng)?shù)厣顑赡甓嘀蠡氐剿拇ǘ冀?。馬來(lái)西亞屬熱帶國(guó)家，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，氣候炎熱，常年氣溫在25℃～30℃，都江堰處于亞熱帶區(qū)域，年平均氣溫處于10℃～22℃之間，四季分明氣候涼爽。兩地之間較大的氣候和環(huán)境差異對(duì)“暖暖”產(chǎn)生了一定的刺激，促使其過(guò)早發(fā)情。

關(guān)于大熊貓的性成熟年齡目前已有廣泛的研究，各飼養(yǎng)單位和研究機(jī)構(gòu)對(duì)大熊貓性成熟年齡的看法各不一致，但普遍認(rèn)為雄性大熊貓性成熟在5 歲以后，雌性大熊貓稍早一些，多在4 歲以后[17-20]。像“暖暖”這樣處于低齡就連年出現(xiàn)明顯發(fā)情行為的情況仍屬罕見(jiàn)。大部分動(dòng)物的性成熟滯后于體成熟，在初情期后還需要經(jīng)歷性成熟期才可進(jìn)行交配繁育后代。因此，雖然亞成體階段大熊貓身體機(jī)能已基本發(fā)育成熟，但并不意味著其具有正常交配，繁育后代的能力。這提示我們?cè)诖笮茇堬曫B(yǎng)管理中，應(yīng)根據(jù)不同年齡階段大熊貓的生長(zhǎng)特征來(lái)制定飼養(yǎng)管理措施，使其在不同的生長(zhǎng)階段保持適宜的生長(zhǎng)速度，合理控制好日常供應(yīng)尤其是精飼料等高熱量食物的進(jìn)食量，科學(xué)調(diào)整超重個(gè)體的飲食，如此方能減少或避免出現(xiàn)過(guò)早發(fā)情狀況。