趙仕博，趙永烈，鄧碩秋，張平安，林婧婧，郭 叢，劉 安，劉曉謙，易 紅，

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700）

偏頭痛是一種以單側(cè)或雙側(cè)搏動性頭痛為典型特征的慢性神經(jīng)血管功能紊亂性疾病[1]，可反復(fù)發(fā)作，遷延不愈。2021年公布的世界范圍疾病負(fù)擔(dān)統(tǒng)計表明，偏頭痛屬于全世界第六大常見疾病，位列全球致殘性疾病第2位，在中國排第5位[2]，是年齡低于50歲人群致殘的首要因素，給社會造成了沉重的負(fù)擔(dān)[3]。偏頭痛的病因病機復(fù)雜，發(fā)病機制仍未完全闡明[4-5]。目前認(rèn)可度較高的學(xué)說有三叉神經(jīng)血管反射學(xué)說[6]、皮質(zhì)擴展性抑制學(xué)說[7]等。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為偏頭痛屬于“頭痛”“頭風(fēng)”“偏頭風(fēng)”等范疇，病程較長，纏綿難愈。各種致病因素均可導(dǎo)致脈絡(luò)阻滯不通，不通則痛。研究表明，瞬時受體電位香草酸亞型1（TRPV1）、谷氨酸受體5（mGluR5）及血管活性物質(zhì)[如5-羥色胺（5-HT）、內(nèi)皮素-1（ET-1）、降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（iNOS）等]在偏頭痛發(fā)作過程中扮演著重要的角色[8]。

偏頭痛治療以口服藥為主，但近年來鼻內(nèi)療法更受青睞，展現(xiàn)出良好前景[9]。鼻內(nèi)療法多使用塞、滴、搐、嗅等法使藥物經(jīng)鼻腔吸收以治療疾病[10]?，F(xiàn)代解剖學(xué)研究顯示藥物經(jīng)鼻入腦主要通過嗅覺通路、三叉神經(jīng)通路起效[11]，具有起效快、避免肝臟首過效應(yīng)、快速穿過血腦屏障、操作簡便等優(yōu)點，非常適于急救、自救及疾病發(fā)作時的中止性治療。鼻內(nèi)療法可通過調(diào)節(jié)血管舒縮、調(diào)控痛覺通路、減少氧化應(yīng)激等改善偏頭痛癥狀[12]，國際頭痛學(xué)會建議使用鼻內(nèi)制劑治療偏頭痛急性發(fā)作[13]。

“一粒金”最早出自朱丹溪《丹溪心法》，是朱丹溪唯一明確提出用于治療偏頭痛的方劑。明代醫(yī)家萬表將原方中的青黛去掉，在《萬氏濟(jì)世良方》中記為一粒金搐鼻方。組成為蓽茇、藁本、延胡索、白芷、川芎。同時萬表提出以“出涎為度”的臨床用藥心得[14]。目前缺乏該方活性成分及作用機制的系統(tǒng)研究。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有系統(tǒng)性、相關(guān)性和預(yù)測性的特點，與中藥方劑組分復(fù)雜性相吻合，因此本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究一粒金（YLJ）經(jīng)鼻給藥對大鼠偏頭痛模型的作用，旨在為臨床應(yīng)用及新藥開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1.1 一粒金活性成分及作用 通過中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)檢索川芎、蓽茇、白芷、藁本、延胡索的化學(xué)成分，以口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30%和類藥性（drug-likeness,DL）≥0.18作為篩選指標(biāo)，篩選出一粒金包含的活性成分。通過TCMSP及成分靶點預(yù)測數(shù)據(jù)庫（Swiss Target Prediction，http：//www.swisstargetprediction.ch/）檢索和預(yù)測潛在作用靶點，借助數(shù)據(jù)庫將蛋白質(zhì)靶點名稱轉(zhuǎn)化為基因名。

1.1.2 偏頭痛相關(guān)靶點篩選 以“migraine”“migraine headache”為關(guān)鍵詞，從基因名片數(shù)據(jù)庫（Gene Cards，https：//www.genecards.org）、OMIM 數(shù) 據(jù) 庫（https://www.omim.org/）、UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）、TTD數(shù)據(jù)庫（http://db.idrblab.net/ttd/）進(jìn)行靶點檢索。將所有篩選結(jié)果進(jìn)行匯總、去重，得到偏頭痛相關(guān)靶點。

1.1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點篩選 將“1.1.1”中活性成分的作用靶點與偏頭痛相關(guān)靶點取交集，繪制韋恩圖。將藥物-疾病交集靶點輸入STRING平臺（https：//string-db.org），設(shè)置物種為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)置為Medium confidence（0.4），構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。將PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0軟件中，計算度值（DC）、介數(shù)中心性（BC）、接近中心性（CC），以上述拓?fù)鋮?shù)的中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)篩選核心靶點。

1.1.4 基因本體（GO）富集分析與京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對核心靶點進(jìn)行GO富集分析與KEGG通路富集分析，篩選條件為P＜0.05，對富集結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

1.2 動物實驗

1.2.1 實驗動物 8周齡SPF級健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g，購于維通利華（北京）有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2021-0011。所有動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動物室，普通飲食、飲水，溫度（22±1）℃，濕度（65±5）%，12 h晝夜循環(huán)光環(huán)境，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d。本實驗已通過中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，倫理批件號：2022B182。

1.2.2 藥物與試劑 川芎（批號：2101056）、延胡索（批號：2012001）、藁本（批號：2101007）均購于北京市雙橋燕京中藥飲片廠；蓽茇（批號：22012703）、白芷（批號：20112207）均購于北京人衛(wèi)中藥飲片有限公司。中藥由易紅研究員鑒定均為正品。佐米曲普坦（1 mL∶5 mg，山東京衛(wèi)制藥有限公司，批號：20100192）；硝酸甘油注射液（廣州白云山明興制藥有限公司，批號：H44020569）。

降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）ELISA檢測試劑盒（批號：20230222）、一氧化氮（NO）ELISA檢測試劑盒（批號：20230222）、一氧化氮合酶（iNOS）ELISA檢測試劑盒（批號：20230222）、內(nèi)皮素1（ET-1）ELISA檢測試劑盒（20230222）、5-羥色胺（5-HT）ELISA檢測試劑盒（20230222）、瞬時受體電位香草酸亞型1（TRPV1）ELISA檢測試劑盒（20230222）均購于南京建成生物工程研究所。第一代逆轉(zhuǎn)錄預(yù)混液RT-Mix（兩步法）（批號：GPL001N）購于北京金普來生物科技有限公司；Hieff UNICONUniversal Blue qPCR SYBR Green Master Mix（批號：H6201090）購于翌圣生物科技（上海）股份有限公司；實驗所用引物均購自上海生工生物工程有限公司。

1.2.3 主要儀器 YLS-12A型鼠尾光照測痛儀（濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）；KZ-II型高速組織研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；Spectramax i3x型多功能酶標(biāo)（Molecular Devices）；Tadvanced型PCR儀（AnalytikjenaBiometra）；qTowel-3G型實時熒光定量PCR儀（Analytikjena）；HeraeusFresco 21R型臺式高速冷凍離心機（Thermo Fisher）。

1.2.4 滴鼻液制備 中藥飲片加水煎煮2次，取藥液濃縮干燥，即得提取物，依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果和課題組前期研究結(jié)果確定給藥劑量，臨用前配置生藥質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0 g/mL的一粒金滴鼻液。佐米曲普坦鼻噴霧劑臨用前依據(jù)臨床等效劑量換算公式，使用注射用生理鹽水稀釋10倍（0.5 mg/mL）。

1.2.5 動物分組 60只大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，借助鼠尾光熱測痛儀測定基線。根據(jù)痛閾基線隨機分為6組，即對照（NC）組、模型（Model）組、一粒金低劑量（YLJ低劑量）組、一粒金中劑量（YLJ中劑量）組、一粒金高劑量（YLJ高劑量）組、佐米曲普坦（Zol）組，每組10只。

1.2.6 動物偏頭痛模型建立及給藥 除NC組外，其余各組大鼠參照文獻(xiàn)[15]建立慢性偏頭痛模型，即于第1、3、5、7、9天，頸背部皮下注射硝酸甘油（10 mg/kg）。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠出現(xiàn)持續(xù)至少30 min的雙耳發(fā)紅、煩躁不安、爬籠次數(shù)增多、四肢頻繁撓頭等現(xiàn)象，活動減少、蜷臥。NC組頸部皮下注射等量生理鹽水。

除NC組外，佐米曲普坦組（0.225 mg/kg，臨床等效劑量）、YLJ低劑量組（0.5 g/mL）、YLJ中劑量組（1.0 g/mL）、YLJ高劑量組（2.0 g/mL）大鼠頸背部皮下注射等量硝酸甘油后立刻滴鼻相應(yīng)藥物，給藥量均為50 μL。NC組、Model組鼻腔滴注等量生理鹽水。

1.2.7 標(biāo)本采集 第11天腹主動脈取血后心尖灌流預(yù)冷的生理鹽水，灌流后取腦組織并分離大腦皮層、延髓。

1.2.8 觀察指標(biāo)

1.2.8.1 大腦皮層NO、iNOS、5-HT、ET-1、CGRP、TRPV1含量 第11天采用1%戊巴比妥鈉（100 mg/kg）對大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉，麻醉后于心尖灌流預(yù)冷的生理鹽水，取腦組織，分離大腦皮層組織，制10%勻漿，收集上清液。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作檢測大腦皮層中NO、iNOS、5-HT、ET-1、CGRP、TRPV1水平。

1.2.8.2 TRPV1mRNA、mGluR5 mRNA表達(dá)水平 使用TRIzol分別提取大腦皮層、延髓部位的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進(jìn)行實時定量PCR反應(yīng)，檢測TRPV1 mRNA、mGluR5 mRNA表達(dá)水平，以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法，計算得到目標(biāo)mRNA相對表達(dá)量。所用引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料符合正態(tài)分布以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.1.1 一粒金靶點和偏頭痛疾病相關(guān)靶點的收集 分別獲得川芎活性成分7個，靶點1 371個；蓽茇活性成分15個，靶點671個；延胡索活性成分49個，靶點1 549個；白芷活性成分22個，靶點1 408個；藁本活性成分1個，靶點662個。（見表2）去重后一粒金活性成分的靶點基因共計372個。

表2 部分中藥活性成分

2.1.2 一粒金治療偏頭痛靶點關(guān)系互作分析 檢索獲得偏頭痛疾病靶點共2 346個。一粒金活性成分與偏頭痛疾病靶點共有195個共有靶點，即重要靶點。（見圖1）

圖1 一粒金與偏頭痛交集靶點韋恩圖

將195個重要靶點的基因ID導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI分析，使用Cytoscape 3.9可視化，獲得177個節(jié)點，1 418個節(jié)點邊。節(jié)點的顏色和大小反映度值，節(jié)點越大，度值越大，邊緣的顏色和線條粗細(xì)與度值相關(guān)。計算3個拓?fù)渲笜?biāo)的中值，得到69個核心目標(biāo)。（見圖2）AKT1、IL-18、VEGFA、TRPV1等即為關(guān)鍵靶點。

圖2 一粒金治療偏頭痛靶點關(guān)系互作分析

2.1.3 一粒金治療偏頭痛關(guān)鍵靶點GO分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對69個核心靶點進(jìn)行GO分析，獲得一粒金治療偏頭痛相關(guān)生物學(xué)注釋以及相關(guān)通路。共收集了34種生物過程（biological process，BP）、43種細(xì)胞組分（cellular component，CC）和70種分子功能（molecular function，MF）（P＜0.05）。（見圖3）一粒金在腫瘤壞死因子產(chǎn)生的正向調(diào)控、外周神經(jīng)系統(tǒng)開發(fā)、炎癥反應(yīng)中細(xì)胞因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)等方面有良好作用。

圖3 一粒金治療偏頭痛關(guān)鍵靶點GO 分析

2.1.4 關(guān)鍵靶點KEGG分析 通過DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫對核心靶點進(jìn)行KEGG富集分析。共得到155條路徑（P＜0.05）。一粒金治療偏頭痛的KEGG通路包括癌癥通路、PI3K/AKT通路、AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17通路、HIF1通路、MAPK通路等。（見圖4）

圖4 一粒金治療偏頭痛關(guān)鍵靶點KEGG 分析

2.1.5 一粒金-偏頭痛-關(guān)鍵靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將相關(guān)數(shù)據(jù)傳入Cytoscape 3.9軟件，生成一粒金組方中藥-關(guān)鍵靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，進(jìn)一步篩選度值＞7的關(guān)鍵靶點進(jìn)行作圖。（見圖5）其中綠色菱形節(jié)點為一粒金組成中藥，黃色圓形節(jié)點為度值＞7的關(guān)鍵靶點，藍(lán)色三角形節(jié)點為由關(guān)鍵靶點富集得到的通路。該網(wǎng)絡(luò)由131個節(jié)點和2 622條邊組成，節(jié)點越大度值越大。川芎、延胡索度值最大，靶點中度值最大的為PTGS2、MAPK1、ABCB1、AKT、BCL2、BDNF、CASP3、CCL2、EGFR、ICAM1、IL1B，重要通路包括Toll樣受體通路、HIF1通路、IL-17通路、JAK-STAT通路、TNF通路、MAPK通路等。

圖5 一粒金-偏頭痛-關(guān)鍵靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.2 動物實驗結(jié)果

2.2.1 各組大鼠大腦皮層NO、iNOS、ET-1、5-HT水平比較Model組大鼠大腦皮層NO、iNOS、ET-1水平高于NC組（P＜0.01），5-HT水平低于NC組（P＜0.01）；YLJ低劑量組、YLJ中劑量組、YLJ高劑量組、Zol組大鼠大腦皮層iNOS、ET-1水平均低于Model組（P＜0.01）；YLJ低劑量組大鼠大腦皮層NO、5-HT水平與Model組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；YLJ中劑量組、YLJ高劑量組、Zol組大鼠大腦皮層NO水平均低于Model組，5-HT水平均高于Model組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。（見圖6）

2.2.2 各組大鼠大腦皮層CGRP、TRPV1水平比較 Model組大鼠大腦皮層CGRP、TRPV1水平高于NC組（P＜0.01）；YLJ低、中劑量組大鼠大腦皮層CGRP、TRPV1水平與Model組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；YLJ高劑量組、Zol組大鼠大腦皮層CGRP、TRPV1水平均低于Model組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（見圖7）

圖7 各組大鼠大腦皮層CGRP、TRPV1 水平比較（±s，n=10）

2.2.3 各組大鼠大腦皮層和延髓中mGluR5 mRNA、TRPV1 mRNA相對表達(dá)量比較 Model組大鼠大腦皮層和延髓中mGluR5 mRNA、TRPV1 mRNA相對表達(dá)量高于NC組（P＜0.05或P＜0.01）；YLJ低劑量組大鼠大腦皮層和延髓中mGluR5 mRNA、TRPV1 mRNA相對表達(dá)量與Model組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；YLJ中劑量組、YLJ高劑量組、Zol組大鼠大腦皮層和延髓中mGluR5 mRNA、TRPV1 mRNA相對表達(dá)量均低于Model組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。（見圖8～9）

圖8 各組大鼠大腦皮層中mGluR5 mRNA、TRPV1 mRNA相對表達(dá)量比較 （±s，n=10）

圖9 各組大鼠延髓中mGluR5 mRNA、TRPV1 mRNA相對表達(dá)量比較 （±s，n=10）

3 討 論

偏頭痛可由視覺、嗅覺等因素誘發(fā)，多起病急，發(fā)作快[16]，與中醫(yī)理論風(fēng)邪致病情況一致。風(fēng)善行而數(shù)動，易襲陽位。偏頭痛主要致病因素為風(fēng)邪。后世眾多醫(yī)家對一粒金進(jìn)行實踐運用并加以改良，最終確定以川芎、蓽茇、白芷、延胡索、藁本為組方。方中君藥蓽茇為大辛大熱之品，是治療頭痛、鼻淵、牙痛要藥[17]。川芎上走頭目且通絡(luò)止痛，可治諸經(jīng)頭痛[18]。白芷散風(fēng)除濕，藁本祛風(fēng)散寒，延胡索活血散瘀。三藥共為佐藥。諸藥合用，共奏活血行氣止痛之功?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實白芷、延胡索不僅具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)、抗炎等作用，還具有不良反應(yīng)少、無成癮、鎮(zhèn)痛持久等優(yōu)點[19]。白芷水煎液可降低大鼠血清和腦組織中5-HT含量，提示白芷可能通過神經(jīng)活性配體-受體和5-HT能突觸通路，下調(diào)5-HT的含量，從而改善偏頭痛癥狀[20]。藁本具有抗炎、解熱、鎮(zhèn)痛、中樞抑制、抗血栓等藥理作用,可明顯延長小鼠常壓狀態(tài)下耐缺氧時間，起到擴張血管、改善腦部微循環(huán)、抗心肌缺血、缺氧的作用[21]。一粒金給藥方式為鼻竅給藥?！兜は姆ā分杏涊d“搐嚏流涎”，為排濁之法，可使?jié)彡幜鞒觯尻栔畾馔ㄐ?，快速治療疼痛[22]。

本研究首先借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對一粒金治療偏頭痛的藥效和機制進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一粒金可通過多靶點、多通路對偏頭痛發(fā)揮治療作用，涉及的關(guān)鍵靶點包括TRPV1、AKT1、VEGFA等，相關(guān)通路有TNF信號通路、MAPK信號通路等。結(jié)果表明其機制可能與血管反應(yīng)和炎癥過程相關(guān)。結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研，本研究后續(xù)實驗針對TRPV1及其相關(guān)因子展開研究。

一粒金可通過調(diào)節(jié)血清ET-1、NO、iNOS及5-HT水平來抑制腦血管異常擴張，進(jìn)而抑制神經(jīng)源性炎癥來減輕偏頭疼癥狀。TRPV1、mGluR5為關(guān)鍵因子之一，與臨床偏頭痛生物標(biāo)志物NO、CGRP均相關(guān)。一粒金可能通過調(diào)節(jié)炎癥、減輕凋亡等途徑發(fā)揮作用。TRPV1可被NO等內(nèi)源性或外源性刺激激活，引起Ca2+內(nèi)流。TRPV1上調(diào)會增加機械性痛覺和熱痛覺亢進(jìn)[22]，進(jìn)而導(dǎo)致三叉神經(jīng)感覺纖維末梢釋放CGRP等神經(jīng)遞質(zhì)[23]，引起神經(jīng)源性炎癥，繼而產(chǎn)生偏頭痛。mGluR5和TRPV1已被證明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)皮膚痛覺的轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[24-25]。在mGlu5受體激活期間，TRPV1通道介導(dǎo)的膜電流增強[26]。本研究結(jié)果表明一粒金可以抑制偏頭痛模型大鼠大腦皮層、延髓CGRP、TRPV1mRNA、mGluR5 mRNA表達(dá)水平從而治療偏頭痛。

綜上所述，一粒金能降低偏頭痛模型大鼠腦組織ET-1、NO、iNOS、CGRP、TRPV1等偏頭痛生物標(biāo)志物表達(dá)水平，升高腦組織5-HT水平，降低大腦皮層、延髓TRPV1 mRNA、mGluR5 mRNA表達(dá)水平，從而治療偏頭痛。鼻內(nèi)給藥起效快，可快速穿過血腦屏障，操作簡便，受試對象適從性好。后續(xù)實驗可進(jìn)一步從血管收縮舒張功能或炎癥水平方面研究一粒金對偏頭痛模型動物的改善作用，利用質(zhì)譜組學(xué)等技術(shù)研究一粒金的主要成分和藥理作用物質(zhì)基礎(chǔ)，并基于體外實驗和基因編輯技術(shù)對TRPV1等關(guān)鍵靶點進(jìn)行進(jìn)一步的驗證，從而為鼻腔滴注一粒金治療偏頭痛的臨床推廣提供依據(jù)。