延 華,柴春艷,張 丹,趙 媛,李 敏

(1.陜西省人民醫(yī)院老年病院,陜西 西安 710068;2.陜西省人民醫(yī)院保健辦,陜西 西安 710068)

隨著肥胖的流行和生活方式的改變,全球非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)已成為第一大慢性肝病的病因。NAFLD不僅可以導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化,還與肥胖、2型糖尿病、血脂異常等一起作為代謝綜合征的組分互為因果、相互影響[1]。所有這些代謝紊亂又均與胰島素抵抗(InsuIin resistance,IR)相關(guān)[2]。由于IR,胰島素升高通過與胰島素受體結(jié)合,并通過磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)蛋白激酶B(Akt)激活下游信號通路,從而刺激血糖攝取和儲存[3]。C-Jun N末端激酶(JNK)與IR密切相關(guān),并由炎癥細(xì)胞因子和游離脂肪酸(FFA)激活[3]。研究[4]表明,JNK的激活會加速脂質(zhì)積累并導(dǎo)致肝臟損傷。自噬是一個(gè)至關(guān)重要的生理過程,通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)儲存,消除受損的細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì),在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[5]。研究[6]報(bào)道,自噬與NAFLD發(fā)病機(jī)制有關(guān),自噬功能障礙已在NAFLD患者、NAFLD小鼠模型肝臟中被檢測到。JNK信號通路對自噬過程至關(guān)重要,JNK的激活有助于自噬基因Beclin-1的表達(dá),介導(dǎo)異常的自噬調(diào)節(jié)和介導(dǎo)p53磷酸化[7]。自噬異常干擾脂質(zhì)代謝,自噬功能異?？赡艽龠M(jìn)NAFLD發(fā)病。JNK、胰島素抵抗、自噬均與NAFLD的病理過程有關(guān)。然而,它們之間的關(guān)系還沒有被完全闡明。因此,了解JNK信號通路介導(dǎo)脂質(zhì)代謝的分子機(jī)制,對于尋求NAFLD新的治療方法具有重要意義。本文以NAFLD大鼠模型研究JNK信號通路在胰島素抵抗和自噬中的作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性SD大鼠40只,8周齡,180～200 g,來自西安交通大學(xué)動物中心。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng):溫度25 ℃,12 h光/暗循環(huán),以及自由采食標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室飼料和水。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 SP600125(No.S1460,EMD Millipore,Billerica,美國),ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司),放射免疫沉淀分析裂解緩沖液(No.20101ES60,中國海門生物技術(shù)研究所),Lowry蛋白測定試劑盒(No.C504031,Pierce,Thermo Fisher Scientific,Inc,美國),聚偏二氟乙烯膜上(No.DVPP00010,EMD Millipore,Bedford,MA,美國)。Anti-Akt(No.2920)、磷酸化(p)Akt(Ser473)(No.4060)、anti-Atg 3(No.3415)、anti-Atg 5(No.12994)、anti-LC-3(No.4108)、anti-Beclin 1(No.3783)(Cell Signaling Technology,Inc.,Danvers,MA,美國),anti-IRS1(No.05-784)、 anti-p-IRS1(Ser307)(No.05-1087)(均為EMD Millipore),抗IRβ (No.sc-711)、anti-p-IRβ(Tyr 1150/1151)(No.sc-81500)、anti-p-JNK1 (Thr183)(No.sc-135642)、anti-JNK1(No.sc-571)和抗GAPDH(No.sc-20357,Santa Cruz,美國)。磷酸緩沖鹽溶液(PBS,No.P1002北京索萊寶生物科技公司)。辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,Inc,美國)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動物模型制備:將大鼠隨機(jī)分為四組,正常飲食組(ND組,n=10)、高脂飲食組(HFD組,n=10)、JNK抑制劑SP600125治療組(SP60012520組,n=10)、磷酸鹽緩沖鹽水PBS對照組(Control組,n=10)。ND組喂食正常飼料,HFD組、SP600125組和Control組喂食高脂飼料(88%基礎(chǔ)飼料+2%膽固醇+10%豬油組成)20周,SP600125組大鼠腹腔注射SP600125(30 mg/kg體重)、Control組大鼠注射磷酸鹽緩沖鹽水PBS,每天1次,再延長8周。20周結(jié)束時(shí),ND組和HFD組用戊巴比妥鈉麻醉大鼠(40 mg/kg體重,腹腔內(nèi)注射),經(jīng)頸椎脫位處死后進(jìn)行生化分析,對大鼠的肌肉、脂肪和肝臟標(biāo)本進(jìn)行Western blot檢測。SP600125組和Control組治療后,大鼠頸椎脫位處死,進(jìn)行生化分析,并對大鼠肝臟標(biāo)本進(jìn)行Western blot檢測。

1.3.2 生化分析:使用ELISA試劑盒檢測血清FFA和胰島素水平。糖耐量測試在喂食ND或HFD 20周后進(jìn)行,禁食6 h后,ND組和HFD組大鼠腹腔注射葡萄糖(2.0 g/kg體重)。在不同時(shí)間點(diǎn)(0、15、30、60、120 min)尾靜脈采血,使用便攜式血糖儀[型號 860,江蘇魚躍醫(yī)療器材有限公司(南京)]檢測血糖水平。

1.3.3 胰島素抵抗測定:為了評估高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠肝臟是否出現(xiàn)胰島素抵抗,將大鼠禁食過夜,并腹腔注射胰島素(1.5 U/kg)。30 min后,分離肝臟并進(jìn)行Western blot檢測磷酸化胰島素受體β亞基(p-IRβ)和磷酸化胰島素受體底物-1(p-IRS-1)和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)。

1.3.4 Western blot檢測目的蛋白表達(dá):使用放射免疫沉淀分析裂解緩沖液從組織中分離蛋白。將勻漿在15000 r/min、4 ℃下離心30 min,丟棄顆粒。蛋白濃度用Lowry蛋白測定試劑盒,用8%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離20 g蛋白,樣品裝在聚丙烯酰胺凝膠上。隨后,凝膠中的蛋白質(zhì)被印跡到聚偏二氟乙烯膜上。用含0.1% Tween-20的5%脫脂牛奶在室溫下封膜1 h,然后在4 ℃下用一級抗體探針過夜。使用的主要抗體如下:Anti-Akt(1∶1000),磷酸化(p)Akt(Ser473)(1∶1000),anti-Atg 3(1∶1000),anti-Atg 5(1∶1000),抗LC-3(1∶100),anti-Beclin 1,anti-IRS1(1∶2000), anti-p-IRS1(Ser307)(1∶2000),抗IRβ(1∶500),anti-p-IRβ(Tyr 1150/1151)(1∶500),anti-p-JNK1 (Thr183)(1∶200),anti-JNK1(1∶400)和抗GAPDH(1∶10 000)。然后將印跡與相應(yīng)的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下放置1 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(EMD Millipore)對印跡進(jìn)行可視化,并將印跡暴露于薄膜中。使用Image 2.0版本(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,美國)進(jìn)行量化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)分析使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行,計(jì)量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ND組與HFD組大鼠血糖、游離脂肪酸及胰島素水平比較 腹腔注射葡萄糖后,ND組大鼠血糖濃度略有升高,但在120 min時(shí)降至空腹水平。HFD組大鼠血糖濃度逐漸升高,在60 min時(shí)達(dá)到峰值,到120 min尚未恢復(fù)正常水平,見表1。與ND組大鼠相比,HFD組大鼠血清中FFA和胰島素水平顯著升高(P<0.05),見表2。

表1 ND組與HFD組大鼠不同時(shí)間血糖水平比較(mmol/L)

表2 ND組與HFD組大游離脂肪酸及胰島素水平比較

2.2 ND組與HFD組大鼠肌肉、脂肪和肝臟組織中p-JNK1蛋白表達(dá)水平比較 檢測大鼠肌肉、脂肪和肝臟中p-JNK1蛋白的表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與ND組相比,HFD組的大鼠的p-JNK1蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),見圖1。

注:*P<0.05,**P<0.01圖1 ND組與HFD組大鼠肌肉、脂肪和肝臟組織中p-JNK1蛋白表達(dá)水平比較

2.3 ND組與HFD組大鼠肝臟自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較 與ND組相比,HFD組自噬相關(guān)蛋白LC-3Ⅱ、Beclin-1、Atg 5和Atg 3表達(dá)水平上調(diào)(均P<0.05),見圖2。

注:*P<0.05,**P<0.01圖2 ND組與HFD組大鼠肝臟自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較

2.4 ND組與HFD組大鼠胰島素抵抗指標(biāo)p-IRβ、p-IRS-1、p-Akt表達(dá)水平比較 與ND組相比,HFD組大鼠的p-IRβ、p-IRS-1和p-Akt表達(dá)水平升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見圖3。

注:*P<0.05,**P<0.01圖3 ND組與HFD組大鼠胰島素抵抗指標(biāo)p-IRβ、p-IRS-1、p-Akt表達(dá)水平比較

2.5 SP600125組和Control組大鼠p-JNK1和自噬相關(guān)蛋白、胰島素抵抗指標(biāo)比較 與Control組對比,SP600125組p-JNK1水平下降,SP600125組大鼠肝臟中自噬相關(guān)蛋白LC-3Ⅱ、Beclin-1、Atg 5、Atg 3以及p-IRβ、p-IRS-1和p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01),見圖4。

注:**P<0.01,***P<0.001圖4 SP600125組和Control組大鼠p-JNK1(A)和自噬相關(guān)蛋白(B)、胰島素抵抗指標(biāo)(C)比較

2.6 SP600125組和Control組大鼠FFA和胰島素水平比較 與Control組相比,高脂飲食喂養(yǎng)的SP600125組大鼠血清中FFA和胰島素水平顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表3。

表3 SP600125組和Control組大鼠FFA和胰島素水平比較

3 討 論

NAFLD是最常見的慢性肝病,與腹型肥胖、血脂異常、胰島素抵抗等代謝危險(xiǎn)因素密切相關(guān)[8-9]。近年來,NAFLD的發(fā)病率呈上升趨勢,但發(fā)病年齡呈下降趨勢[8]。然而,NAFLD的確切發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明,目前也沒有明確的藥物途徑來調(diào)節(jié)肝臟脂肪變性,降低胰島素抵抗,改善脂肪肝[10]。

由于胰島素抵抗,胰島素升高通過與胰島素受體結(jié)合,促進(jìn)IRβ亞基(IRβ)和IR底物-1 (IRS-1)的磷酸化,并通過PI3K-Akt激活下游信號通路,從而調(diào)節(jié)血糖攝取和儲存[3]。C-Jun N末端激酶(JNK包括JNK1、JNK2和JNK3亞型)與胰島素抵抗相關(guān),研究認(rèn)為JNK1、JNK2在高脂飲食喂養(yǎng)小鼠中介導(dǎo)胰島素抵抗,JNK可被炎性細(xì)胞因子和FFA激活,激活的JNK會使其下游的靶點(diǎn)IRS-1的絲氨酸307位點(diǎn)磷酸化,從而減弱胰島素敏感性[11]。研究[12]顯示,JNK激活能夠上調(diào)細(xì)胞中自噬相關(guān)基因Beclin-1和微管相關(guān)蛋白1A/1B輕鏈3 (LC-3)Ⅱ的表達(dá)水平,而SP600125(JNK的抑制劑)或JNK的敲低逆轉(zhuǎn)了這一過程。

雖然以往的研究已經(jīng)證實(shí)JNK、自噬和胰島素抵抗是相關(guān)的[13],但JNK在異常自噬和胰島素抵抗在NAFLD發(fā)病機(jī)制中的作用尚未闡明。本研究假設(shè)JNK信號通路可能是HFD誘導(dǎo)的胰島素抵抗及自噬功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。研究[14]表明,胰島素抵抗與NAFLD的病理進(jìn)展密切相關(guān),而JNK是胰島素信號通路中的關(guān)鍵分子。研究[15]表明,TNF-α、FFA和活性氧激活JNK,從而促進(jìn)胰島素抵抗的發(fā)生和進(jìn)展。在本研究中,在高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖大鼠中,JNK活性在胰島素敏感組織(如肝臟和脂肪)中顯著增加。激活的JNK使IRS-1的絲氨酸殘基磷酸化,從而導(dǎo)致胰島素抵抗。此外, JNK1已經(jīng)被報(bào)道作為一個(gè)關(guān)鍵的分子連接肥胖、炎癥和葡萄糖穩(wěn)態(tài)紊亂[16]。Ozcan等[17]報(bào)道肥胖誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能通過JNK的過度激活導(dǎo)致胰島素受體信號通路的抑制。越來越多的證據(jù)表明JNK可能被認(rèn)為是治療胰島素抵抗和糖尿病的一個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)[18]。因此,闡明JNK引發(fā)胰島素抵抗并導(dǎo)致NAFLD的確切機(jī)制非常必要。為了探討這種復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制,本研究測定了喂食ND或HFD的大鼠肌肉、脂肪和肝臟組織中的JNK活性,結(jié)果顯示JNK在HFD大鼠中被激活。

此外,Western blot分析表明,高脂飲食誘導(dǎo)大鼠肝臟發(fā)生自噬、IRS-1和Akt的磷酸化。自噬功能障礙可能導(dǎo)致肝臟內(nèi)脂質(zhì)過度積累,從而促進(jìn)NAFLD的發(fā)生和進(jìn)展。自噬相關(guān)基因表達(dá)、自噬小體的蛋白水平在肥胖脂肪組織和胰島素抵抗中被證明顯著增加[19]。本研究表明,在HFD喂養(yǎng)的大鼠中,IRS-1的絲氨酸307位點(diǎn)被過度磷酸化,同時(shí)p-Akt (Ser473)增加。此外,在高脂飲食大鼠肝臟中觀察到激活的自噬相關(guān)基因LC-3 Ⅱ、Beclin-1、Atg 5、Atg 3高表達(dá)。可以推測,JNK介導(dǎo)的自噬通路在胰島素抵抗中具有重要作用。這些結(jié)果可能為NAFLD的潛在治療提供一定依據(jù)。

JNK可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的自噬,以應(yīng)對各種應(yīng)激。Shimizu等[7]證明了滅活的JNK可以抑制自噬細(xì)胞死亡。此外,有研究[20]發(fā)現(xiàn)抑制JNK顯著抑制了H-ras介導(dǎo)的Atg 5誘導(dǎo)、自噬和細(xì)胞死亡。本研究結(jié)果表明,SP600125對JNK有抑制作用,降低了高脂飲食大鼠肝臟的自噬相關(guān)基因的表達(dá),并降低了胰島素及游離脂肪酸水平,預(yù)防了胰島素抵抗。但SP600125抑制HFD喂養(yǎng)大鼠肝臟自噬和改善胰島素抵抗的分子機(jī)制尚不清楚。

總之,本研究證明JNK介導(dǎo)的自噬與胰島素抵抗有關(guān),但還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來探索p-JNK干擾自噬相關(guān)基因表達(dá)并導(dǎo)致胰島素抵抗的分子機(jī)制。本研究也表明肥胖與JNK1活性異常升高密切相關(guān),選擇性下調(diào)JNK活性為治療人類肥胖、胰島素抵抗、2型糖尿病和NAFLD提供了一個(gè)有力的依據(jù)。JNK可能被認(rèn)為是預(yù)防和治療NAFLD的潛在藥物靶點(diǎn)。