馮一平,袁浩鑫,曾尚云,王思雨

(大同市第五人民醫(yī)院婦科,山西 大同 037009)

子宮內(nèi)膜癌在女性惡性腫瘤中有較高的發(fā)病率,多發(fā)于女性絕經(jīng)后,陰道不規(guī)則流血是其最典型癥狀[1-2]。目前手術(shù)聯(lián)合放化療可提高患者的5年生存率,但對于子宮內(nèi)膜癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的防治還沒有較好的治療策略。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟,在子宮內(nèi)膜癌的惡性進(jìn)展過程中起到重要的推進(jìn)作用[3-5]。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)是一個泛素連接酶,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)[6]。據(jù)報道,TRAF6可抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移[7]。本研究以人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa作為研究對象,提高TRAF6的表達(dá),探究TRAF6對人Ishikawa細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞、人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞ESC,上海ATCC細(xì)胞庫提供;BCA蛋白定量試劑盒,購自南京森貝伽生物科技有限公司提供;空載質(zhì)粒慢病毒載體、TRAF6質(zhì)粒慢病毒載體,廣州源井生物科技有限公司提供;兔抗人TRAF6、E-cadherin、Occludin、N-cadherin、Vimentin抗體,艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司提供;Trizol RNA分離試劑,賽默飛世爾科技(中國)有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組:將Ishikawa細(xì)胞用胰酶消化,移液器配合少量培養(yǎng)基進(jìn)行吹打,收集細(xì)胞,1500 r/min、4 ℃低溫離心10 min,制備單細(xì)胞懸液(5×104/ml),接種于6孔板(2 ml/孔)。通過轉(zhuǎn)染試劑將空載質(zhì)粒慢病毒載體或TRAF6質(zhì)粒慢病毒載體轉(zhuǎn)染入Ishikawa細(xì)胞中,記為NC組或TRAF6高表達(dá)組,對照組為未轉(zhuǎn)染的Ishikawa細(xì)胞。各組細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 RT-qPCR和WB法檢測人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中TRAF6 mRNA和蛋白表達(dá):胰酶消化收集Ishikawa細(xì)胞和ESC細(xì)胞于離心管。向離心管中滴加1 ml Trizol混勻充分裂解,12000 r/min、4 ℃低溫離心10 min,取上清與異丙醇混合后離心,留沉淀進(jìn)行RNA洗脫和再溶解。取RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,隨后進(jìn)行RT-qPCR。設(shè)置β-actin為內(nèi)參,引物序列見表1,以2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)。分別提取Ishikawa、ESC細(xì)胞總蛋白,并定量蛋白濃度。將50 μg蛋白與3倍體積的上樣緩沖液(4×)混勻,沸水浴變性10 min,凝膠孔中上樣,80 V電泳至蛋白Marker出現(xiàn)紅色標(biāo)度(70 kD),調(diào)整電壓為130 V,溴酚藍(lán)距底部約0.5 cm,停止電泳,轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶將膜封閉后,與一抗溶液(1∶500稀釋的TRAF6抗體)孵育1 h,洗滌后浸入二抗溶液(1∶1000稀釋的羊抗兔IgG抗體)孵育1 h,顯色后拍照,通過Image J軟件分析結(jié)果。

表1 引物序列

1.2.3 Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲能力:1.2.1中細(xì)胞經(jīng)胰酶消化,并重懸(2×105個/ml),在Transwell上室(基質(zhì)膠包被)中加入100 μl細(xì)胞懸液,將500 μl細(xì)胞培養(yǎng)基(含10% FBS)加入下室,孵育24 h后,將穿過膜的細(xì)胞固定、結(jié)晶紫染色,光鏡下計數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力:取1.2.1中細(xì)胞,細(xì)胞層用無菌槍頭(200 μl)垂直劃線形成劃痕,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,光鏡下于0 h和24 h分別拍照。通過Image Pro Plus 6.0系統(tǒng)分析0 h和24 h的劃痕面積,計算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(1-24 h劃痕面積/0 h劃痕面積)×100%。

1.2.5 WB檢測細(xì)胞E-cadherin、Occludin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá):取1.2.1中細(xì)胞,根據(jù)全蛋白提取試劑盒說明書操作,提取細(xì)胞總蛋白,檢測E-cadherin、Occludin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)。

1.2.6 裸鼠移植瘤實驗:取1.2.1中細(xì)胞,胰酶消化收集,無菌PBS重懸為5×106/ml的單細(xì)胞懸液,注射器抽取200 μl注射于裸鼠右側(cè)腋窩皮下,對應(yīng)細(xì)胞分組分別記為對照組、NC組和TRAF6高表達(dá)組,每組10只。接種后對裸鼠狀況密切關(guān)注,14 d后處死裸鼠,觀察腫瘤侵襲周圍臟器情況以及肺、肝臟有無腫瘤轉(zhuǎn)移情況。

2 結(jié) 果

2.1 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞、人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中TRAF6 mRNA和蛋白表達(dá)比較 相較于ESC細(xì)胞,Ishikawa細(xì)胞的TRAF6 mRNA水平和蛋白表達(dá)顯著降低(均P<0.05),見表2。

表2 ESC和Ishikawa細(xì)胞中TRAF6 mRNA和蛋白表達(dá)比較

2.2 TRAF6對Ishikawa細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響 與對照組相比,TRAF6高表達(dá)組穿膜細(xì)胞數(shù)、劃痕愈合率降低(均P<0.05);NC組與對照組相比,穿膜細(xì)胞數(shù)、劃痕愈合率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05),見表3。

表3 各組穿膜細(xì)胞數(shù)和劃痕愈合率

2.3 TRAF6對上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響 與對照組和NC組相比,TRAF6高表達(dá)組E-cadherin、Occludin蛋白表達(dá)升高,N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平降低(均P<0.05),見表4。

表4 TRAF6對E-cadherin、Occludin、N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)的影響

2.4 TRAF6對裸鼠大體腫瘤侵襲周圍臟器的影響 接種各組細(xì)胞后密切關(guān)注裸鼠狀況,三組裸鼠在成瘤后均表現(xiàn)出不同程度的精神欠佳和消瘦。裸鼠大體解剖肉眼觀察,可見皮下腫瘤包膜完整、光滑、質(zhì)硬,與皮膚及周圍組織無明顯粘連。其中對照組和NC組相較于TRAF6高表達(dá)組,可見裸鼠肺、肝臟表面存在粗糙暗沉,質(zhì)硬、粟粒狀改變,表明對照組和NC組Ishikawa細(xì)胞可引起腫瘤侵襲周圍臟器肺及肝臟,而TRAF6高表達(dá)組未出現(xiàn)明顯轉(zhuǎn)移情況。

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖道常見惡性腫瘤[8-9]。大量研究[10-12]發(fā)現(xiàn),子宮內(nèi)膜癌有淋巴轉(zhuǎn)移的患者在進(jìn)行手術(shù)以及放化療后,5年生存率仍不可觀,而無淋巴轉(zhuǎn)移的患者則預(yù)后較好。因此,如何阻斷子宮內(nèi)膜癌的侵襲和轉(zhuǎn)移,成為提高其臨床治療效果和患者生存率的關(guān)鍵。

TRAF6可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多條信號通路,參與細(xì)胞發(fā)育、免疫、穩(wěn)態(tài)等過程[13-15],并且在癌癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[16]。Hu等[17]研究發(fā)現(xiàn),降低TRAF6的表達(dá)會使宮頸癌細(xì)胞活力增強。Muto等[18]研究發(fā)現(xiàn),TRAF6通過直接靶向MYC致癌活性在髓系惡性腫瘤中發(fā)揮腫瘤抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn),與人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞ESC相比,人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa中TRAF6低表達(dá);本研究進(jìn)一步構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)TRAF6的Ishikawa細(xì)胞來驗證其作用,結(jié)果顯示高表達(dá)TRAF6的Ishikawa細(xì)胞的侵襲和遷移能力均顯著低于對照組,裸鼠移植瘤實驗結(jié)果也證實高表達(dá)TRAF6的Ishikawa細(xì)胞的體內(nèi)成瘤轉(zhuǎn)移現(xiàn)象不明顯。以上結(jié)果提示高表達(dá)TRAF6可抑制子宮內(nèi)膜癌的侵襲遷移,表明TRAF6在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要作用。

在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中,腫瘤細(xì)胞的上皮特征消失,獲得成纖維細(xì)胞樣形態(tài),隨后發(fā)展為間質(zhì)表型[19]。此時細(xì)胞的上皮標(biāo)志蛋白(如E-cadherin、Occludin等)表達(dá)減少,細(xì)胞極性和黏附性降低,而間質(zhì)標(biāo)志蛋白(如N-cadherin、Vimentin等)表達(dá)增加,細(xì)胞侵襲和遷移能力升高[20]。研究顯示,在婦科癌癥(卵巢癌、宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化中,E-cadherin下調(diào),N-cadherin、Vimentin上調(diào)[21];且E-cadherin是子宮內(nèi)膜癌預(yù)后良好的潛在標(biāo)志物[22]。據(jù)報道,TRAF6可通過抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[7]。本研究結(jié)果顯示,相較于對照組,TRAF6高表達(dá)組E-cadherin、Occludin蛋白水平升高,N-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平降低。提示TRAF6可阻斷上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程,抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲遷移。

綜上所述,TRAF6在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要的調(diào)節(jié)作用,過表達(dá)TRAF6抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲、遷移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究為子宮內(nèi)膜癌治療靶標(biāo)的相關(guān)研究提供理論和實驗依據(jù),后續(xù)將進(jìn)行TRAF6作用機制的深入探討。