王小禹,周 寧,黃 芩,甘利娟

(1.江油市九O三醫(yī)院病理科,四川 江油 621700;2.綿陽四O四醫(yī)院病理科,四川 綿陽 621000)

前列腺癌是男性最常見的癌癥,也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。血清前列腺特異度抗原(Prostate specific antigen,PSA)檢測常用于輔助診斷前列腺癌,但其特異度不理想,導(dǎo)致對非致命性疾病的過度治療[2-3]。多參數(shù)磁共振成像(mpMRI)技術(shù)的引入改善了對疑似前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)分類[4],但仍存在完善和進(jìn)步的空間。關(guān)于前列腺癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物,目前的研究聚焦于無創(chuàng)的尿液或血液檢測[5]。新興的癌基因蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5(Protein arginine methyltransferase 5,PRMT5)是蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(Protein arginine methyltransferases,PRMTs)家族中的一種Ⅱ型酶,可將組蛋白和非組蛋白底物的精氨酸殘基甲基化[6]。越來越多的證據(jù)表明,PRMT5通過表觀遺傳和非表觀遺傳機(jī)制在多種癌癥中作為致癌基因起作用。Deng等[7]研究發(fā)現(xiàn),PRMT5在轉(zhuǎn)移性激素敏感性前列腺癌和去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞中通過表觀遺傳激活雄激素受體的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長。因此,本研究旨在分析PRMT5 在前列腺癌組織中的表達(dá)及其與患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系,并評估PRMT5對前列腺癌的診斷效能。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2019年1月至2022年6月在江油市九O三醫(yī)院泌尿外科行根治性前列腺癌切除術(shù)的96例患者為觀察組,另選取同期經(jīng)尿道前列腺電切術(shù)的70例良性前列腺增生患者作為對照組。病例納入標(biāo)準(zhǔn):①觀察組患者均經(jīng)影像學(xué)及病理檢查確診為前列腺癌;②首次進(jìn)行前列腺癌根治手術(shù);③對照組患者均存在下尿路癥狀(尿頻、尿急、尿道口灼燒樣痛),并經(jīng)影像學(xué)及病理檢查確診為良性前列腺增生;④未患有其他內(nèi)分泌、免疫或代謝疾病;⑤意識(shí)清醒,認(rèn)知正常,能正常交流。排除標(biāo)準(zhǔn):①嚴(yán)重心、肝、腎功能不全者;②合并其他惡性腫瘤;③合并傳染性疾病者;④精神異常者。所有研究對象知情同意且研究通過本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)染色檢測前列腺組織中PRMT5表達(dá)水平 手術(shù)標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定,石蠟包埋、切片,采用兔鏈霉卵白素-生物素兩步法檢測試劑盒(購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行免疫組化染色,檢測步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。PRMT5抗體購自美國Abcam公司。采用DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒(購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)顯色,蘇木素復(fù)染細(xì)胞核、封片、鏡檢。

1.3 前列腺組織PRMT5 mRNA表達(dá)水平檢測 取前列腺組織100 mg置于液氮中保存。提取組織總RNA,測定RNA純度后,采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以此為模板,采用RT-qPCR檢測PRMT5的表達(dá)水平。按照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒(貨號(hào)Q111-02,購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司)方法,采用20 μl擴(kuò)增體系,程序如下:95 ℃ 變性30 s;56 ℃ 退火30 s;72 ℃ 延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參計(jì)算基因表達(dá)量,采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 血清PRMT5表達(dá)水平檢測 抽取兩組患者外周靜脈血 5 ml,室溫靜置30 min,3000 r/min,4 ℃離心10 min,取上清液置于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。采用酶?lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測血清PRMT5表達(dá)水平,試劑盒購自美國Bio Vision公司(貨號(hào)E4977),檢測步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 觀察指標(biāo) ①比較兩組患者的一般資料,包括年齡、體重指數(shù)(BMI)、吸煙飲酒史;②比較兩組患者病理切片PRMT5染色陽性面積,組織PRMT5 mRNA表達(dá)水平和血清PRMT5的水平;③統(tǒng)計(jì)前列腺癌患者臨床病理特征,比較不同病理特征下血清PRMT5的表達(dá)情況;④分析血清PRMT5與PSA的相關(guān)性及血清PRMT5水平對前列腺癌的風(fēng)險(xiǎn)性;⑤評估血清PRMT5及PRMT5、PSA聯(lián)合對前列腺癌的診斷效能。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者一般資料比較 兩組患者年齡、BMI、吸煙飲酒方面比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),見表2。

表2 兩組患者一般資料比較

2.2 兩組患者PRMT5表達(dá)水平比較 病理切片免疫組化染色結(jié)果顯示,與良性前列腺增生組織相比,PRMT5陽性區(qū)域在前列腺癌組織中顯著增加(P<0.001),提取兩組組織RNA,RT-qPCR結(jié)果顯示,前列腺癌組織中PRMT5 mRNA表達(dá)水平高于對照組,血清PRMT5水平高于對照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.001),見表3。

表3 兩組患者PRMT5表達(dá)水平比較

2.3 PRMT5表達(dá)水平與前列腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系 PRMT5表達(dá)在不同年齡、腫瘤大小不同的前列腺癌患者間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。PRMT5表達(dá)與前列腺癌患者Gleason評分、微血管侵犯、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及血清PSA水平有關(guān):Gleason評分大于7分、存在微血管侵犯、TNM分期為Ⅲ-Ⅳ、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及血清PSA水平大于等于10 ng/ml的前列腺癌患者的PRMT5表達(dá)高于Gleason評分小于7分、沒有微血管侵犯、TNM分期為Ⅰ-Ⅱ、未發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移以及血清PSA水平低于10 ng/ml的前列腺癌患者(均P<0.05)。見表4。

表4 PRMT5表達(dá)水平與前列腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系(ng/ml)

2.4 PRMT5與PSA相關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,血清PRMT5水平與PSA的水平呈顯著正相關(guān)(r=0.536,P<0.001),見圖1。

圖1 PRMT5與PSA相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.5 血清PRMT5水平對前列腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)的多因素Logistic回歸分析 將血清PRMT5水平和PSA水平作為自變量,同時(shí)納入年齡、Gleason評分因素,以前列腺癌為因變量(未發(fā)生=0,發(fā)生=1),構(gòu)建多因素Logistic回歸方程,結(jié)果顯示,血清PRMT5水平升高,將增加前列腺癌患病風(fēng)險(xiǎn),血清PRMT5升高是前列腺癌的危險(xiǎn)因素。見表5。

表5 血清PRMT5水平對前列腺癌患病風(fēng)險(xiǎn)的多因素Logistic回歸分析

2.6 血清PRMT5、PRMT5聯(lián)合PSA對前列腺癌的診斷效能 ROC曲線分析結(jié)果顯示,血清PRMT5截?cái)嘀禐?4.230 ng/ml對診斷前列腺癌具有良好的靈敏度(84.38%)和特異度(87.14%),曲線下面積(AUC)為0.910(95%CI:0.866～0.953,P<0.001)。PRMT5聯(lián)合PSA的AUC為0.968(95%CI:0.947～0.989,P<0.001),靈敏度為95.83%,特異度為82.86%,截?cái)嘀禐?.393。以上結(jié)果表明,血清PRMT5水平對前列腺癌具有良好的診斷價(jià)值,PRMT5聯(lián)合PSA對前列腺癌的診斷具有更好的價(jià)值。見表6(圖2)。

圖2 PRMT5、PRMT5聯(lián)合PSA診斷前列腺癌的ROC曲線

表6 PRMT5、PRMT5聯(lián)合PSA對前列腺癌的診斷效能

3 討 論

蛋白質(zhì)精氨酸甲基化是一種常見的翻譯后修飾形式,以 S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine,SAM)為甲基供體,通過酶催化作用將SAM中的甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到目的蛋白精氨酸胍基氮分子上[8]。PRMT主要有9個(gè)成員:PRMT1～9。精氨酸甲基化修飾分為單甲基化、對稱性雙甲基化和非對稱性雙甲基化修飾。PRMT 的主要功能包括 DNA 修復(fù)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控及細(xì)胞周期調(diào)控等[9]。PRMT家族蛋白及其介導(dǎo)的精氨酸甲基化修飾與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PRMT1在胰腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、乳腺癌、膀胱癌和肺癌等腫瘤組織中高表達(dá)[10-12]。Yang等[6]研究發(fā)現(xiàn),通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子 Twist1 34位精氨酸的甲基化進(jìn)而參與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程,并抑制上皮鈣黏附蛋白(E-cadherin)的表達(dá),導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。Li等[13]報(bào)道了PRMT2 在乳腺癌組織中高表達(dá)。PRMT3 的酶活性在肺癌、胰腺癌和乳腺癌中明顯升高[14]。PRMT6 在肺癌患者中的表達(dá)水平升高,且與預(yù)后不良有關(guān)。Miranda等[15]研究發(fā)現(xiàn),PRMT7 在惡性乳腺癌組織和轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)增高,并通過催化E-cadherin啟動(dòng)子對稱二甲基精氨酸的形成提高甲基化修飾水平,從而導(dǎo)致 E-cadherin的表達(dá)下調(diào),細(xì)胞間黏附能力降低,促進(jìn)了癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。此外,PRMT7在肺癌組織中的表達(dá)高于正常肺組織,在肺癌細(xì)胞中過表達(dá) PRMT7增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲能力[16]。Jiang等[17]報(bào)道了PRMT9在肝癌細(xì)胞中表達(dá)水平較高,且與肝癌患者的生存率呈負(fù)相關(guān)。而PRMT5則是被發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、食管癌和胃癌等腫瘤組織中表達(dá)水平增高[18-20]。Li等[21]研究發(fā)現(xiàn),PRMT5在肺癌中的表達(dá)上調(diào),使用其特異度抑制劑GSK591或shRNA抑制或下調(diào)PRMT5的表達(dá)可顯著增強(qiáng)白藜蘆醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和化學(xué)敏感性,進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的增殖遷移。同時(shí),Zhu等[22]研究發(fā)現(xiàn),PRMT5可以與腫瘤基因產(chǎn)物核糖體蛋白S10(RPS10)作用,催化其158位和160位精氨酸殘基發(fā)生甲基化,調(diào)控核糖體的裝配過程,影響蛋白質(zhì)合成。

前列腺癌是男性最常見的癌癥之一,據(jù)報(bào)道,全世界每年有超過35萬男性死于前列腺癌。改善前列腺癌的臨床診斷方法以及尋找新的治療靶點(diǎn),是目前臨床上急需解決的問題。Deng等[7]研究發(fā)現(xiàn),PRMT5能夠激活雄激素受體(Androgen receptor,AR)的轉(zhuǎn)錄,通過與轉(zhuǎn)錄因子特異度蛋白1(Specificity protein 1,SP1)相互作用被招募至AR啟動(dòng)子周圍,并在 AR 的近端啟動(dòng)子區(qū)域與依賴腺苷三磷酸的染色質(zhì)重構(gòu)因子(Brg1)形成復(fù)合物進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長。此外,Gu等[23]研究發(fā)現(xiàn),前列腺癌細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的 PRMT5 能夠促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長,而細(xì)胞核內(nèi)的 PRMT5 則抑制前列腺癌細(xì)胞的生長,具體機(jī)制尚有待研究。

在本研究中,我們檢測了前列腺癌組織、血液樣本中PRMT5的水平,發(fā)現(xiàn)PRMT5在前列腺癌組織中高表達(dá),其表達(dá)與血清PSA水平呈正相關(guān)。傳統(tǒng)前列腺癌的診斷依賴于患者血液中PSA的檢測和組織活檢檢查,盡管前列腺癌的新興標(biāo)志物日益增多,且PSA在某些前列腺良性疾病中也可出現(xiàn)升高,如:良性前列腺增生或前列腺炎,但PSA仍在前列腺癌患者的篩查、治療、療效判斷及監(jiān)測復(fù)發(fā)等過程中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用[24]。本研究證明了血清PRMT5具有與血清PSA水平類似的識(shí)別前列腺癌的能力,并表明PRMT5與PSA結(jié)合進(jìn)一步提高了診斷效能。

綜上所述,PRMT5水平在前列腺癌患者組織和血清中顯著升高,是前列腺癌患病的危險(xiǎn)因素,且與血清PSA呈正相關(guān),PRMT5可進(jìn)一步發(fā)展為一種非侵入性前列腺癌診斷生物標(biāo)志物,為研究前列腺癌的防治提供了新的思路。