張 令,敬 怡,劉 琪,張曉彤,韓 鵬

(1.西安交通大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,陜西 西安 710061;2.西安交通大學第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,陜西 西安 710004;3.山陽縣人民醫(yī)院耳鼻喉科,陜西 山陽 726400)

在世界上最常見的惡性腫瘤中,頭頸部癌癥(Head and neck cancer,HNC)位于第6位,約 90% 的HNC在病理上均屬于鱗狀細胞癌(Squamous cell carcinoma,SCC),其主要的發(fā)生部位分布于口腔、口咽、下咽及喉部[1-4]。因此我們用頭頸部鱗狀細胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)將上述惡性腫瘤統(tǒng)一歸類,簡稱為頭頸鱗癌[5-6]。HNSCC的5年生存率相對較低,總體預后相對較差,致死率相對較高,給患者生命健康帶來極大危害[7-8]。HNSCC根據(jù)發(fā)病因素不同主要分為兩類:一類是由于長期吸煙及飲酒所致;另一類是因感染了人類乳頭狀病毒(Human papillomavirus,HPV)而引起[9-10]。世界衛(wèi)生組織的研究表明,在西方發(fā)達國家,HNSCC中口咽癌主要病因為HPV感染;然而在我國約80%的口咽癌是由長期吸煙及飲酒所致,僅20%口咽癌是由HPV感染引起,并且多數(shù) HPV陽性的口咽癌患者常伴有吸煙史[11-14]。既往研究表明,DNA修復能力(DNA repair capacity,DRC)降低、核苷酸剪切修復(Nucleotide excision repair,NER)基因mRNA表達水平降低分別與HNSCC的易感性增加有關,但單一水平的標志物對預測HNSCC發(fā)病風險的作用較為局限性,且該方法預測的準確度和精確度相對較低[15-18]。值得注意的是目前尚無將DRC和NER標志物相結(jié)合的來評估HNSCC的發(fā)病風險的研究。因此,本研究將基于82例HNSCC和81例健康對照,通過整合DRC水平和NER通路標志物來預測HNSCC的發(fā)病風險。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究選取2015-2021年間就診于西安交通大學第一附屬醫(yī)院的82例HNSCC患者和81例無癌對照者進行分析。為了避免種族間人種的差異,本研究僅選取中國漢族人群作為研究對象,在抽取研究對象外周血前詢問其個人信息、病史及相關的流行病學資料,主要內(nèi)容包括對年齡、性別、生活習慣(吸煙、飲酒等)及家族史。本研究檢測項目通過西安交通大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過,所有入選研究對象檢測前均告知相關風險及簽署知情同意書。病例組的選擇標準為:新診斷為HNSCC,18歲以上,未患過其他腫瘤,被病理診斷為口腔、咽部(除外鼻咽部)及喉部的SCC,未接受過任何治療。對照組的選擇標準為:18歲以上,與病例組年齡和性別相匹配,未患過任何癌癥的個體。為了避免研究對象的重復,我們僅選取每個患者的一個朋友或非血緣關系的親屬參與研究。排除標準:年齡未滿18歲;不愿提供相應的血液標本;中途退出研究;接受過任何化療或放療的研究對象。

1.2 研究方法

1.2.1 Trizol法從血液中提取RNA:首先,從患者的血液標本中提取淋巴細胞,并將已處理的各組淋巴細胞棄培養(yǎng)液,用溫度為4 ℃的PBS清洗細胞培養(yǎng)板,重復3次;每孔加入Trizol試劑1 ml,將細胞培養(yǎng)板置于冰上約15 min裂解后,反復吹打,裂解細胞,將裂解液置入1.5 ml EP 管中;將200 μl 的三氯甲烷加入每個小管,封閉好小管,劇烈震蕩55～65 s,并在室溫下放置10～15 min,充分裂解;在4 ℃、轉(zhuǎn)速12000 r/min下,將裂解液離心14～16 min,離心后樣品分層,RNA分布于上層水相內(nèi),吸取上層;取上清液至清潔的DEPC處理過的EP管,將異丙醇0.6 ml加入管中,上下輕柔顛倒約3～5次混勻,在-20 ℃冰箱內(nèi)放置約2～3 h;4 ℃、12000 r/min,離心10～15 min,棄上清液,可見沉于管底的RNA;取1 ml 75% 乙醇加入沉淀中,沉淀物溫和吹起即可;4 ℃、10000 r/min,離心10～15 min,盡量棄除上清液;將EP管倒置于濾紙上4～6 min,不要徹底干燥;加入10 μl DEPC水溶解RNA樣品,備用;對OD值進行測定,得到RNA的濃度,按照試劑盒說明要求將RNA轉(zhuǎn)成cDNA,并置于-80 ℃冰箱中。

1.2.2 NER基因的PCR實驗[17]: PCR反應體系如下:每個擴增反應在5 μl含有5 ng互補DNA、0.25 μl引物和2.5 μl Master混合物的最終體系中進行。PCR反應在384孔光學平板中進行,終體積為5 μl反應混合物。熱循環(huán)條件如下:95 ℃、5 min,然后在95 ℃變性15 s,40 ℃循環(huán),60 ℃退火、延伸1 min。以18 s作為內(nèi)參,Ct值為PCR實驗中每個反應內(nèi)的信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。通過ΔCt計算8個NER基因相對于18 s的表達水平。ΔCt值是目標基因的Ct值減去其18 s的Ct值,即ΔCt=Ct(NER基因)-Ct(18 s)。ΔCt值越小,靶基因mRNA的相對表達水平越高。所有NER基因 mRNA及18 s rRNA的引物由美國 Applied Biosystems公司提供并保留引物序列信息。

1.2.3 宿主細胞再活化實驗(HCR):通過梯度離心法從患者外周血中分離出T淋巴細胞,并將其儲存在低溫冰箱中,記錄儲存時間;純化的pCMV-CAT質(zhì)粒經(jīng)BPDE(由西安交通大學第一附屬醫(yī)院科研平臺提供)處理后,再次純化后儲存于冰箱中。DRC的活性

被定義為轉(zhuǎn)染BPDE處理質(zhì)粒細胞的CAT活性除以轉(zhuǎn)染未被處理質(zhì)粒細胞的CAT活性[15]。

1.3 統(tǒng)計學方法 使用SAS統(tǒng)計學軟件進行分析。用卡方檢驗分析病例組與對照組之間的年齡、性別、吸煙和飲酒狀況的差異;采用Wilcoxon秩和檢驗比較病例組與對照組之間的DRC水平和NER mRNA表達水平(連續(xù)變量)的差異;通過Logistic回歸將DRC和NER mRNA表達水平進行了相關性分析;通過ROC曲線計算曲線下面積(AUC),對DRC和NER mRNA相對表達水平對HNSCC發(fā)病風險的診斷價值進行評價,并通過Logistic回歸構(gòu)建四個水平進行比較,分別為基礎水平、NER基因水平、DRC水平及整合水平;基礎水平僅包括年齡、性別、吸煙狀態(tài)及飲酒狀態(tài);NER基因水平包括NER基因的mRNA相對表達水平,再加上基礎水平中的變量;DRC水平包括DRC和基礎水平中的變量;整合水平包括DRC、NER基因的mRNA相對表達水平以及基礎水平中的變量。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較 見表1。病例組與對照組性別及年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05),病例組吸煙占比高于對照組(P<0.05),兩組飲酒人群比例比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 兩組一般資料比較

2.2 病例組與對照組DRC水平及NER基因mRNA表達水平的差異及相關性 見表2～5。病例組的DRC(連續(xù)變量)平均水平顯著低于對照組[(9.84±2.32 ) %與(10.35±2.42)%;Z=-3.241,P=0.013]。細胞的儲存時間(CST),病例組時間長于對照組[(10.21±8.43)個月與(8.26±5.11)個月;Z=-8.120,P<0.001]。在9個NER基因中,病例組的XPA的表達水平均顯著低于對照組(Z=-2.316,P=0.022)。不同部位腫瘤的DRC、XPA水平比較差異無統(tǒng)計學意義;XPA mRNA的表達水平與DRC水平具有相關性(r=-0.096,P=0.031)。

表2 兩組DRC及CST水平比較

表3 兩組NER mRNA表達水平比較

表4 不同部位腫瘤的DRC、XPA表達水平比較

表5 NER基因 mRNA表達水平與DRC水平的相關性

2.3 通過整合DRC和NER mRNA表達預測HNSCC發(fā)病風險 通過ROC曲線計算AUC面積,構(gòu)建四個水平對DRC和NER mRNA相對表達對HNSCC發(fā)病風險預測的可靠性進行評價。相比于不包含DRC的基礎水平,DRC水平中ROC曲線中AUC面積顯著增加(P=0.043)。用整合水平來評估DRC與NER mRNA這兩種生物標志物對HNSCC發(fā)病風險預測的診斷價值,與單一的DRC水平相比,整合了DRC與XPA表達水平的ROC曲線中AUC顯著增加(P=0.032);此外,與單一的NER基因水平(XPA)相比,整合兩種標志物的水平ROC曲線中AUC也得到了改善(P=0.037)。

3 討 論

既往研究發(fā)現(xiàn)HNSCC患者的DRC或NER mRNA水平明顯低于健康對照組,這表明在中國人群中兩者水平的降低可以分別作為一個獨立的生物標志物來預測HNSCC的易感性[15-18]。由于單一的生物標志物在預測HNSCC易感性上具有局限性,因此我們將NER基因mRNA表達水平也加入到ROC曲線中作為整合水平來預測HNSCC的發(fā)病風險。結(jié)果顯示相比于只含有單一NER表型的水平,整合水平對于HNSCC的易感性的預測效能更高。

DNA修復在多種生物過程中發(fā)揮著重要作用,DNA修復通路的功能障礙會導致不同類型癌癥的發(fā)生[19]。此外,許多吸煙相關癌癥的分子流行病學研究都包括DNA修復通路的遺傳易感性,其中單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和基因突變已被廣泛研究[20]。然而,既往文獻關于此的流行病學研究結(jié)果一直不確定。表型的生物標志物,比如DRC,可以檢測由同一途徑中不同基因的少數(shù)遺傳變異決定的功能差異。事實上,已經(jīng)有研究者提議將DRC作為包括HNSCC在內(nèi)的幾種癌癥的易感性生物標志物[15,21]。

在非西班牙裔的白種人的研究中,DRC低水平的患者患HNSCC的風險是DRC高水平患者的1.91倍[15]。DRC表型可能體現(xiàn)了參與DNA修復通路的各種酶的一般活性,這表明,在相關分析中,特定DRC水平的評估比使用單個SNP或一個基因中的一組SNP具有一些優(yōu)勢[15]。然而,在本研究中,HPV狀態(tài)未進行檢測,這可能對DRC有一定影響。此外,在一個種族群體中發(fā)現(xiàn)的生物標志物在另一個種族群體中可能沒有相同的用處;因此,這種關聯(lián)需要在另一個種族組中進行驗證。在本研究中,我們證實了在中國人群中DRC降低與HNSCC易感性增加具有相關性。

既往研究表明,在包括DRC水平中,ROC曲線下AUC顯著改善[15]。更重要的是,我們在DRC水平中加入了NER基因表達作為一個新的整合水平,與僅包含DRC或NER基因表達的水平相比,包含DRC水平和NER基因表達水平能夠顯著提高ROC曲線下AUC。進一步表明,結(jié)合NER通路的DRC以及mRNA表達水平可以顯著提高NER表型HNSCC風險預測的效能。

目前的流行病學研究是第一個整合DRC及NER表型來分析兩者與HNSCC發(fā)表風險之間的相關性研究。雖然單個NER表型(即mRNA表達)的分析很容易進行,但該數(shù)據(jù)在預測HNSCC的風險時可能存在不可靠因素,因為PCR檢測的結(jié)果可能隨著不同的細胞階段而波動。因此,為了提高預測的準確性,有必要整合另一個相關表型來預測HNSCC的發(fā)病風險。ROC曲線的AUC分析表明,在中國人群中,整合DRC水平和NER基因mRNA表達可以顯著提高預測HNSCC發(fā)病風險的效能。

此外,本研究存在一些局限性。首先,在病例與對照研究中,盡管我們在招募病例和對照時應用了嚴格的頻數(shù)匹配策略,以控制潛在的混雜變量,但是遺傳選擇偏倚仍然無法避免。第二,目前的研究沒有包括任何遺傳易感性的信息,雖然DNA修復基因的突變和SNP也可能影響個體的DRC,但DNA修復表型的測量在很大程度上已經(jīng)反映了所有可能的遺傳變異的以及其全部功能。第三,盡管我們在目前的研究中排除了HPV陽性受試者及其可能帶來的影響,但是在HPV陽性受試者中是否會有相同的結(jié)果尚未知,因此在未來我們的研究結(jié)果應該在更多HPV陽性病例的研究中進行驗證。