黃璞 薛長穎

（大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院，大連 116000）

有機(jī)磷農(nóng)藥（Organophosphorus pesticides，OPs）是一類含有磷元素的有機(jī)農(nóng)藥，因其具有與乙酰膽堿類似的結(jié)構(gòu)，可直接抑制蟲類的膽酰酯酶，具有顯著的殺蟲效果。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，有機(jī)磷農(nóng)藥的使用量占農(nóng)藥總使用量的34%以上[1]，是我國使用量較大的一類農(nóng)藥。盡管有機(jī)磷農(nóng)藥能高效保護(hù)農(nóng)作物在生長過程中免受病蟲害的侵蝕，然而在使用過程中，農(nóng)藥會滲透進(jìn)入土壤，同時也會殘留在植株上。殘留的農(nóng)藥經(jīng)瓜果蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品最終富集到人體中，不同程度地危害人體健康[2]，輕者可引起急性中毒，使人出現(xiàn)呼吸困難、心律紊亂、缺氧和昏迷等癥狀；長期累積還會導(dǎo)致肝臟、心臟等內(nèi)部器官受損，也會引起嬰幼兒基因突變、發(fā)育畸形甚至癌癥等慢性中毒的現(xiàn)象。因此，為了防止有機(jī)磷農(nóng)藥殘留對人體健康的危害，發(fā)展快速、靈敏地檢測果蔬等農(nóng)產(chǎn)品中有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的技術(shù)十分必要，并且意義重大。

目前，常用的有機(jī)磷農(nóng)藥檢測方法有色譜法[3]、酶聯(lián)免疫分析法[4]、電化學(xué)法[5]和熒光法[6]等。其中，色譜法和質(zhì)譜法是傳統(tǒng)的檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的方法，需要大型設(shè)備、配備齊全的實(shí)驗(yàn)室和專業(yè)的檢測人員，不適于現(xiàn)場快速檢測。電化學(xué)方法盡管具有檢測范圍廣、方便快捷和檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，但在實(shí)際樣品檢測過程中，該方法易受環(huán)境因素干擾，檢測結(jié)果不穩(wěn)定。熒光法是一種基于不同有機(jī)磷分子對紫外光或可見光的吸收波長不同而發(fā)展起來的檢測方法，能夠靈敏、快速和選擇性地檢測有機(jī)磷農(nóng)藥，并可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測；但熒光法需要使用高濃度的熒光團(tuán)，易導(dǎo)致熒光聚集猝滅。酶聯(lián)免疫法是一種需要酶或熒光標(biāo)記顯示檢測結(jié)果的檢測方法，檢測過程復(fù)雜耗時。上述方法雖然比較簡單，但都需要額外的操作或設(shè)備輔助讀取檢測結(jié)果，不適于簡便快捷的實(shí)時檢測。因此，開發(fā)免標(biāo)記、簡便快速、高靈敏度和高選擇性的有機(jī)磷農(nóng)藥快速實(shí)時檢測方法是一個重要的研究方向。近年來，生物傳感技術(shù)被視為傳統(tǒng)檢測方法的補(bǔ)充或替代方法，因其可簡化檢測過程中樣品的制備流程，使現(xiàn)場檢測更簡便和快捷，因而受到廣泛關(guān)注。

生物傳感器一般由分子受體和換能器2 個元件組成。分子受體是一種用于識別分析物的元件，目前，用于有機(jī)磷農(nóng)藥檢測的分子受體通常為乙酰膽堿酯酶（AChE）[7]、堿性磷酸酯酶（ALP）[8]和適配體[9]等。換能器是一類將分析物與分子受體相互作用產(chǎn)生的生物或化學(xué)信號轉(zhuǎn)換為可供檢測的光信號、熱信號、聲信號或電子信號的元件，產(chǎn)生的信號強(qiáng)度通常與分析物的濃度成比例關(guān)系。這些信號轉(zhuǎn)換通常需要熒光或酶標(biāo)記，以及儀器輔助讀取結(jié)果，不便于快速實(shí)時檢測。液晶（Liquid crystals，LCs）是介于液體和固體之間的一種特殊的物質(zhì)狀態(tài)，液晶基元既能感知其周周的微小變化，又能將這種變化轉(zhuǎn)化為肉眼可辨的信號，集感知和信號轉(zhuǎn)換功能于一體?；谶@些優(yōu)點(diǎn)，液晶在快速檢測方面展現(xiàn)了獨(dú)特的優(yōu)勢和應(yīng)用前景。液晶傳感已被應(yīng)用于蛋白質(zhì)、核酸、重金屬離子、微生物等化學(xué)或生物分子[10-14]的檢測中，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和食品安全等領(lǐng)域。

本文主要對液晶傳感進(jìn)行簡要介紹，并針對近年來液晶傳感在有機(jī)磷農(nóng)藥檢測方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為研究和開發(fā)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的快速檢測技術(shù)提供參考。

1 液晶傳感器的檢測原理及構(gòu)建方式

1.1 液晶傳感器的檢測原理

根據(jù)生成方法的不同，液晶可分為熱致型和溶致型。熱致型液晶是基于溫度變化產(chǎn)生的，當(dāng)溫度逐漸上升時，固態(tài)的晶格結(jié)構(gòu)逐漸形成有一定分子序列的中間相。熱致型液晶的分子通常為桿狀或圓盤狀，并且分子結(jié)構(gòu)含有剛性的苯基或聯(lián)苯，一端連接烷烴鏈，另一端是極性基團(tuán)。熱致型液晶分子對基底表面的物理或化學(xué)變化極其敏感。依據(jù)分子排列方式和有序性的不同，熱致型液晶又分為向列相、近晶相和膽甾相。溶致型液晶主要是在溶液體系中形成，分子的一側(cè)是親水區(qū)域，另一側(cè)是疏水區(qū)域。將溶質(zhì)與溶劑按照適當(dāng)比例混合后，雙親性溶質(zhì)在溶劑中形成特殊的排列結(jié)構(gòu)，進(jìn)而表現(xiàn)出中間相，液晶相結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變是由溶液濃度變化引起的。本文主要關(guān)注熱致型液晶的使用，目前在液晶傳感技術(shù)中，應(yīng)用最為廣泛的熱致型液晶是向列相液晶4-氰基-4′戊基聯(lián)苯（5CB）。

液晶分子一般為剛性的棒狀分子，如向列相液晶是圓柱對稱的，存在一個分子長軸和短軸。液晶分子也是極性分子，由于分子間作用力，當(dāng)液晶分子集合在一起時，分子長軸總是互相平行的，其長軸的平均趨向即是其擇優(yōu)取向。另外，由于液晶分子的兩端和側(cè)面所接的分子基團(tuán)不同，其在長軸和短軸方向上的性質(zhì)也有所不同，導(dǎo)致液晶具有各向異性的特點(diǎn)，光學(xué)各向異性的性質(zhì)是液晶顯示的工作基礎(chǔ)。液晶會對入射光產(chǎn)生兩束折射光，一束折射光遵守折射定律（稱為尋常光，o 光），在晶體內(nèi)各個方向的光速相等，折射率相等，光的折射方向不變；另一束折射光不遵守折射定律（稱為非尋常光，e 光），在各個方向的光速不等，折射率也不相等，光的折射方向發(fā)生變化，這即是液晶的雙折射特性（圖1A）。當(dāng)入射光為偏振光時，液晶會使透光的光軸發(fā)生變化，產(chǎn)生兩束相位差不同的折射光束，通過檢偏器，出射光變?yōu)榭梢姷?、人眼能感知的具有灰度特征的圖像。液晶分子的取向不同，透光光軸的傾斜程度不同，兩束折射光間的相位差發(fā)生變化，出射光的顏色也發(fā)生相應(yīng)的改變。因此，具有垂直排列取向的液晶分子的紋理在正交偏振器下的視野會變暗（圖1B（a））；非垂直排列取向的液晶分子在正交偏振器下的視野是明亮的，并且由于兩條正交光線之間的干涉，通過正交偏振器可以觀察到液晶的彩色光學(xué)紋理（圖1B（b））。關(guān)于液晶分子光學(xué)特性的詳細(xì)介紹可進(jìn)一步參考其它文章[15]。

圖1 （A）液晶分子雙光軸示意圖；（B）在偏光光學(xué)顯微鏡（POM）下，光透過（a）垂直于平面排列和（b）平行于平面排列的液晶的光路圖Fig.1 (A)Schematic of birefringence of liquid crystals(LCs);(B)Light path through LCs with(a)homeotropic orientation and (b) plannar orientation under polarized optical microscope (POM)

液晶分子對表界面拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的變化非常敏感，任何分析物引起的外部刺激導(dǎo)致的微小表界面變化都可使液晶分子的取向改變。一方面，表面分子的尺度結(jié)構(gòu)會影響液晶分子的取向，例如，玻璃基底被連有甲基基團(tuán)的硅烷試劑修飾后，當(dāng)硅烷化試劑的烷基鏈碳鏈原子數(shù)為6～10 時，液晶呈現(xiàn)傾斜于表面的排列；當(dāng)烷基鏈碳鏈原子數(shù)大于12 且處于某個范圍之間時，液晶呈現(xiàn)垂直于表面的排列，如液晶在二甲基十八烷基[3-（三甲氧基硅基）丙基]氯化銨（DMOAP）和十八烷基三氯硅烷（OTS）等修飾的基底[16]。另一方面，其它分子與液晶分子之間的相互作用力（如氫鍵、靜電相互作用和配體配位作用等）也會影響液晶分子的取向，例如，在水溶液中加入對硝基苯酚，由于酚類物質(zhì)的酚羥基與5CB 分子氰基間的氫鍵作用，液晶/水界面上傾斜排列的液晶5CB 會由傾斜于平面取向轉(zhuǎn)變成垂直于平面取向[17]。文獻(xiàn)[18]從分子水平上詳細(xì)介紹了液晶的自由能及彈性，但錨定能量變化的潛在機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

液晶對表界面微小變化的敏感及其光學(xué)各向異性的特點(diǎn)是液晶傳感技術(shù)的基礎(chǔ)。液晶傳感器設(shè)計的基本原則是引入目標(biāo)檢測物后，液晶分子從特定的初始排列狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌肿优帕袪顟B(tài)，隨著液晶分子取向的變化，液晶元件的光學(xué)特性發(fā)生變化，從而輸出可辨的視覺信號[19]。構(gòu)建液晶傳感器首先需要對基底進(jìn)行修飾，以固定識別分子并誘導(dǎo)液晶分子形成有序的初始排列；然后，利用識別分子與待測物質(zhì)之間的相互作用產(chǎn)生的空間尺度變化或者界面作用力變化，使液晶分子取向重新排布，這一取向變化會改變液晶對可見光折射和偏振的能力，使得液晶膜顏色和亮度發(fā)生變化，從而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的檢測識別。另外，為使液晶分子更好地響應(yīng)樣品中的分析物，提高對低濃度或小分子物質(zhì)的檢測能力，研究者利用納米材料與待測物形成復(fù)合物的方法增加待測物的空間尺寸，進(jìn)而放大信號[20-21]，使得液晶分子的取向變化更靈敏。同時，也有研究者利用目標(biāo)分析物與識別分子反應(yīng)后的產(chǎn)物引起摻雜入體系中的納米材料發(fā)生反應(yīng)，進(jìn)而引起液晶取向的變化，實(shí)現(xiàn)信號放大[22]。這些方法在有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測中都取得了一定的進(jìn)展。

1.2 液晶傳感器的構(gòu)建方式

液晶傳感器的構(gòu)建對實(shí)現(xiàn)待測物質(zhì)的檢測至關(guān)重要，基于傳感器界面相的不同，可將液晶傳感器分為液晶-固相傳感器和液晶-液相傳感器。

1.2.1 液晶-固相傳感器的構(gòu)建

液晶-固相傳感器主要采用構(gòu)筑液晶池的方式。液晶被夾在兩個功能化的玻璃表面之間，識別分子被固定在功能化的基底表面。這種傳感器制備操作簡單，性能穩(wěn)定，受外界干擾小，易于定量分析，常用于檢測有機(jī)磷農(nóng)藥、DNA、抗原、抗體、病毒和多肽等物質(zhì)[23-26]。

液晶-固相傳感器的制備主要分為3 步：（1）基底的修飾；（2）識別分子的固定；（3）液晶池的構(gòu)建?；仔揎椀哪康氖钦T導(dǎo)液晶分子的有序初始排列，目前采用的方法有物理摩擦法[27]、金膜法[28-29]和自組裝法[30]等。物理摩擦法是利用尼龍、纖維以及棉絨等材料對取向膜定向摩擦。該方法操作簡單，但容易破壞基底表面，并且固定的功能分子容易脫落。金膜法是在基底表面電鍍上一薄層金，這對操作技術(shù)和設(shè)備要求都比較高，并且構(gòu)建成本也較高。因此，自組裝修飾的方法目前被普遍用于制備液晶傳感器基底，最常用的修飾分子是硅烷化試劑，如DMOAP 和OTS 等。另外，基底的表面通常還需引入功能分子，以固定識別分子，常用的功能分子有3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）和三乙氧基硅基丁醛（TEA）等，用于連接蛋白質(zhì)和氨基酸等生物識別分子。液晶池的構(gòu)建如圖2A 所示，即將兩片玻璃基底和液晶以三明治的方式構(gòu)建，其中，上層基底通常是DMOAP 或OTS 修飾的玻片，以誘導(dǎo)液晶分子垂直排列；下層通常是識別分子修飾的玻璃基底；兩片玻璃基底之間以薄膜（6～20 μm）隔開，液晶依靠虹吸力進(jìn)入兩玻璃片夾層，形成液晶池，實(shí)物如圖2B 所示。

圖2 液晶池（A）示意圖及其（B）實(shí)物圖Fig.2 (A) Schematic and (B) real image of LCs cell

1.2.2 液晶-液相傳感器的構(gòu)建

液晶-液相傳感器的構(gòu)建主要有網(wǎng)格法和液滴法。（1）網(wǎng)格法 在經(jīng)DMOAP 或OTS 處理過的載玻片上平鋪透射電子顯微鏡（TEM）銅網(wǎng)或金網(wǎng)，將液晶注入到網(wǎng)格中并把多余的液晶用毛細(xì)管吸走后，將其置于待檢測溶液中而得到液晶-液相檢測界面[31-33]，如圖3A 所示。網(wǎng)格法最早由Abbott 研究組設(shè)計構(gòu)建[34]，其優(yōu)點(diǎn)在于實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)的微型化和陣列化，易于定量分析。目前，采用網(wǎng)格法構(gòu)建的液晶-液相傳感器已被應(yīng)用于DNA 檢測[35]、細(xì)胞毒性測試[36]、磷脂酶的性質(zhì)研究[37]和胰蛋白酶檢測[38]等。（2）液滴法 是一種直接將液晶或液晶與表面活性劑等的混合物滴加于基底表面，觀察檢測物引入前后液晶織構(gòu)變化的方法[39]。此方法是基于液晶液滴具有較大的比表面積及豐富的形貌織構(gòu)。液滴表面錨定能量的微小變化會在指向矢場中發(fā)生顯著變化，通過偏光顯微鏡可觀察到形貌織構(gòu)的變化[40]。液滴法主要通過在液晶中摻雜包括表面活性劑在內(nèi)的兩親分子形成液晶-液相界面以構(gòu)建傳感器，如圖3B 所示。目前，采用液滴法構(gòu)建的液晶-液相傳感器已被用于檢測卡那霉素[41]、青霉素酶[42]和尿素[43]等物質(zhì)。

圖3 液晶-液相傳感器的構(gòu)建示意圖：（A）網(wǎng)格法，透射電子顯微鏡（TEM）銅網(wǎng)或金網(wǎng)被平鋪于經(jīng)二甲基十八烷基[3-（三甲氧基硅基）丙基]氯化銨（DMOAP）或十八烷基三氯硅烷（OTS）處理過的載玻片上后，（a）液晶在水/液晶（LC）界面傾斜于平面的取向，以及（b）加入表面活性劑后液晶在水/液晶界面上呈現(xiàn)垂直于平面的取向；（B）液滴法，不含表面活性劑的液滴以及含有表面活性劑的液滴被滴加在基底表面后，液晶在偏光顯微鏡下呈現(xiàn)（a）扇形及（b）十字花的織構(gòu)Fig.3 Schematic of liquid crystal-aqueous phasesensor.(A) Schematic diagram of method based on grid.In transmission electron microscopy (TEM) copper or gold mesh laying on dimethyloctadecyl [3-(trimethoxysilyl)propyl]ammonium chloride(DMOAP)or octadecyltrichlorosilane(OTS)treated slides:(a)LCs incline to planar orientation at the water/LCs interface and(b)LCs show perpendicular orientation at the water/LCs interface after addition of surfactants.(B) Schematic of method based on droplet: (a) In the absence of surfactants,LCs show sector texture under polarizing microscope,and (b) in the presence of surfactants,LCs exhibit cross-flower texture under polarizing microscope

2 液晶傳感器在有機(jī)磷農(nóng)藥檢測中的應(yīng)用

液晶能夠感知周圍微小的變化，并將其感知轉(zhuǎn)化成肉眼可辨的信號，這有助于其在有機(jī)磷農(nóng)藥的快速便攜式檢測中的應(yīng)用。迄今為止，已有許多液晶傳感方法被開發(fā)用于有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測，不同檢測方法的主要區(qū)別在于其識別分子的選取。本文將以其中應(yīng)用的3 種主要識別分子（酶、金屬離子以及適配體）為分類，對液晶傳感器用于有機(jī)磷農(nóng)藥檢測的進(jìn)展進(jìn)行分析總結(jié)。

2.1 基于酶反應(yīng)的液晶傳感器

由于酶可選擇性地與底物發(fā)生反應(yīng)，因此，酶抑制、酶催化和酶水解等反應(yīng)機(jī)制被應(yīng)用于液晶傳感。在添加有機(jī)磷農(nóng)藥前后，由于上述酶反應(yīng)，液晶分子的空間取向會發(fā)生變化，從而輸出不同的光學(xué)信號，通過觀測這些光學(xué)信號可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的檢測。具體而言，有機(jī)磷農(nóng)藥具有與乙酰膽堿類似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，可特異性地與AChE 結(jié)合，當(dāng)有機(jī)磷農(nóng)藥存在時，能夠抑制AChE 的活性，使其無法催化乙酰膽堿的水解反應(yīng)，從而使液晶傳感器在“有/無”有機(jī)磷農(nóng)藥時的響應(yīng)不同，基于此，實(shí)現(xiàn)對有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測。目前，AChE 是檢測有機(jī)磷過程中使用最多的一類酶，作為傳感器識別分子的酶還有丁酰膽堿酯酶（BChE）[44]、酪氨酸酶[45]以及堿性磷酸酯酶（ALP）[8]等。

AChE 作為識別分子，通常與肉豆蔻酰膽堿（Myr，表面活性劑，可誘導(dǎo)液晶分子垂直排列）聯(lián)合使用。AChE 水解Myr，使液晶空間取向發(fā)生變化，當(dāng)有機(jī)磷農(nóng)藥（AChE 抑制劑）存在時，AChE 無法水解Myr，導(dǎo)致液晶空間取向不同，從而實(shí)現(xiàn)對有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測。Wang 等[46]報道了一種基于AChE 的液滴檢測平臺。此平臺用AChE 介導(dǎo)表面活性劑Myr 的水解，破壞表面活性劑的單分子膜，液晶與預(yù)先孵育的AChE 和Myr 混合物接觸時，產(chǎn)生明亮的扇形液晶圖案（圖4A 右圖）；當(dāng)仲丁威和樂果等AChE 抑制劑加入后，抑制了AChE 對Myr 的水解，使液晶呈現(xiàn)深色十字形（圖4A 左圖），由此實(shí)現(xiàn)了對農(nóng)藥仲丁威和樂果的檢測，檢出限分別為1 ng/mL 和0.1 ng/mL。Nguyen 等[47]展示了一種基于液晶的微毛細(xì)管傳感平臺，液滴通過向經(jīng)OTS 處理的微毛細(xì)管中依次注入液晶和水溶液而形成。當(dāng)LCs 液滴與非表面活性劑溶液（如PBS 溶液）接觸時，在POM 下可觀察到兩條亮線的光學(xué)圖像，與LCs 分子在水/LCs 界面的垂直取向耦合（圖4B（a））。在引入Myr 溶液后，Myr 分子的兩親特性使其錨定在水/LCs 界面上，導(dǎo)致LCs 分子的取向發(fā)生變化而呈現(xiàn)四瓣結(jié)構(gòu)的光學(xué)圖像（圖4B（b）），與界面處LC 分子的水平取向耦合。AChE 催化Myr 水解成膽堿和肉豆蔻酸，水解的Myr 無法在水/LCs 界面形成單層，液晶重新垂直排列，呈現(xiàn)兩條亮線（圖4B（c））。因此，當(dāng)液晶與Myr 和AChE 的預(yù)孵育混合物接觸時，受限的LCs 液滴呈現(xiàn)出兩條亮線的光學(xué)圖像，對應(yīng)于LCs 的垂直取向。如果混合物中存在抑制AChE 的殺蟲劑，AChE 無法水解Myr，Myr錨定在界面上，導(dǎo)致液晶液滴呈現(xiàn)四瓣結(jié)構(gòu)的光學(xué)圖像，依據(jù)光學(xué)呈現(xiàn)的變化可實(shí)現(xiàn)對有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測。該傳感平臺對仲丁威和馬拉硫磷的檢出限分別為5.0 和2.5 pg/mL。與傳統(tǒng)的液滴方法相比，這種微毛細(xì)管的方法具有更低的檢出限，這可能是由于微毛細(xì)管的小尺度效應(yīng)導(dǎo)致。該方法為高靈敏度的農(nóng)藥殘留檢測提供了一種簡單、低成本、快速和無標(biāo)記的策略，顯示出巨大的實(shí)際應(yīng)用潛力。

圖4 （A）基于液滴法的液晶傳感原理示意圖：在液滴中加入能夠水解肉豆蔻酰膽堿（Myr）的乙酰膽堿酯酶（AChE）后，界面處的液晶取向由垂直轉(zhuǎn)變?yōu)閮A斜于平面，POM 下液晶圖像的變化（由深色十字形變?yōu)槊髁恋纳刃危┍砻鞔嬖谥俣⊥驑饭鸞46]；（B）微毛細(xì)管型液晶傳感檢測仲丁威和馬拉硫磷[47]Fig.4 (A) Schematic of LC sensor based on a LC droplet.After adding acetylcholinesterase (AChE) that can digest myristoylcholine (Myr) into LC droplet,the orientation of LCs changes from the homeotropic to the plannar.The change of LC images under POM(from the dark cross appearances to thebright fan-shaped images)shows the presence of baycarbor dimethoate[46].(B)Schematic of microcapillary-based LC sensor for detection of sec-butylvinyl and malathion[47]

基于酶解反應(yīng)的液晶傳感器，除AChE 外，有機(jī)磷農(nóng)藥對堿性磷酸酶的活性也有影響。Zhou 等[48]基于堿性磷酸酶（ALP）水解反應(yīng)，采用液滴法構(gòu)建了一個簡單可靠的液晶傳感平臺，用于敵敵畏（DDVP）的靈敏和簡便的檢測。ALP 與表面活性劑十二烷基磷酸酯鈉鹽（SMP）的混合溶液可使液晶呈現(xiàn)扇形的織構(gòu)（圖5A）；而預(yù)先將DDVP 與ALP 混合，再加入SMP 溶液，則會誘導(dǎo)液晶出現(xiàn)十字花的織構(gòu)（圖5B），據(jù)此實(shí)現(xiàn)了對DDVP 的檢測，檢出限達(dá)0.1 ng/mL。該研究也對西紅柿樣本中的DDVP 殘留進(jìn)行了檢測。該方法雖然沒有進(jìn)一步降低有機(jī)磷農(nóng)藥的檢出限，但將ALP 作為識別分子引入液晶傳感中，打破了酶識別方法對成本昂貴的AChE 的依賴，在有機(jī)磷農(nóng)藥檢測方面展現(xiàn)了更加經(jīng)濟(jì)有效的應(yīng)用價值。

圖5 基于十二烷基磷酸酯鈉鹽（SMP）與堿性磷酸酶（ALP）混合溶液的液晶傳感平臺檢測敵敵畏（DDVP）的原理示意圖[48]：（A）未加入DDVP 時液晶滴呈扇形結(jié)構(gòu)；（B）DDVP 存在時液晶滴呈十字花的結(jié)構(gòu)Fig.5 Schematic of LCS sensing platform based on the mixed solution of sodium monododecyl phosphate(SMP)and alkaline phosphatase(ALP)for detection of dichlorvos(DDVP)[48]:(A)LC droplets show fan-shaped textures without DDVP;(B) LC droplets show cruciform textures in the presence of DDVP

近年來，以納米金（AuNPs）和納米銀（AgNPs）為代表的納米材料因具有優(yōu)異的金屬特性、大比表面積、小尺寸效應(yīng)和獨(dú)特的光學(xué)效應(yīng)等特征，已被應(yīng)用在有機(jī)磷農(nóng)藥的快速檢測方面，用于轉(zhuǎn)換、放大檢測信號或降低檢出限。Liao 等[49]將納米金與AChE 和液晶傳感技術(shù)相結(jié)合，對乙酰膽堿及其抑制劑即有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行檢測。AChE 催化AuCl4–還原為AuNPs，極大地影響了液晶分子的排列取向，導(dǎo)致液晶分子在偏光顯微鏡下的信號增強(qiáng)（圖6），實(shí)現(xiàn)了直觀檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的目的，對有機(jī)磷農(nóng)藥的檢出限低至0.1 ng/mL。通常，AChE 只對樣品中總的有機(jī)磷化合物有響應(yīng)，無法區(qū)分有機(jī)磷的具體類別，研究人員嘗試應(yīng)用AuNPs 并同時基于同種活化劑對不同類別的有機(jī)磷農(nóng)藥抑制AChE 的活性程度不同進(jìn)行活化實(shí)驗(yàn)[50]，進(jìn)而區(qū)分甲胺磷、敵百蟲和對硫磷這3 種不同種類的有機(jī)磷農(nóng)藥。這種應(yīng)用對酶活性抑制程度不同的機(jī)理檢測不同種類有機(jī)磷農(nóng)藥的方法為有機(jī)磷農(nóng)藥種類的區(qū)分識別提供了新思路。

圖6 液晶生物傳感器與金納米顆粒（AuNPs）的逐步組裝示意圖[49]Fig.6 Schematic of the stepwise assembly of LC biosensor with gold nanoparticles (AuNPs)[49]

除AuNPs 和AgNPs 外，其它納米材料也被用于液晶傳感檢測有機(jī)磷農(nóng)藥。如Qi 等[51]利用多金屬氧酸鹽/表面活性劑超分子微球構(gòu)建了一個基于液晶的有機(jī)磷農(nóng)藥檢測傳感平臺。自組裝球由聚甲醛、十二鎢磷酸鈉（PW12）和表面活性劑Myr 的雜化材料組成（圖7A）。表面沉積的超分子微球被AChE 水解時，液晶顯示出明亮的外觀（圖7C），對應(yīng)于液晶在水/液晶界面上的水平取向。當(dāng)有機(jī)磷農(nóng)藥存在時，由于其為AChE 的有效抑制劑，不會使AChE 發(fā)生水解，液晶在界面處垂直排列，呈現(xiàn)黑暗的光學(xué)圖像（圖7B）。液晶取向及其光學(xué)輸出在有/無有機(jī)磷農(nóng)藥時展現(xiàn)了明顯的差異，從而實(shí)現(xiàn)了對有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測，該傳感平臺對樂果的檢出限為0.9 ng/mL。與只有Myr 在水/液晶界面的液晶檢測系統(tǒng)相比[46]，該方法將Myr 與PW12組成超分子微球引入水/液晶界面檢測體系，能識別樂果與牛血清白蛋白混合液中的樂果（50 ng/mL 樂果，1 mg/mL 牛血清白蛋白），而前者卻不能。這表明將AChE 水解響應(yīng)的Myr 制備成超分子微球的設(shè)計能顯著提高液晶對有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測靈敏度，同時可減少外界環(huán)境因素對檢測的干擾，為有機(jī)磷農(nóng)藥的實(shí)時檢測提供了一種新策略。

圖7 基于多金屬氧酸鹽的酶響應(yīng)超分子材料構(gòu)建的液晶傳感平臺檢測樂果和AChE[51]：（A）十二鎢磷酸鈉（PW12）/Myr 超分子球的自組裝和解體過程；（B）樂果和（C）AChE 的檢測原理示意圖Fig.7 Schematic illustration of detection of dimethoate and AChE using LC-based sensing platform by using polyoxometalate-based enzyme-responsive supramolecular materials[51]: (A) Schematic of self-assembly and disassembly process of sodium dodecatungstophosphate(PW12)/Myr supramolecular spheres;Detection principle of (B) dimethoate and (C) AChE

除了使用偏光光學(xué)顯微鏡呈現(xiàn)檢測結(jié)果外，另外還有其它一些方法也被開發(fā)應(yīng)用于液晶檢測信號的放大。如Duan 等[52]報道了一種基于回音壁模式（Whispering gallery mode，WGM）激光的液晶傳感器，此方法應(yīng)用了WGM 共振和液晶5CB 分子的雙重放大。生物過程中的微小變化將導(dǎo)致液晶光學(xué)成像變化及WGM 光譜響應(yīng)，同時光譜響應(yīng)進(jìn)一步提供有關(guān)液晶/水溶液界面的分子吸附/解吸信息，從而作為酶反應(yīng)的雙重指示劑用于AChE 及其抑制劑有機(jī)磷農(nóng)藥的高靈敏度檢測（圖8）。此方法對殺菌威和樂果的檢出限分別低至0.1 和1.0 pg/mL，遠(yuǎn)低于水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)水平。WGM 光譜共振進(jìn)一步加強(qiáng)了液晶分子取向的變化，顯著提高了檢測的靈敏度，但該方法需要使用微諧振器，在設(shè)備齊全的實(shí)驗(yàn)室才能進(jìn)行。雖然該方法的檢出限較低，但檢測流程復(fù)雜，專業(yè)程度要求高，不適于有機(jī)磷農(nóng)藥的現(xiàn)場便攜式檢測。

圖8 基于回音壁模式（WGM）的液晶傳感技術(shù)檢測AChE 及其抑制劑的原理示意圖[52]。5CB 微滴在（A）純PBS 溶液（pH=7.4）、（B）Myr 水溶液和（C）Myr 與AChE 混合水溶液中產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變。（D）具有徑向（黑線）和雙極（紅線）配置的5CB 微滴的WGM 激光圖譜。插圖1 和2 分別顯示了徑向和雙極構(gòu)型的示意圖；插圖3 和4 分別顯示了具有徑向和雙極構(gòu)型的激光微滴的POM 圖案。標(biāo)尺：20 μm。（E）5CB 分子垂直和平行取向時，橫電波（TE）模式WGMs 的電場振蕩示意圖。黃色的長形物體代表5CB 分子Fig.8 Schematic of detection of AChE and its inhibitor by liquid crystal sensor based on whispering gallery mode (WGM)[52].Structural transition of 5CB microdroplets generated in (A) pure PBS solution (pH=7.4),(B)Myr aqueous solution and(C)mixed aqueous solution of Myr and AChE.(D)WGM lasing of 5CB microdroplets with radial (black line) and bipolar (red line) configurations.Insets 1 and 2 show the schematic of radial and bipolar configurations,respectively.Insets 3 and 4 show the POM patterns of lasing microdroplet with the radial and bipolar configurations,respectively.Scale bar:20 μm.(E)Schematic view of the electric field oscillation of transverse electric(TE)mode WGMs when 5CB molecules in perpendicular and parallel orientation.The yellow prolateobjects represent 5CB molecules

酶反應(yīng)構(gòu)建的液晶傳感器具有體積小、響應(yīng)快和靈敏度高等優(yōu)勢，但是酶法中使用的酶（如膽堿酯酶）通常源自動物，價格較昂貴，在快速檢測和應(yīng)用中仍存在一定的限制。同時，基于酶反應(yīng)的方法對反應(yīng)條件（如溫度和酸堿度等）的要求較高，易受外部環(huán)境的影響，其檢測穩(wěn)定性有待提高。

2.2 基于金屬離子探針的液晶傳感器

金屬離子探針液晶傳感器是用金屬離子作為識別分子，通過金屬離子、有機(jī)磷與液晶的競爭作用實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測。液晶分子（如5CB）中的氰基和有機(jī)磷農(nóng)藥中的磷脂基均可與金屬鹽中的陽離子相互作用形成配合物。利用競爭反應(yīng)的機(jī)制，在檢測有機(jī)磷農(nóng)藥前后，液晶分子的取向發(fā)生改變，從而輸出不同的光學(xué)信號，基于此實(shí)現(xiàn)對機(jī)磷農(nóng)藥的檢測識別。基于液晶和有機(jī)磷對金屬離子的競爭作用發(fā)展出的液晶傳感方法，相比酶反應(yīng)的方法，其傳感器構(gòu)建更簡單，檢測不易受環(huán)境影響，穩(wěn)定性強(qiáng)。

金屬離子探針液晶傳感器對有機(jī)磷類物質(zhì)的檢測多聚焦于有機(jī)磷氣體，如對甲基膦酸二甲酯（DMMP）或其它有機(jī)磷神經(jīng)毒氣[53-55]。Yang 等[56]利用8CB 的氰基（—CN）和DMMP 對表面固定的Cu2+競爭性結(jié)合驅(qū)動，研究沉積在Cu2+表面上的微米級厚的液晶薄膜對DMMP 的響應(yīng)，可檢測出氣相中10-9（ppb）水平的有機(jī)磷酸酯化合物。趙建軍等[57]通過在具有微米級溝槽的玻璃基底上進(jìn)行平面鍍金，制備了具有相同溝槽周期的金膜，并用Cu2+修飾具有微米形貌的金膜，基于此基底實(shí)現(xiàn)了對DMMP 的檢測。王普紅等[58]在玻璃基底上采用微接觸印刷法制備了微米級溝槽結(jié)構(gòu)的有機(jī)膜，同時利用硅烷化試劑3-[2-（2-氨基乙基氨基）乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷（AEEPMS）組裝出活性位點(diǎn)，并用銅網(wǎng)固定液晶膜。利用液晶分子的端基—CN 與Cu2+發(fā)生弱的鍵合作用構(gòu)建傳感器，用于敵敵畏（DDVP）蒸氣的檢測。當(dāng)DDVP 以1 L/min 的流速吹向液晶膜時，液晶分子與自組裝膜上Cu2+之間的弱鍵合作用被較強(qiáng)的Cu2+與DDVP 磷酯鍵之間的配位作用取代，液晶膜發(fā)生從暗到亮的改變，從而實(shí)現(xiàn)對DDVP 的識別，檢出限可低至0.051 g/m3，并可重復(fù)50 次以上檢測0.114 g/m3的DDVP，此傳感器具有良好的抗干擾性。另外，其響應(yīng)時間隨著DDVP 蒸氣濃度的增加而縮短，而恢復(fù)時間變長。王詩鳴等[59]進(jìn)一步研究了Cu2+濃度與有機(jī)磷農(nóng)藥檢測之間的關(guān)系，將液晶5CB 滴入Cu2+功能化的表面，發(fā)現(xiàn)其隨時間變化而呈現(xiàn)由亮變暗的光學(xué)表征變化，并且所修飾的Cu2+濃度越高，液晶轉(zhuǎn)為全暗態(tài)所需的時間越短；當(dāng)通入DMMP 氣體時，液晶傳感器又逐漸從暗態(tài)恢復(fù)到亮態(tài)，并且其對DMMP 的光學(xué)響應(yīng)靈敏度與Cu2+濃度相關(guān)，Cu2+濃度越低，傳感器對DMMP 的光學(xué)響應(yīng)速度越快。

對于金屬離子探針液晶傳感器，除Cu2+外，其它金屬陽離子（如Fe2+、Zn2+、Cd2+、Ni2+、Co2+、La3+、Al3+、Eu3+和Fe3+等）也可誘導(dǎo)液晶呈現(xiàn)垂直取向，其中以Fe3+作用程度最強(qiáng)[60]。因此，不同金屬陽離子構(gòu)建的液晶傳感器對有機(jī)磷的檢測研究也引起了關(guān)注。Cadwell 等[61]將金屬高氯酸鹽（Cu2+、Ni2+、Al3+、Zn2+、Fe3+）沉積到固體表面，并采用向列液晶E7 薄膜檢測有機(jī)磷神經(jīng)毒劑沙林（GB）、梭曼（GD）、塔崩（GA）和維?？怂梗╒X）蒸氣。當(dāng)E7 的向列膜暴露于GB、GD、GA 或VX 蒸氣時，液晶從垂直方向排列轉(zhuǎn)變?yōu)閮A斜或水平方向取向。沉積高氯酸鋁的E7 薄膜分別暴露于GB、GD、GA 或VX 時，液晶都發(fā)生方向性轉(zhuǎn)變；沉積高氯酸鋅的E7 薄膜只有暴露于GB 或VX 時才會發(fā)生排列方向轉(zhuǎn)變；沉積高氯酸鐵的E7 薄膜只有暴露在GB 時才會發(fā)生液晶取向轉(zhuǎn)變。不同金屬陽離子對有機(jī)磷展現(xiàn)了不同的敏感度。在這些有機(jī)磷神經(jīng)毒劑中，檢測VX 毒劑的蒸氣壓最低，約為140 ppb，在60 s 內(nèi)發(fā)生響應(yīng)；而具有較高蒸氣壓的GB、GD 和GA 試劑分別在15、15 和60 s 內(nèi)引發(fā)了液晶的明顯光學(xué)響應(yīng)。

目前，基于金屬離子的液晶傳感器主要用于檢測有機(jī)磷神經(jīng)毒氣及DDVP 蒸氣，尚未見將其直接用于液態(tài)有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測。本研究組基于上述研究報道，并根據(jù)有機(jī)磷農(nóng)藥的P=O 鍵或P=S 鍵與金屬陽離子配位形成絡(luò)合物的相同機(jī)理，開展了液晶傳感用于液態(tài)有機(jī)磷農(nóng)藥的快速實(shí)時檢測研究。

2.3 基于適配體的液晶傳感器

寡核苷酸適配體與目標(biāo)靶分子的相互作用類似于抗原與抗體之間的結(jié)合，其平衡解離常數(shù)（KD）通常在pmol/L～μmol/L 之間，對目標(biāo)分子的親和性特別高，可作為檢測的識別分子。近年來，由于指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的核酸適配體被篩選出來，并作為識別分子用于蛋白質(zhì)、核酸、金屬離子和小的有機(jī)分子等多種物質(zhì)的檢測[13]。液晶傳感技術(shù)也應(yīng)用核酸適配體作為識別分子，對三磷酸腺苷（ATP）[62]、磺胺二甲氧嘧啶[63]、多氯聯(lián)苯[64]、萊克多巴胺[65]、激素[66]、蛋白質(zhì)[67-70]、抗生素[71-72]和重金屬離子[73-74]等多種分析物進(jìn)行分析檢測。在有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測中，已經(jīng)證實(shí)有多種適配體核酸序列可用于有機(jī)磷農(nóng)藥的特異性檢測[75]，并具有高度的親和性和特異性。

Jang 等[76]將適配體作為識別分子開發(fā)了一種液晶傳感器用于檢測馬拉硫磷。將3-縮水甘油基氧丙基三甲氧基硅烷（GOPS）和DMOAP 按體積比10∶1 混合用于修飾玻璃基底并作為自組裝層，利用適配體（序列5′-ATCCGTCACACCTGCTCTTATACACAATTGTTTTTCTCTTAACTTCTTGACTGCTGGTGTTGGCTCCCGTAT-3′）作為識別分子，構(gòu)建液晶傳感器。馬拉硫磷分子與適配體結(jié)合，擾亂了液晶的空間取向（圖9A）。在POM 下可以觀察到從明亮圖像到黑暗圖像的轉(zhuǎn)變；在最佳條件下，馬拉硫磷的檢出限為2.5 pmol/L（即0.826 pg/mL）。采用該傳感器對自來水樣品進(jìn)行了檢測，隨著自來水中馬拉硫磷濃度降低，無規(guī)則液晶織構(gòu)逐漸減少（圖9B）。另外，該研究將圖像的灰度與馬拉硫磷的濃度關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)圖像灰度值與濃度的對數(shù)值在0.001～100 nmol/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.979（圖9C），這表明可通過圖像的灰度值獲得樣品中馬拉硫磷濃度的信息。該研究為定量分析檢測樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥的濃度提供了一種新方法。

圖9 （A）基于適配體的液晶傳感器檢測馬拉硫磷分子的示意圖；（B）浸入具有不同馬拉硫磷濃度的自來水樣品后的液晶池光學(xué)圖像：（a）100 nmol/L，（b）10 nmol/L，（c）1 nmol/L，（d）100 pmol/L，（e）10 pmol/L，（f）1 pmol/L；（C）液晶池偏光圖像灰度強(qiáng)度與馬拉硫磷濃度的對數(shù)之間的相關(guān)性[76]Fig.9 (A)Schematic of aptamer-based LC sensor for detection of malathion molecule;(B)Optical images of the LC cells recorded after immersion in tap water samples with different concentrations of malathion: (a)100 nmol/L,(b)10 nmol/L,(c)1 nmol/L,(d)100 pmol/L,(e)10 pmol/L,and(f)1 pmol/L;(C)Correlation between the grayscale intensity of the images of LC cells,and the logarithmic concentration ofmalathion[76]

該研究組在隨后的研究中[77]又將表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）水溶液引入基于該適配體的液晶傳感器中，CTAB 在水/液晶界面處形成了自組裝的CTAB 單分子膜，導(dǎo)致垂直的液晶取向；隨著馬拉硫磷適配體的加入，CTAB 與適配體的相互作用使液晶從垂直取向轉(zhuǎn)變?yōu)槠叫腥∠?，形成明亮的光學(xué)圖像（圖10）。馬拉硫磷存在時，適配體-馬拉硫磷復(fù)合物的形成改變了適配體的構(gòu)象，從而削弱了適配體與CTAB 之間的相互作用。該傳感器對馬拉硫磷的檢測具有很高的特異性，檢出限可達(dá)0.465 nmol/L。該研究還將液晶與含有200 nmol/L 適配體和不同濃度馬拉硫磷的預(yù)孵育混合物接觸，以測試傳感器對馬拉硫磷的定量檢測性能。隨著馬拉硫磷濃度從1 nmol/L 增加到600 nmol/L，液晶光學(xué)圖像逐漸從亮變暗，對應(yīng)液晶分子從平面到垂直的有序取向轉(zhuǎn)變。樣品中馬拉硫磷的濃度越高，獲得的光學(xué)圖像越暗，據(jù)此可判斷樣品中馬拉硫磷的濃度范圍，但無法準(zhǔn)確獲得實(shí)驗(yàn)濃度以外的樣品濃度信息。

圖10 基于自組裝十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）后的適配體液晶傳感器用于檢測馬拉硫磷分子的示意圖：（A）CTAB 在水溶液/液晶界面上的自組裝誘導(dǎo)液晶垂直取向；（B）CTAB 與適配體在界面處的相互作用干擾液晶的垂直取向；（C）適配體與馬拉硫磷結(jié)合后，適配體的構(gòu)象變化使其對CTAB 的干擾變小，不再影響液晶的垂直取向[77]Fig.10 Schematic of detection of malathion molecule based on aptamer-LC sensor after self-assembley of aqueous cetyltrimethylammonium bromide(CTAB):(A)Self-assembly of CTAB at aqueous/LC interface induces homeotropic orientation of LCs;(B)Interactions between CTAB and aptamer at the interface disturb homeotropic orientation of LCs;(C) Upon binding with malathion,the conformational change of the aptamer renders CTAB free to induce homeotropic alignment of LCs[77]

目前，基于核酸適配體的液晶傳感器在有機(jī)磷農(nóng)藥檢測方面的應(yīng)用研究還較少，主要研究都集中在對已篩選出的少量核酸適配體作為識別分子檢測有機(jī)磷農(nóng)藥的有效性研究方面。盡管每種適配體能具體識別一種有機(jī)磷農(nóng)藥，但無法整體識別有機(jī)磷這一類農(nóng)藥，在面對無需區(qū)分某一種具體農(nóng)藥的檢測時，該方法所受局限較大。

3 總結(jié)與展望

本文對液晶傳感技術(shù)的檢測原理及構(gòu)建方式進(jìn)行了簡要介紹，并對液晶傳感技術(shù)在有機(jī)磷農(nóng)藥檢測方面的研究進(jìn)展進(jìn)行了評述。目前，液晶傳感技術(shù)在有機(jī)磷農(nóng)藥檢測中的研究主要集中在酶反應(yīng)識別、金屬離子識別和適配體識別3 個方面，以酶反應(yīng)識別研究最為廣泛。這些方法雖然取得了很好的檢測效果，但仍存在一些不足。其中，酶反應(yīng)識別方法受酶來源、酶活性以及酶反應(yīng)條件嚴(yán)苛所限，并且檢測成本較高，檢測的穩(wěn)定性有待提高；金屬離子識別的方法目前主要集中在對氣態(tài)有機(jī)磷的檢測研究方面，對液態(tài)有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測有待進(jìn)一步研究開發(fā)；適配體識別方法雖然檢測識別度較高，但已開發(fā)的針對有機(jī)磷農(nóng)藥的適配體較少，同時，一個適配體只能選擇性識別某一具體有機(jī)磷農(nóng)藥，無法整體識別有機(jī)磷這一類農(nóng)藥。另外，已開發(fā)的液晶傳感器目前多適用于判斷樣品中有機(jī)磷農(nóng)藥存在與否的定性檢測，少部分研究應(yīng)用偏振光圖像的灰度值對樣品中的有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行濃度的半定量分析。因而，采用液晶傳感對有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行定量分析仍有待進(jìn)一步開發(fā)與研究。液晶傳感技術(shù)對建立簡便、準(zhǔn)確、靈敏和快捷的有機(jī)磷農(nóng)藥的實(shí)時檢測方法將起到極大的推進(jìn)作用。