鄒 雪,熊曉妹,楊曉利,廖思雨,許詩(shī)怡,張秀橋,桂 春

(湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,湖北 武漢 430065)

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一。全球癌癥統(tǒng)計(jì)最新數(shù)據(jù)顯示,60.4萬(wàn)例新發(fā)病例中約有一半的患者死亡[1]。在發(fā)展中國(guó)家或欠發(fā)達(dá)地區(qū),由于缺乏充分的篩查和疫苗低接種率,宮頸癌發(fā)病率占全球?qū)m頸癌發(fā)病率的80%[2- 3]。目前,宮頸癌最常見的治療方法是手術(shù)治療、化療和放療,但預(yù)后效果差、病灶易轉(zhuǎn)移、患者生存率低等弊端也逐漸顯現(xiàn)。有研究者發(fā)現(xiàn),宮頸癌組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達(dá)量要低于癌旁組織,自噬與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。因此,尋找通過調(diào)節(jié)自噬抑制惡性腫瘤的新藥物已經(jīng)引起了宮頸癌領(lǐng)域研究者的關(guān)注。

大葉蛇葡萄(AmpelopsismegalophyllaDiels et Gilg)為葡萄科蛇葡萄屬植物,葉及嫩莖為其主要藥用部位,收載于《湖北省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2018年版)[5],主產(chǎn)于湖北西部、貴州、四川等地。蛇葡萄素(ampelopsin,AMP),又名二氫楊梅素,是從大葉蛇葡萄中提取的主要活性成分。據(jù)報(bào)道AMP具有抗氧化、抗炎及抗癌等多種藥理作用[6]。也有研究發(fā)現(xiàn),AMP可以誘導(dǎo)多種類型的癌細(xì)胞凋亡和自噬,包括乳腺癌、胃癌、膀胱癌等[7- 8],但目前AMP抗宮頸癌的研究除本課題組外未見報(bào)道。

課題組前期對(duì)AMP誘導(dǎo)宮頸癌的活性進(jìn)行了篩選,發(fā)現(xiàn)其對(duì)SiHa細(xì)胞敏感性較高,并從凋亡角度進(jìn)行了研究[9],同時(shí)在觀察凋亡小體時(shí),發(fā)現(xiàn)了自噬現(xiàn)象。因此,本研究采用MDC染色法、TEM研究AMP對(duì)SiHa細(xì)胞和C-33A細(xì)胞自噬的影響;通過mRFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染法、Western blot進(jìn)一步探究AMP干預(yù)SiHa細(xì)胞后自噬及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,旨在探究AMP對(duì)SiHa細(xì)胞自噬的影響,并進(jìn)一步研究AMP誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞自噬的分子機(jī)制,期望為宮頸癌的治療提供新的方法并為創(chuàng)新藥物的研究提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株人宮頸癌SiHa(批號(hào)CL-0210)和C-33A(批號(hào)CL-0045)細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物與試劑蛇葡萄素(AMP,純度≥98%,課題組自制);3-MA(批號(hào)N1012A,大連meilunbio公司);MEM培養(yǎng)基(批號(hào)PM152340,武漢Procell生命科技有限公司);磷酸鹽緩沖液(PBS,批號(hào)AE29031187,美國(guó)Gibco公司);胰蛋白酶(批號(hào)J180026,美國(guó)Hyclone公司);青霉素-鏈霉素(批號(hào)J180034,美國(guó)Hyclone公司);胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS,批號(hào)42G4084K,美國(guó)Gibco公司);MDC染色液(批號(hào)BCBX0277,美國(guó)Sigma公司);電鏡固定液(批號(hào)G1102,美國(guó)SPI公司);抗熒光猝滅封片劑(批號(hào)AS1236,武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司);mRFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染試劑盒(批號(hào)AP20102504,上海漢恒生物科技有限公司);ECL發(fā)光試劑盒(批號(hào)MA0186,大連meilunbio公司);二甲亞砜(DMSO,批號(hào)RNBF8134,美國(guó)Sigma公司);抗體P62(39749s)、Beclin-1(3495s)、Atg13(13273s)、p-AKT(4060s)、p-mTOR(5536s)(美國(guó)CST公司);p-PI3K(ab182651,美國(guó)abcam公司);LC3(14600-1-AP)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(批號(hào)SA00001-2,武漢Proteintech公司)。

1.3 主要儀器IX51 Olympus倒置顯微鏡(日本Olympus公司);Galaxy s+CO2培養(yǎng)箱(英國(guó)RS Biotech公司);電泳儀(美國(guó)Bio-RAD公司);UC7型超薄切片機(jī)(德國(guó)Leica公司);Tecnai G220TWIN透射電子顯微鏡(美國(guó)FEI公司);LSM880型激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)ZEISS公司);Syngene Gene Genius全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)Syngene公司)。

1.4 方法

1.4.1試劑配制 AMP和3-MA均用DMSO分別配制成16、125 mmol·L-1的貯存液,給藥時(shí)用MEM稀釋成不同的濃度,DMSO的最終濃度低于0.1%。

1.4.2細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)SiHa和C-33A細(xì)胞;培養(yǎng)基為含有10% FBS和1%青-鏈霉素的MEM。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí),用不同濃度的AMP處理細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組和給藥組。

1.4.3MDC法觀察自噬現(xiàn)象 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa和C-33A細(xì)胞分別以1×105/孔接種于6孔板中,放置培養(yǎng)箱中孵育過夜,待細(xì)胞密度長(zhǎng)至約80% 時(shí),加入不同濃度的AMP(10、20、40、80 μmol·L-1)。培養(yǎng)24 h后棄去舊培養(yǎng)基,每孔加入500 μL MDC溶液(50 μmol·L-1),孵育40 min后棄去染液,PBS潤(rùn)洗3遍,在激光共聚焦顯微鏡下觀察自噬小體。

1.4.4TEM觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa和C-33A細(xì)胞,分別消化成單細(xì)胞懸液后以1×106/皿接種于10 cm培養(yǎng)皿中,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。SiHa細(xì)胞中AMP濃度為20和80 μmol·L-1,C-33A細(xì)胞中AMP濃度為20和40 μmol·L-1。培養(yǎng)24 h后,先用4 mL預(yù)冷的PBS洗兩遍,緩慢加入電鏡固定液5 mL,4 ℃固定約3 h。隨后輕輕刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15 mL離心管內(nèi),800 r·min-1離心5 min,棄去大部分上清液后加入1 mL固定液,4 ℃固定保存。PBS漂洗3次,每次15 min,再用1%的鋨酸加上0.1 mol·L-1PBS室溫固定2 h,PBS漂洗3次,依次用50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇各脫水15 min。丙酮-812包埋劑室溫靜置過夜,60 ℃聚合48 h,在超薄切片機(jī)中切成60～80 nm薄片。鈾鉛雙染色15 min,室溫干燥過夜,TEM下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。

1.4.5mRFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染檢測(cè)細(xì)胞自噬流強(qiáng)度 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa細(xì)胞消化傳代后以5×105/孔接種于6孔板中,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí),加入病毒顆粒感染SiHa細(xì)胞,48 h后細(xì)胞轉(zhuǎn)染成功,加入不同濃度的AMP(20、40、80 μmol·L-1),置培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h。4%多聚甲醛固定20 min,PBS洗2遍,共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)的自噬情況,拍照記錄。

1.4.6Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白及PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白的表達(dá)情況 細(xì)胞培養(yǎng)同“1.4.2”,用20、40、80 μmol·L-1的AMP作用SiHa細(xì)胞12 h或40 μmol·L-1的AMP作用6、12、24 h,棄去舊培養(yǎng)基,用PBS洗滌2次,加入含磷酸酶和蛋白酶抑制劑的裂解液,5 min后刮取細(xì)胞收集至EP管中,放入裝有冰水混合物的超聲儀內(nèi),超聲10 s停頓5 s,重復(fù)3次。然后置于冰上裂解20 min。4 ℃,12 000 r·min-1離心10 min,取上清,根據(jù)上清體積加入5×Loading buffer,沸水浴8 min。SDS-PAGE電泳分離蛋白后,半干式轉(zhuǎn)膜至經(jīng)甲醇活化的PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h,一抗4 ℃搖床孵育過夜。HRP標(biāo)記的抗兔IgG二抗室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,加入ECL化學(xué)發(fā)光液,將PVDF膜置于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀中顯影并分析結(jié)果。

1.4.7Western blot法檢測(cè)3-MA和AMP聯(lián)合干預(yù)時(shí)PI3K/AKT/mTOR通路蛋白的表達(dá)變化 給藥組設(shè)置為空白對(duì)照組、AMP(80 μmol·L-1)組、3-MA(5 mmol·L-1)組、AMP+3-MA組。細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí),AMP+3-MA組先加入抑制劑3-MA作用2 h后再加入AMP,其他組別對(duì)應(yīng)加入10 mL藥液,繼續(xù)恒溫孵育12 h。

2 結(jié)果

2.1 AMP可增加SiHa和C-33A細(xì)胞內(nèi)的自噬水平結(jié)果如Fig 1所示,空白對(duì)照組中綠色熒光信號(hào)較弱,隨著AMP干預(yù)濃度的增加(10、20、40、80 μmol·L-1),顆粒狀綠色熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng),在80 μmol·L-1組細(xì)胞數(shù)量明顯減少,顆粒狀綠色熒光增多,表明自噬小體的數(shù)量增加,自噬增強(qiáng)。以上結(jié)果說明,AMP可能誘導(dǎo)SiHa和C-33A細(xì)胞發(fā)生自噬。

2.2 AMP誘導(dǎo)SiHa和C-33A細(xì)胞出現(xiàn)自噬特征性結(jié)構(gòu)如Fig 2A所示,空白對(duì)照組的SiHa細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整清晰,線粒體形態(tài)正常;AMP(20 μmol·L-1)干預(yù)組可見少量單層膜結(jié)構(gòu)的自噬溶酶體(圖中紅色箭頭所示),部分線粒體嵴溶解;AMP(80 μmol·L-1)干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)觀察到較多的自噬溶酶體和自噬小體(圖中黃色箭頭所示),線粒體也出現(xiàn)明顯腫脹和空泡化。如Fig 2B所示,空白對(duì)照組的C-33A細(xì)胞狀態(tài)良好,線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)正常;AMP(20 μmol·L-1)干預(yù)組可見自噬溶酶體;AMP(40 μmol·L-1)干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)觀察到較多的自噬溶酶體和自噬小體,細(xì)胞核皺縮,線粒體也出現(xiàn)腫脹和空泡化。以上結(jié)果表明,AMP可誘導(dǎo)SiHa和C-33A細(xì)胞自噬。

2.3 AMP誘導(dǎo)SiHa細(xì)胞自噬流增強(qiáng)如Fig 3A所示,隨著AMP干預(yù)濃度的增加,標(biāo)記LC3的綠色GFP熒光逐漸減弱,指示自噬溶酶體的紅色mRFP熒光逐漸增強(qiáng),代表自噬體的黃色熒光(Merge)也逐漸增強(qiáng),表明自噬體和自噬溶酶體數(shù)量明顯增加。如Fig 3B所示,隨著AMP濃度的增加,GFP逐漸減少,mRFP逐漸增多,如Fig 3C所示,兩種熒光重疊比例(黃色熒光Merge)也逐漸增大。以上結(jié)果表明,AMP可呈劑量依賴性地增強(qiáng)SiHa細(xì)胞自噬流。

2.4 AMP對(duì)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin-1、Atg13表達(dá)的影響如Fig 4A所示,與空白對(duì)照組相比,經(jīng)AMP干預(yù)后,Beclin-1、Atg13表達(dá)水平隨著AMP濃度的增加逐漸上升,LC3Ⅱ/Ⅰ比值增加,而P62的表達(dá)水平則呈下降趨勢(shì)。如Fig 4B所示,隨著AMP干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng),Beclin-1、Atg13表達(dá)水平明顯上升,LC3Ⅱ/Ⅰ比值呈上調(diào)趨勢(shì),P62表達(dá)下調(diào)。結(jié)果表明,AMP可呈濃度和時(shí)間依賴性地激活自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin-1、Atg13的表達(dá),從而誘導(dǎo)自噬。

Fig 1 AMP increased autophagy levels in SiHa and C-33A cells in a concentration-dependent manner

Fig 2 AMP induced morphological characteristics of autophagy in SiHa and C-33A cells

2.5 AMP對(duì)PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表達(dá)的影響PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是腫瘤免疫中的重要通路之一,其中磷酸化蛋白p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達(dá)量是判斷通路是否被激活并參與到細(xì)胞自噬的重要指標(biāo)。結(jié)果如Fig 5所示,隨著AMP濃度的升高,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達(dá)量均明顯下降,總蛋白PI3K、AKT、mTOR的表達(dá)量基本不變;隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng),SiHa細(xì)胞內(nèi)的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達(dá)量均呈明顯下降的趨勢(shì),總蛋白表達(dá)量基本不變。結(jié)果表明,AMP可呈劑量和時(shí)間依賴性地下調(diào)p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達(dá)量,抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路,促進(jìn)自噬的發(fā)生。

2.6 自噬抑制劑3-MA對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的影響3-MA是一種特異型自噬抑制劑,也是PI3K抑制劑,為了明確3-MA是否可以抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路誘導(dǎo)的自噬,本研究利用3-MA和AMP同時(shí)干預(yù)SiHa后,通過Western blot法檢測(cè)信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果如Fig 6所示,與空白對(duì)照組相比,AMP與3-MA聯(lián)用后,p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表達(dá)量有所上調(diào),總蛋白PI3K、AKT、mTOR的表達(dá)量基本不變,說明抑制自噬后,AMP對(duì)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的抑制作用被逆轉(zhuǎn),AMP對(duì)SiHa細(xì)胞的誘導(dǎo)自噬作用減弱。

Fig 5 Effect of AMP on protein expression of PI3K/AKT/mTOR

3 討論

目前,臨床治療宮頸癌藥物紫杉醇或與鉑類聯(lián)合用藥等存在較嚴(yán)重副作用與耐藥性,因此當(dāng)前研究的關(guān)鍵是尋找更加安全有效的藥物。

自噬是細(xì)胞內(nèi)程序性死亡的一種方式,與凋亡不同,它通過溶酶體途徑將細(xì)胞器等包裹在雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體中,并進(jìn)行自我降解,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)代謝循環(huán)過程以維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。自噬與腫瘤之間聯(lián)系緊密,可以清除腫瘤組織中壞死的細(xì)胞器及有毒物質(zhì),在腫瘤的發(fā)展過程中起著重要作用[10]。

中藥及其提取物可以多途徑多靶點(diǎn)參與到腫瘤發(fā)展的各個(gè)過程,包括腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡及自噬等,起到預(yù)防和治療腫瘤的作用。AMP是從大葉蛇葡萄中提取出的一種小分子化合物,已有研究證明,AMP對(duì)人腦膠質(zhì)瘤、膀胱癌、結(jié)直腸癌等都有較好的體外抑制增殖作用,但是AMP對(duì)宮頸癌的作用及深入的分子機(jī)制研究甚少。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),AMP可抑制SiHa細(xì)胞增殖,降低線粒體膜電位,通過抑制線粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,同時(shí)發(fā)現(xiàn)自噬現(xiàn)象[11]。

本研究以宮頸癌細(xì)胞SiHa和C-33A為研究對(duì)象,MDC染色法為初步觀察自噬現(xiàn)象最常用的熒光探針之一。首先通過該法觀察到綠色熒光標(biāo)記的自噬小體,且隨著AMP濃度的增加,發(fā)生自噬的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。但MDC是一種嗜酸性熒光探針,因此,很多酸性膜性結(jié)構(gòu)也會(huì)被染色,故為進(jìn)一步確定自噬現(xiàn)象的發(fā)生,采用自噬檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)TEM法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)了AMP干預(yù)后細(xì)胞明顯的形態(tài)學(xué)變化及細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)的自噬小體和自噬溶酶體。這兩種方法分別從熒光探針和細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)兩個(gè)方面證實(shí)AMP可誘導(dǎo)人宮頸癌SiHa和C-33A細(xì)胞發(fā)生自噬。采用mRFP-GFP-LC3轉(zhuǎn)染法從定性和定量?jī)煞矫孀C明了AMP可呈劑量依賴性地增強(qiáng)SiHa細(xì)胞自噬流。LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、Beclin-1、Atg13均為自噬標(biāo)志性蛋白,被激活后可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬,本研究發(fā)現(xiàn),AMP可以上調(diào)SiHa細(xì)胞中LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg13的表達(dá),下調(diào)P62的表達(dá),說明AMP呈時(shí)間-劑量依賴性地誘導(dǎo)了SiHa細(xì)胞自噬。

PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路已有研究證明在宮頸癌中發(fā)揮重要作用[12]。多種生長(zhǎng)因子及信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物激活PI3K并引起其磷酸化,PI3K募集到活化受體AKT并將其轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜上,再通過磷酸化多種酶、激酶等下游因子調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。PI3K/AKT下游靶點(diǎn)是mTOR,由磷酸化的AKT激活,起到控制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),它可以加速細(xì)胞周期G1～S期的轉(zhuǎn)換,促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞自噬,抑制腫瘤細(xì)胞遷移[13-14]。因此,抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬。本實(shí)驗(yàn)中,通過Western blot發(fā)現(xiàn),AMP可以抑制PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平,且呈時(shí)間-劑量依賴性,說明AMP可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路而誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞SiHa自噬。

3-MA是一種自噬抑制劑,也是一種Ⅲ型PI3K抑制劑,通過阻止自噬體的形成及PI3K與自噬蛋白的結(jié)合而阻斷自噬,許多研究證實(shí)3-MA可以減輕細(xì)胞毒性作用,逆轉(zhuǎn)自噬[15-16]。因此,本研究中加入抑制劑3-MA后,PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平均呈上升趨勢(shì),3-MA逆轉(zhuǎn)了AMP的誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的作用。

綜上所述,AMP可誘導(dǎo)SiHa和C-33A細(xì)胞自噬,SiHa細(xì)胞發(fā)生自噬的機(jī)制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。后期將進(jìn)一步探索AMP所誘導(dǎo)的自噬和凋亡之間是否還存在著某種關(guān)系,并將進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)的體內(nèi)研究。