楊寧，張微思，羅曉莉，周锫，何容，吳素蕊，張沙沙*

（1.云南省食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究院，云南 昆明 650221；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221）

云南省是野生食用菌資源大省，無論是資源數(shù)量，還是產(chǎn)量、產(chǎn)值均居全國第一[1]。其中，牛肝菌是大宗食用菌，是四大名菌之一，產(chǎn)量和出口量均較高，2021年牛肝菌出口7 223.3 t，主要出口德國、意大利、法國等。蘭茂牛肝菌（Lanmaoa asiatica）被當(dāng)?shù)厝朔Q為“紅蔥”、“見手青”，由于其含有豐富的揮發(fā)性和非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[2-3]，因此被公認(rèn)為最美味的牛肝菌之一。另外，蘭茂牛肝菌富含多糖、萜類，可調(diào)節(jié)人體免疫力，具有抗氧化、抗輻射、抗癌等功效[4-5]。但是蘭茂牛肝菌尚不能人工栽培，季節(jié)性強(qiáng)，主要以鮮食為主，加工產(chǎn)品較少，尤其是精深加工產(chǎn)品寥寥無幾，產(chǎn)品附加值低，不能滿足市場需求，且蘭茂牛肝菌在貯運(yùn)加工過程中有大量殘次菇、泥腳料被丟棄，浪費(fèi)了大量資源。

美拉德反應(yīng)（Maillard reaction，MR）是氨基酸、肽等氨基化合物與果糖、葡萄糖等還原糖之間發(fā)生復(fù)雜的反應(yīng)，一般發(fā)生在食品加工過程中[6-8]，能改善食品的風(fēng)味，提升食品品質(zhì)，還對食品貨架期的延長和穩(wěn)定性的提升有貢獻(xiàn)[9-10]。劉培基等[10]利用美拉德反應(yīng)改善香菇酶解液風(fēng)味，發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)后酶解液中的有機(jī)酸和氨基酸種類及含量也發(fā)現(xiàn)了明顯變化；反應(yīng)后生成的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要為乙醇、環(huán)己酮，可以帶來香甜氣息。高然等[11]利用美拉德反應(yīng)制備美味牛肝菌風(fēng)味基料，發(fā)現(xiàn)酶解液發(fā)生美拉德反應(yīng)后呈棕色，具有濃郁的美味牛肝菌香氣、海鮮及燒烤風(fēng)味。高娟等[12]利用美拉德反應(yīng)制備羊肚菌酶解液肉味調(diào)味基料，發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)后羊肚菌酶解液的鮮味、咸味傳感器響應(yīng)強(qiáng)度增大，苦澀味、氨、硫化氫等不良揮發(fā)性風(fēng)味傳感器響應(yīng)強(qiáng)度降低。MR 形成的風(fēng)味很大程度上取決于還原糖、氨基酸種類和添加量，以及反應(yīng)條件（溫度、時(shí)間和pH 值），還原糖的種類對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（Maillard reaction products，MRPs）的風(fēng)味影響較小，主要是影響反應(yīng)速率，而氨基酸的種類對MPRs 風(fēng)味的影響較大[13]。

本研究采用蘭茂牛肝菌殘次菇制備蘭茂牛肝菌酶解液，通過單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)，篩選還原糖和氨基酸的種類、添加量和反應(yīng)條件，并確定最佳工藝參數(shù)，并分析在此工藝條件下，美拉德反應(yīng)對蘭茂牛肝菌酶解液產(chǎn)物中游離氨基酸和呈味氨基酸變化的影響，以期為蘭茂牛肝菌貯運(yùn)過程中的副產(chǎn)物綜合利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘭茂牛肝菌干品：市售；中性蛋白酶（5×104U/g）、木瓜蛋白酶（3×104U/g）：南寧龐博生物工程有限公司；風(fēng)味蛋白酶（5×104U/g）：滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司。葡萄糖、木糖、甘露醇、乳糖、低聚半乳糖、果糖、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸（均為食品級(jí)）：河北華陽生物科技有限公司；醋酸（食品級(jí)）：千禾味業(yè)食品股份有限公司；食用堿：安琪酵母股份有限公司。0.05 mol/L 氫氧化鈉溶液（分析純）：壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；36%～38%甲醛溶液（分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

酶聯(lián)免疫分析儀（FlexA-200）：杭州奧盛儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱（WGLL-625BE）：天津市泰斯特儀器有限公司；自動(dòng)電位滴定儀（ET18）、pH計(jì)（FE28）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；恒溫水浴鍋（HH-6）：上海力辰儀器科技有限公司；臺(tái)式大容量高速冷凍離心機(jī)（HR/T20MM）：上海安亭科學(xué)儀器廠；超微粉碎機(jī)（TYM-30L）：濟(jì)南天宇專用設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蘭茂牛肝菌酶解液制備

稱取一定量蘭茂牛肝菌超微粉，根據(jù)前期研究確定的蘭茂牛肝菌復(fù)合酶解工藝，添加0.60%中性蛋白酶、0.90%風(fēng)味蛋白酶、0.47%木瓜蛋白酶，料液比為1 ∶20（g/mL），調(diào)節(jié)pH 值為7.0，在50 ℃條件下酶解1.5 h。酶解結(jié)束后100 ℃滅酶5 min，冷卻至60 ℃時(shí)進(jìn)行離心（4 000 r/min、15 min）。分離上清液得到蘭茂牛肝菌酶解液備用。

1.3.2 蘭茂牛肝菌酶解液美拉德反應(yīng)條件

1.3.2.1 單因素試驗(yàn)

取制備好的蘭茂牛肝菌酶解上清液30.00 g，固定還原糖添加量4%、氨基酸為2% L-谷氨酸，調(diào)整初始pH 值為7.0，反應(yīng)溫度為110 ℃，時(shí)間為80 min，考察還原糖種類（葡萄糖、木糖、甘露醇、乳糖、低聚半乳糖、果糖）對MRPs 的褐變度A420nm和低分子量香味中間體物質(zhì)含量A280nm的影響。

固定還原糖為果糖，氨基酸為2% L-谷氨酸，調(diào)整初始pH 值為7.0，反應(yīng)溫度為110 ℃，時(shí)間為80 min，考察果糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%）對MRPs 的褐變度A420nm和低分子量香味中間體物質(zhì)含量A280nm的影響。

固定果糖添加量為4%，氨基酸添加量為2.00%，調(diào)整初始pH 值為7.0，反應(yīng)溫度為110 ℃，時(shí)間為80 min，考察不同的氨基酸（L-半胱氨酸、L-谷氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸）對MRPs 的褐變度A420nm和低分子量香味中間體物質(zhì)含量A280nm的影響。

固定果糖添加量為4%，氨基酸為L-谷氨酸，調(diào)整初始pH 值為7.0，反應(yīng)溫度為110 ℃，時(shí)間為80 min，考察L-谷氨酸添加量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）對MRPs 的褐變度A420nm和低分子量香味中間體物質(zhì)含量A280nm的影響。

固定果糖添加量為4%、L-谷氨酸添加量為2.0%，考察不同反應(yīng)溫度（80、90、100、110、120 ℃）、不同反應(yīng)時(shí)間（40、60、80、100、120 min）、不同初始pH 值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0） 條件對MRPs 的褐變度A420nm和低分子量香味中間體物質(zhì)含量A280nm的影響。

1.3.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化美拉德反應(yīng)條件

根據(jù)Central Composite 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用Design-Expert V8.0.6.1 軟件，基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，以還原糖添加量（A）、氨基酸添加量（B）、反應(yīng)溫度（C）、反應(yīng)時(shí)間（D）、初始pH 值（E）為自變量，以褐變度（Y1）及低分子量香味中間體含量（Y2）為響應(yīng)值，各因素選取5 個(gè)水平進(jìn)行編碼，因素水平和編碼見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.2.3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變度及低分子量香味中間體物質(zhì)測定

參照Chen 等[14]的方法，并結(jié)合試驗(yàn)實(shí)際將美拉德反應(yīng)產(chǎn)物稀釋5 倍后，以超純水為對照，分別在波長420 nm 及280 nm 處測定吸光值。420 nm 處所測定得的吸光值為褐變度，A420nm越大，說明美拉德反應(yīng)褐變產(chǎn)物越多[11]；280 nm 處測得的吸光值為低分子量香味中間體含量，A280nm越大說明產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)越多[15]。

1.3.3 氨基酸測定

參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定》，采用全自動(dòng)氨基酸分析儀測定。

1.3.4 滋味貢獻(xiàn)評(píng)價(jià)

采用味覺活性值（taste activity value，TAV）法評(píng)價(jià)呈味物質(zhì)對蘭茂牛肝菌酶解液滋味的貢獻(xiàn)，TAV 指樣品中各呈味物質(zhì)的測定值與該物質(zhì)味道閾值之比[16]，計(jì)算公式如下。

式中：T 為TAV；C1為滋味化合物的質(zhì)量濃度，mg/g；C2為滋味閾值濃度，mg/g。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 處理，GraphPad prism5 做差異性分析及作圖。P<0.05 為差異顯著，P<0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 還原糖種類和添加量對MPRs 的影響

酶解液的美拉德反應(yīng)速度與還原糖的種類有關(guān)，一般單糖反應(yīng)速度大于雙糖，五碳糖反應(yīng)速度大于六碳糖[10]。還原糖的種類和添加量對MRPs 的影響見圖1和圖2。

圖1 不同還原糖對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響Fig.1 Effects of different reducing sugars on Maillard reaction products

圖2 果糖添加量對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響Fig.2 Effect of fructose addition on Maillard reaction products

由圖1 可知，木糖和果糖參與反應(yīng)生成的MRPs的A420nm顯著高于其他還原糖（P＜0.05），葡萄糖參與反應(yīng)生成的MRPs 的A280nm明顯高于其他還原糖，木糖、果糖的A280nm高于甘露醇、乳糖、低聚半乳糖，但差異不顯著（P＞0.05）。因此，選擇果糖為美拉德反應(yīng)的外源還原糖。

由圖2 可知，隨著果糖添加量的增加，MRPs 的A420nm呈升高的趨勢，果糖添加量10%時(shí)顯著高于8%（P＜0.05），此時(shí)褐變度最高；MRPs 的A280nm隨著果糖添加量的增加整體呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)果糖添加量6%時(shí)A280nm最高，但與果糖添加量2%、4%時(shí)沒有顯著性差異（P＞0.05）。因此，選擇果糖添加量為8%作為“0”水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.2 氨基酸種類和添加量對MRPs 的影響

不同的氨基酸會(huì)賦予產(chǎn)品不同的香味[17]。氨基酸種類和添加量對MRPs 的影響見圖3 和圖4。

圖3 不同氨基酸對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響Fig.3 Effects of different amino acids on Maillard reaction products

圖4 L-谷氨酸添加量對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響Fig.4 Effect of L-glutamic and addition on Maillard reaction products

由圖3 可知，添加L-谷氨酸的MRPs A420nm顯著高于其他氨基酸（P＜0.05），添加L-谷氨酸的MRPs A280nm最高，但與添加賴氨酸或組氨酸差異性不顯著（P＞0.05）。因此，選擇L-谷氨酸為美拉德反應(yīng)的外源氨基酸。

由圖4 可知，隨著L-谷氨酸添加量的增加，A420nm逐漸降低，A280nm則先降低后變化趨于平緩，當(dāng)L-谷氨酸添加量為1.0%時(shí)，褐變產(chǎn)物積累量和低分子量香味中間體含量最高，且與其他處理組相比具有顯著差異（P＜0.05）。因此，選擇L-谷氨酸添加量為1%作為“0”水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.3 不同反應(yīng)溫度對MRPs 的影響

反應(yīng)溫度影響美拉德反應(yīng)的速度和產(chǎn)物，低溫條件下美拉德反應(yīng)速率很慢，隨著溫度升高，美拉德反應(yīng)速率會(huì)相應(yīng)加快，但是過高的溫度會(huì)導(dǎo)致丙烯酰胺、苯并芘等致癌物的形成[18]。反應(yīng)溫度對MRPs 的影響見圖5。

圖5 反應(yīng)溫度對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on Maillard reaction products

由圖5 可知，隨著反應(yīng)溫度升高，A420nm和A280nm均整體呈升高的趨勢，當(dāng)反應(yīng)溫度為120 ℃時(shí)，A420nm最高，此時(shí)褐變產(chǎn)物積累量最多，但與110 ℃條件下無顯著差異（P>0.05）；120 ℃時(shí)，A280nm最高，與其他溫度（80、90、100 ℃）差異顯著（P<0.05），但與反應(yīng)溫度110 ℃差異不顯著（P>0.05）。因此，選擇110 ℃為“0”水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.4 不同反應(yīng)時(shí)間對MRPs 的影響

反應(yīng)時(shí)間影響美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物，反應(yīng)時(shí)間短，產(chǎn)物少，反應(yīng)時(shí)間長，產(chǎn)物的種類和含量也相應(yīng)增加[18]。反應(yīng)時(shí)間對MRPs 的影響見圖6。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響Fig.6 Effect of reaction time on Maillard reaction products

由圖6 可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，A420nm呈逐漸上升的趨勢，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為120 min 時(shí)，A420nm顯著高于其他反應(yīng)時(shí)間（P＜0.05），說明褐變產(chǎn)物增多；隨著反應(yīng)時(shí)間延長，A280nm呈先上升后降低的趨勢，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為60、80、100 min 時(shí)，低分子量香味中間體較多，且無顯著性差異（P>0.05）。反應(yīng)時(shí)間為120 min 時(shí)，低分子量香味中間體減少，低分子量香味中間體部分為香味物質(zhì)，會(huì)在一定時(shí)間內(nèi)大量形成，但在高溫長時(shí)間加熱的環(huán)境中香味物質(zhì)易分解及揮發(fā)，進(jìn)而導(dǎo)致A280nm降低。因此，選擇100 min 為“0”水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.5 不同初始pH 值對MRPs 的影響

pH 值對美拉德反應(yīng)過程有著重要的影響，酸性條件不利于美拉德反應(yīng)[19]。酶解液初始pH 值對MRPs 的影響見圖7。

圖7 初始pH 值對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響Fig.7 Effect of initial pH on Maillard reaction products

由圖7 可知，隨著pH 值的增加，A420nm呈逐漸上升的趨勢，pH 值為6.0 時(shí)，A420nm最低；pH8.0 時(shí)，A420nm最高；隨著pH 值的增加，A280nm呈先上升后下降再上升的趨勢，當(dāng)pH 值為7.0 時(shí)，低分子量中間體含量最高。pH 值為7.0、7.5、8.0 時(shí)，A420nm無顯著性差異，A280nm也無顯著性差異。因此，選擇pH7.5 為“0”水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果及最佳工藝驗(yàn)證

2.2.1 回歸模型的建立和方差分析

根據(jù)中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)試驗(yàn)組合24組，探究不同組合對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變度（A420nm）及低分子量香味中間體含量（A280nm）的影響。試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。其中，Y1為A420nm；Y2為A280nm；對褐變度及低分子量香味中間體含量回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3、表4 所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface test results

表3 褐變度方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results of browning degree

表4 低分子量香味中間體方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance results of low molecular weight aroma intermediates

褐變度模型的R2＝0.998 5、R2Adj＝0.998 3、R2Pred=0.953 4，說明該回歸模型擬合度好，可靠性高。分析表3數(shù)據(jù)可知，A、C、D、E、AD、AE、BC、CE、DE、A2、B2、C2、D2對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的褐變度有顯著影響（P＜0.05），其中A、C、D、E、AD、BC、CE、C2、D2影響極顯著（P＜0.01）。5 個(gè)因素對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物褐變度的影響順序：D＞C＞A＞E＞B。

低分子量香味中間體模型的R2＝0.995 9，R2Adj＝0.968 3，R2Pred=0.857 6，說明該回歸模型擬合度好，可用于預(yù)測實(shí)際反應(yīng)條件。分析表4 數(shù)據(jù)可知，B、C、E、AB、AC、BD、BE、C2、D2對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的分子量香味中間體有顯著影響（P＜0.05），5 個(gè)因素對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物低分子量香味中間體的影響順序：C（反應(yīng)溫度）＞B（L-谷氨酸添加量）＞E（初始pH 值）＞D（反應(yīng)時(shí)間）＞A（果糖添加量）。

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到的最優(yōu)條件為還原糖（果糖）添加量為10.00%，氨基酸（L-谷氨酸）添加量1.50%，反應(yīng)時(shí)間80 min，反應(yīng)溫度119.99 ℃，初始pH8.0。在此條件下預(yù)測值：A420nm=1.66、A280nm=1.11。為了試驗(yàn)的可操作性，將最優(yōu)條件調(diào)整為果糖添加量為10.00%，L-谷氨酸添加量為1.50%，反應(yīng)時(shí)間80 min，反應(yīng)溫度120 ℃，初始pH8.0，進(jìn)行3 次平行試驗(yàn)，實(shí)際測量A420nm=1.55、A280nm=1.01。實(shí)際值與預(yù)測值較為接近，表明模型可行。

2.3 美拉德反應(yīng)對酶解液及MRPs 游離氨基酸的影響

游離氨基酸是蘭茂牛肝菌中重要的營養(yǎng)成分，也是重要的滋味成分及香氣前體物質(zhì)[20]。在加工過程中會(huì)與其他成分相互作用賦予食品特殊的風(fēng)味。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物游離氨基酸含量如表5、圖8 所示。

由表5 可知，酶解液及MRPs 中含有17 種氨基酸，經(jīng)過美拉德反應(yīng)后，谷氨酸、蛋氨酸含量有所提高，其他氨基酸含量下降。氨基酸總量由10.68 mg/g 增加到20.29 mg/g，增加率為89.98%。由圖8 可知，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中鮮味氨基酸含量顯著高于酶解液中的鮮味氨基酸含量（P<0.01）。而甜味、苦味、無味氨基酸經(jīng)過美拉德反應(yīng)后均顯著減少（P<0.01）。說明美拉德反應(yīng)可以增加酶解液的鮮味，減少苦澀味。

2.4 美拉德反應(yīng)對酶解液及MRPs 游離氨基酸TAV的影響

不同的氨基酸具有不同的特征滋味[21]及呈味閾值[22]，通過TAV 值的大小對呈味氨基酸進(jìn)行評(píng)價(jià)，可以直觀反映呈味氨基酸對風(fēng)味的貢獻(xiàn)程度[23]。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物游離氨基酸TAV 如表6 所示。

由表6 可知，酶解液中TAV 大于1 的氨基酸包括谷氨酸、丙氨酸、組氨酸、纈氨酸、精氨酸。其中有4 種氨基酸均為苦/甜味氨基酸。MRPs 中TAV 大于1的氨基酸包括谷氨酸、丙氨酸、纈氨酸。其中谷氨酸的TAV 為50.90，該值遠(yuǎn)大于1。谷氨酸是鮮味氨基酸，同時(shí)也能增加甜味，并且能增強(qiáng)滋味的醇厚感和持久性[24]。因此，谷氨酸對酶解液風(fēng)味改善具有較大貢獻(xiàn)。

3 結(jié)論

本研究通過外源添加果糖及L-谷氨酸發(fā)生美拉德反應(yīng)對蘭茂牛肝菌酶解液風(fēng)味進(jìn)行改善。首先進(jìn)行單因素試驗(yàn)篩選得到：還原糖為果糖，添加量為6%；氨基酸為L-谷氨酸，添加量為1.0%；初始pH7.0；反應(yīng)溫度為120 ℃；反應(yīng)時(shí)間為100 min。之后通過響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化反應(yīng)條件，得到美拉德反應(yīng)最適條件：果糖添加量10.00%，L-谷氨酸添加量1.50%，反應(yīng)時(shí)間80 min，反應(yīng)溫度120 ℃，初始pH8.0。在該條件下得到的MRPs 氨基酸總量為20.29 mg/g，經(jīng)過美拉德反應(yīng)改善后鮮味氨基酸含量增加，苦味氨基酸含量減少，谷氨酸TAV 為50.90，是主要的鮮味來源。綜上所述，美拉德反應(yīng)可以有效改善蘭茂牛肝菌酶解液風(fēng)味。