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        超聲法輔助提取內蒙古甘草多糖工藝及其抗氧化活性研究

        2023-11-10 02:15:20王文豹王曉麗
        現(xiàn)代食品 2023年16期
        關鍵詞:甘草多糖次數

        ◎ 董 巍,王文豹,王曉麗,付 雙,野 津

        (齊齊哈爾醫(yī)學院藥學院,黑龍江 齊齊哈爾 161006)

        甘草是我國傳統(tǒng)的“藥食同源”中草藥,為豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensisFisch.)、脹果甘草(Glycyrrhiza inflataBat.)或光果甘草(Glycyrrhiza glabraL.)的干燥根和根莖,具有補脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調和諸藥功效[1]。由于甘草味甜,氣味芳香,常常作為食品調味料出現(xiàn)在多種烹飪方法中?,F(xiàn)代研究表明,多糖作為甘草的主要活性成分之一,具有多種藥理學活性,表現(xiàn)為免疫調節(jié)、抗炎、抗病毒、抗氧化、降血糖、抑制腫瘤生長等方面[2-6]。內蒙古作為甘草的重要產區(qū)之一[7],其具有品質優(yōu)、產量大、分布廣等特點,如何將內蒙古甘草多糖進行合理的開發(fā),對其提取工藝的研究及應用價值的發(fā)揮至關重要,因而備受學者們的關注。

        對于植物多糖的提取方法有很多種[8],包括水溶劑提取法[9-10]、酶提取法[11]、微波提取法[12]、超臨界流體萃取法[13]、超聲輔助提取法[14]等。上述提取方法各有特點,溶劑提取法使用溶劑水作為溶媒,這種方法耗時較長、溫度較高、提取效率較低。酶提取法采用復合酶,由于酶對溫度要求較高,一旦溫度條件發(fā)生改變,在實驗過程中容易失活,導致多糖的結構被破壞。近年,超臨界流體萃取法被作為提取多糖的新興方法,原理是利用流體兼有液體和氣體的特點,對很多物質有很好的溶解能力,但是其設備復雜,運行成本高。超聲波輔助提取法,主要基于超聲波的特點,由于其具有機械效應、空化效應和熱效應,將多糖快速溶解于溶劑中,促進有效成分的溶出,反應在室溫中進行,能夠有效節(jié)約能源。

        本研究針對甘草多糖提取工藝進行探討,主要采用超聲輔助提取方式,先對單因素進行考察篩選,再利用正交設計進行整體優(yōu)化,獲得最佳工藝條件,以期為其在食品、保健品等領域的應用提供理論依據。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        1.1.1 藥材

        甘草采購于哈爾濱市三棵樹中藥材市場,經齊齊哈爾醫(yī)學院董巍副教授鑒定為豆科植物甘草的干燥根和根莖。

        1.1.2 試劑

        無水乙醇:天津市天力化學試劑有限公司;無水葡萄糖:天津市科密歐化學試劑有限公司;硫酸:成都市科隆化學品有限公司;鐵氰化鉀:天津市大茂化學試劑廠;三氯乙酸:天津市大茂化學試劑廠;三氯化鐵:天津市大茂化學試劑廠;磷酸氫二鈉:蘇州誠杰精細化工有限公司;磷酸二氫鈉:蘇州博格瑞化工科技有限公司。

        1.1.3 儀器

        T6 新世紀紫外可見分光光度計:北京普析通用有限責任公司;FA2004B 電子天平:上海佑科儀器儀表有限公司;GZX-9146MBE 電熱鼓風干燥箱:上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠;LG16-W 離心機:北京醫(yī)用離心機廠;KQ-600V 型超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;SPARK 多功能酶標儀:TECAN/帝肯。

        1.2 方法

        1.2.1 甘草多糖的提取

        稱取適量甘草,粉碎過篩,加入適量的水進行超聲提取,超聲結束,經過除蛋白后,加入無水乙醇使其濃度在80%以上,4 ℃醇沉24 h。將醇沉后的溶液離心,獲得甘草多糖。

        1.2.2 甘草多糖的含量測定

        甘草多糖的含量測定采用苯酚-硫酸法,繪制葡萄糖標準曲線,精密稱取經干燥后處理的葡萄糖對照品50 mg,并定容至50 mL 容量瓶中混勻,然后從其中量取5 mL,定容至50 mL 容量瓶中,搖勻,即得0.1 mg/mL 標準溶液。精密量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 溶液,分別加入現(xiàn)配制5%苯酚溶液1 mL,并立即向其中加入濃硫酸5 mL,45 ℃水浴15 min,以490 nm 測定吸光度,以葡萄糖溶液濃度C橫坐標,吸光度A為縱坐標繪制曲線,回歸方程為Y=54.914X+0.001 8,相關系數R2=0.999 2。

        稱取甘草多糖粉末0.03 g,定容至250 mL 容量瓶中,然后從中精密量取1 mL 溶液加入10 mL 的具塞試管中,分別加入1 mL 蒸餾水、5%苯酚溶液(現(xiàn)配現(xiàn)用)1 mL 和5 mL 濃硫酸溶液,立即搖勻,45 ℃水浴15 min,在波長490 nm 處測定吸光度。按照公式(1)計算甘草多糖的提取率。

        式中,C為內蒙古甘草多糖樣品的濃度(g/mL),V為甘草多糖樣品的體積(mL),D為稀釋倍數。

        1.3 單因素試驗

        1.3.1 料液比對甘草多糖提取率的影響

        稱取4 份甘草粉末,每份各10 g,分別考察4 個水平料液比1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25 ,超聲溫度為40 ℃,超聲時間為30 min,提取次數為1 次,對甘草多糖提取率的影響。

        1.3.2 超聲溫度對甘草多糖提取率的影響

        稱取4 份甘草粉末,每份各10 g,分別考察超聲溫度30、40、50、60 ℃ 4 個水平,超聲時間30 min,提取次數為1 次,料液比為1 ∶25,對甘草多糖提取率的影響。

        1.3.3 超聲時間對甘草多糖提取率的影響

        稱取4 份甘草粉末,每份各10 g,分別考察超聲時間20、30、40、50 min 4 個水平,超聲溫度60 ℃,提取次數為1 次,料液比為1 ∶25,對甘草多糖提取率的影響。

        1.3.4 超聲次數對甘草多糖提取率的影響

        稱取4 份甘草粉末,每份各10 g,分別考察超聲次數1 次、2 次、3 次、4 次4 個水平,料液比為1 ∶25,超聲溫度條件設置在60 ℃,超聲時間設定在30 min,對甘草多糖提取率的影響。

        1.4 正交設計試驗

        以料液比(A)、超聲溫度(B)、超聲時間(C)、超聲次數(D)為篩選因素,采用四因素三水平,以甘草多糖的提取率為衡量指標,設計正交試驗L9(34)對甘草多糖的超聲提取工藝進行優(yōu)化。正交因素水平見表1。

        表1 正交因素水平表

        1.5 甘草多糖的抗氧化活性研究

        采用普魯士蘭法[15]。分別精密吸取各組分濃度為0.16、0.31、0.63、1.25、2.5 mg/mL 的多糖及溶液2 mL,向其加入0.2 mol/L pH 為6.8 的磷酸鹽緩沖液1 mL 和1% 鐵氰化鉀溶液1 mL,混勻后在水浴50 ℃加熱20 min,冷卻,加入10% 三氯乙酸溶液1 mL,混勻后吸取1 mL 溶液于比色管中,加蒸餾水1 mL 和0.1%氯化鐵溶液0.5 mL,反應10 min 后在波長700 nm 處測定吸光值。

        1.6 數據處理

        采用Excel 分析數據并制圖,SPSS 25.0 設計正交試驗。

        2 結果與分析

        2.1 單因素試驗結果

        2.1.1 料液比對甘草多糖提取率的影響

        料液比對甘草多糖的提取率作用程度見圖1,甘草多糖的提取率隨著料液比的降低,多糖提取率呈現(xiàn)整體上升的趨勢,當料液比為1 ∶25 時,甘草多糖的提取率最高。開始料液比1 ∶10 時,多糖提取率較低,隨著料液比為1 ∶20,反應體系中隨著溶劑的增加,甘草多糖的提取效果越來越顯著,當料液比1 ∶25 時,反應體系中多糖溶出達到最大程度,多糖提取率最高。

        圖1 料液比對甘草多糖提取率的影響圖

        2.1.2 超聲溫度對甘草多糖提取率的影響

        超聲溫度對甘草多糖提取率影響結果如圖2所示。從圖中可以看出甘草多糖提取率明顯增加的趨勢,當超聲溫度設置為30 ℃時,甘草多糖提取率為1.02%;當超聲溫度設置為40 ℃,多糖提取率為1.43%;當超聲溫度設置為60 ℃時,多糖的提取率大幅度提高,達到2.54%。超聲溫度的提高,促進了多糖分子的運動,極大地促進多糖的溶出速度,因而多糖的提取率較大。但是,對于超聲溫度也要進行嚴格控制,溫度過高會破壞多糖結構。

        圖2 超聲溫度對甘草多糖提取率的影響圖

        2.1.3 超聲時間對甘草多糖提取率的影響

        超聲時間對甘草多糖提取率影響結果如圖3 所示。超聲時間的不同,甘草多糖的提取率也會不同,甘草多糖整體呈現(xiàn)提取率先增大后減小。當超聲時間設置為20 min,多糖的提取率較低;當超聲時間設置為30 min,多糖的提取率達到10.02%;當超聲時間設置為40 min 時,多糖的提取率下降。出現(xiàn)這種情況的原因是由于超聲的機械效應較強,強烈的振動破壞甘草多糖的原有結構。

        圖3 超聲時間對甘草多糖提取率的影響圖

        2.1.4 超聲次數對甘草多糖提取率的影響

        超聲次數對甘草多糖提取率的影響結果如圖4 所示。甘草多糖的提取率隨著提取次數的增加,多糖提取率不斷增加。當提取次數為3 次,多糖的提取率最大,達到10.24%;當提取次數為1 次,甘草多糖溶出較低。隨著提取次數的增加,多糖溶出有增加,但是小幅度增加,當提取次數達到3 次時,多糖的提取率增加最多,但是當提取次數為4 次,多糖的提取率下降,可能由于超聲的強大機械振動促使多糖的結構被破壞,提取率下降。

        圖4 提取次數對多糖提取率的影響圖

        2.2 正交試驗結果

        根據單因素考察的結果,確定以料液比(A)、超聲溫度(B)、超聲時間(C)、超聲次數(D)為試驗因素,采用四因素三水平,以甘草多糖的提取率為衡量指標,確定甘草多糖的最佳提取工藝。試驗結果見表2。

        表2 正交設計試驗結果表

        從表2 中R值可知,對于甘草多糖提取率的影響程度分別是:超聲次數、超聲時間、超聲溫度、料液比,說明超聲次數對甘草多糖提取率的影響最大,其次是超聲時間、超聲溫度,料液比對甘草多糖提取率的影響最小,最佳超聲提取工藝條件是A2B3C2D3,這與正交試驗中提取率最高的組別不一致,因此進行驗證試驗。根據最佳超聲提取工藝條件進行驗證,按照最佳工藝條件A2B3C2D3,即料液比1 ∶20,超聲溫度60 ℃,超聲時間30 min,超聲次數3 次。進行3 次重復性試驗,多糖的提取率分別為11.48%、11.67%、12.04%,三者均高于正交設計,說明通過正交設計篩選出來的工藝條件為最佳工藝條件。驗證試驗結果見表3。

        表3 驗證試驗結果表

        2.3 甘草多糖的抗氧化活性結果

        結果如圖5 所示。隨著濃度的升高,甘草多糖的抗氧化能力越來越強,并與其濃度呈正相關。當濃度為2.5 mg/mL 時,抗氧化能力達到最強。

        圖5 不同濃度甘草多糖對鐵離子還原能力測定效果圖

        3 結語

        本試驗首先探索單因素提取條件,然后結合正交設計確定超聲輔助提取甘草多糖的工藝條件,即料液比1 ∶20,超聲溫度60 ℃,超聲時間30 min,超聲次數3 次,甘草多糖的提取率為11.73%。同時,初步探索了其抗氧化活性,試驗證明甘草多糖具有一定的抗氧化活性。綜上所述,本研究對甘草多糖提取工藝方法進行優(yōu)化,并對抗氧化活性進行初步探索,以期為甘草多糖的合理利用和科學開發(fā)奠定基礎。

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