彭麗香 黃晏驍 曾 頻 江長(zhǎng)安 趙 鵬

胃癌居全國(guó)惡性腫瘤發(fā)病第2位,死亡第3位,據(jù)估計(jì)2014年新發(fā)胃癌病例41.0萬(wàn),死亡29.4萬(wàn),嚴(yán)重危害人民群眾健康[1]。我省2010年的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)亦表明,胃癌仍然是我省居民最主要的癌癥死因之一[2]。2014年,癌癥基因組圖譜研究(TCGA)項(xiàng)目組提出將胃癌分為4個(gè)亞型,EB(Epstein-Barr,EBV)病毒陽(yáng)性型便是其中之一[3]。EB病毒陽(yáng)性胃癌,占所有胃癌的9%,其特征包括PIK3CA頻發(fā)突變、PD-L1/2過(guò)表達(dá)、DNA超甲基化和免疫細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]。后來(lái),Camargo MC等的研究證實(shí)EBV狀態(tài)與胃癌患者預(yù)后密切相關(guān)[4]。

1993年,Tokunaga M首次發(fā)現(xiàn)EBV存在胃癌細(xì)胞,認(rèn)為其可能與胃癌發(fā)生發(fā)展有關(guān),并將這一類胃癌命名為EBV相關(guān)胃癌[5]。與體內(nèi)正常長(zhǎng)鏈完整EBVDNA不同,癌癥患者血漿中EBV-DNA常為游離短DNA片段[6]。在鼻咽癌中血漿EBVDNA檢測(cè)分析用于早期無(wú)癥狀鼻咽癌的篩查[6];而放療中期血漿EBVDNA負(fù)荷可有效預(yù)測(cè)晚期鼻咽癌的療效,且放療后仍可檢測(cè)到EBV DNA的患者PFS和OS明顯更差[7]。

研究顯示,活檢組織中EBV編碼RNA(EBER) 的原位雜交(ISH)仍然是檢測(cè)EBV的金標(biāo)準(zhǔn),且使用PCR測(cè)定EBV病毒載量在EBV相關(guān)疾病的診斷中越來(lái)越重要[8]。因此,本研究擬通過(guò)化療,觀察血漿EBV DNA在晚期胃癌患者的陽(yáng)性率變化,基于此進(jìn)一步探究血漿EBV DNA基礎(chǔ)值及化療后變化與化療近期療效間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

主要收集江西省腫瘤醫(yī)院2017年6月至2020年5月胃癌根治性手術(shù)切除樣本350例,均于10%中性福爾馬林緩沖液固定,石蠟包埋。男性患者209 例、女性患者141例,年齡32～79歲,中位年齡59歲。入組標(biāo)準(zhǔn):經(jīng)影像學(xué)和組織病理學(xué)確診為進(jìn)展期的胃腺癌患者,≥18歲,ECOG行為評(píng)分0～2分,骨髓儲(chǔ)備功能好,無(wú)肝、腎、心、肺等重要臟器的嚴(yán)重?fù)p害,至少具備1個(gè)可測(cè)量病灶,初始接受姑息或新輔助化療。剔除條件:同時(shí)患鼻咽癌和淋巴瘤。

1.2 主要試劑

ELISA 試劑盒購(gòu)自Rapidbio公司,熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自BioTeKe公司,原位雜交消化酶、EBER探針、PCR引物、DNA聚合酶、各清洗緩沖液、脫蠟液、液體封蓋膜、細(xì)胞處理液及其他常規(guī)試劑均購(gòu)自美國(guó)羅氏公司。

1.3 方法

①EBV-RNA(EBVR)原位雜交法診斷胃癌組織中是否存在EBV(EBV診斷金標(biāo)準(zhǔn)):腫瘤組織石蠟包埋后3 μm厚度切片,60 ℃恒溫箱烤片2 h,Ventana BenchMark XT全自動(dòng)染色儀進(jìn)行全自動(dòng)原位雜交檢測(cè)。檢測(cè)過(guò)程:組織脫蠟后經(jīng)熱修復(fù)及酶消化,熒光素標(biāo)記的探針與組織中特異的靶序列進(jìn)行雜交,加入帶生物素的二抗與鏈酶親合素-堿性磷酸酶混合物結(jié)合,底物經(jīng)顯色后產(chǎn)生藍(lán)色沉淀物。用已知陽(yáng)性組織作為陽(yáng)性外對(duì)照。

②PCR檢測(cè)胃癌患者基礎(chǔ)值和每2周化療前血漿EBV-DNA表達(dá)水平:化療前對(duì)患者給予外周血EBV-DNA的PCR檢測(cè)。檢測(cè)過(guò)程:細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)或取不同的共培養(yǎng)細(xì)胞模型,待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%后,更換無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓24 h。加入100 nmol/L E2處理細(xì)胞12 h,各組調(diào)整DMSO至一致,最后分別得到對(duì)照組(ctrl)、E2處理組(E2),處理相應(yīng)時(shí)間后立即終止藥物處理,用TRIzol 試劑提取各組細(xì)胞中總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)均按照TaKaRa試劑盒及熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作,直至獲得目標(biāo)序列并定量,進(jìn)而測(cè)得血漿EBV-DNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

③為進(jìn)一步研究血漿EBV DNA變化與化療療效的關(guān)系,將療效評(píng)價(jià)結(jié)果分為兩類:無(wú)進(jìn)展組(包括完全緩解、部分緩解、疾病穩(wěn)定)和進(jìn)展組(疾病進(jìn)展)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 原位雜交法及PCR檢測(cè)診斷EBV在晚期胃癌患者中的陽(yáng)性率

350例胃腺癌患者組織切片經(jīng) EBV-RNA(EBVR)原位雜交法診斷胃腺癌組織中存在EBV陽(yáng)性37例,陽(yáng)性率為10.57%。

2.2 血漿EBV DNA基礎(chǔ)值及化療后變化

2.2.1 原位雜交法診斷的胃腺癌患者血漿EBV DNA陽(yáng)性率化療后變化 37例經(jīng) EBV-RNA(EBVR)原位雜交法診斷胃腺癌組織中存在EBV陽(yáng)性的胃腺癌患者血漿EBV DNA陽(yáng)性率在化療進(jìn)程中總體呈逐漸下降趨勢(shì), 兩兩比較發(fā)現(xiàn),化療每完成2周后,陽(yáng)性率較前均明顯下降, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 每2周期化療前37例胃癌患者血漿EBV陽(yáng)性變化

2.2.2 胃腺癌患者每2周期化療后EBV DNA陽(yáng)性率與無(wú)進(jìn)展人數(shù)變化 依據(jù)RECIST標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)客觀療效后,顯示每2周期化療后37例胃腺癌患者中無(wú)進(jìn)展人數(shù)(圖1)。在圖中化療2～6周期中血漿EBV DNA陽(yáng)性率降幅最大,而無(wú)進(jìn)展人數(shù)降幅最小,且血漿EBV DNA陽(yáng)性率與無(wú)進(jìn)展人數(shù)具有相關(guān)性(圖2)。

注:主坐標(biāo)為人數(shù),次坐標(biāo)為陽(yáng)性率。

圖2 胃腺癌患者EBV DNA陽(yáng)性率變化與無(wú)進(jìn)展人數(shù)的相關(guān)性

3 討論

胃癌的主要部分與多種致病性感染有關(guān),包括但不限于幽門螺桿菌(H. pylori)或EB病毒(EBV)[9]。

腫瘤微環(huán)境(TME)由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞外成分組成,對(duì)腫瘤進(jìn)展和治療耐藥性起著舉足輕重的作用,這些基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)釋放各種分子直接激活癌細(xì)胞中的生長(zhǎng)信號(hào)或重塑周圍區(qū)域來(lái)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[10-11]。例如,在GC中,PD-L1表達(dá)與不同的臨床病理特征相關(guān),包括高密度TILs,MMR缺乏和EBV陽(yáng)性[12]。

研究顯示,EBV陽(yáng)性胃腺癌患者在化療初期存在血漿EBV DNA轉(zhuǎn)陰,而2～4個(gè)周期后復(fù)陽(yáng)現(xiàn)象,如表1所示,而在該類患者中有部分存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。本研究還發(fā)現(xiàn),在37例EBV陽(yáng)性胃腺癌患者中存在合并幽門螺桿菌感染的患者,其中包含了5例進(jìn)展患者,雖然人數(shù)較少,但在相同條件下化療后其血漿EBV DNA的降幅明顯小于其它未感染幽門螺桿菌胃癌患者。當(dāng)然,幽門螺桿菌感染患者的EBV DNA拷貝數(shù)顯著較高,幽門螺桿菌陽(yáng)性個(gè)體中EBV DNA載量增加的趨勢(shì)表明幽門螺桿菌在調(diào)節(jié)EBV向裂解期的轉(zhuǎn)化中可能起作用,同時(shí),在GC中存在Hp的情況下,基于添加EBV的協(xié)同效應(yīng)產(chǎn)生的估計(jì)風(fēng)險(xiǎn)增加了26倍[13]。同一腫瘤內(nèi)的多種病毒感染可能會(huì)影響TME[14]。然而,是否存在兩者共同作用的因素導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的耐藥性或促進(jìn)EBV的表達(dá)這個(gè)不得而知。本次實(shí)驗(yàn)的相關(guān)人數(shù)較少,僅僅單獨(dú)研究其相關(guān)性可能不妥,因此很難判斷其是否具有相關(guān)性,當(dāng)然這或許也符合上述的腫瘤發(fā)生和發(fā)展存在多因素影響。

不少研究表明,EBV 感染導(dǎo)致的疾病種類多樣,不同標(biāo)本類型都可以給臨床提供有價(jià)值的診療信息,不同疾病應(yīng)選擇不同樣本以實(shí)現(xiàn)EBV感染的準(zhǔn)確診斷[15],因此,一旦晚期胃癌伴轉(zhuǎn)移,在行姑息性手術(shù)后其他轉(zhuǎn)移處只能行化療處理,而其化療效果尚不可控,此刻只檢測(cè)血漿內(nèi)EBV DNA量會(huì)在一定程度上影響本次研究的穩(wěn)定性。當(dāng)然,在以后的研究里還可以通過(guò)使用定量方法(如qPCR)測(cè)試EBV相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)獲得額外的信息和對(duì)患者病情的更好評(píng)估[16]。除此之外,本研究還進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),胃腺癌患者在實(shí)施腫瘤切除及化療后,飲食功能、消化功能也相繼明顯下降,繼而導(dǎo)致免疫功能進(jìn)一步下降,患者也較易發(fā)生急性呼吸道感染,而該類患者的EBA DNA表達(dá)也有較為明顯的波動(dòng)。我們知道,TME是通過(guò)募集和分化免疫抑制和/或抗炎細(xì)胞[如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)、Th17細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)、M2腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)和髓源性抑制細(xì)胞(MDSC)]以及抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞(如NK細(xì)胞和CD8 T淋巴細(xì)胞)發(fā)揮核心作用[17],而急性呼吸道感染可能會(huì)影響體內(nèi)TME,然目前暫未發(fā)現(xiàn)有此類相關(guān)研究。這個(gè)情況對(duì)于本實(shí)驗(yàn)研究也會(huì)有些許影響。然而,此類情況雖不可避免,但是經(jīng)實(shí)驗(yàn)室及影像學(xué)檢查顯示的腫瘤進(jìn)展尚未見(jiàn)到明顯影響。