賈振飛 王嘉毅 李少華

作者單位：455000 河南省安陽市人民醫(yī)院

胰腺癌是各種癌癥中預(yù)后最差的一種,其5年總生存率僅為9%[1]。由于胰腺癌高度侵襲性特征和缺乏早期典型癥狀,導(dǎo)致多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期,甚至發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,僅20%的患者可以行手術(shù)切除,但術(shù)后仍需面臨較高的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[2]。據(jù)報(bào)道,當(dāng)腫瘤小于1 cm時(shí),其5年生存率可達(dá)到100%[3]。因此,胰腺癌的篩查、早期診斷對于改善預(yù)后至關(guān)重要。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類主要由前體mRNA反向剪接形成的內(nèi)源性非編碼RNA,在胰腺癌診斷、發(fā)展、耐藥性中有重要意義[4]。hsa_circ_0006404又稱為circFOXO3,是circRNA中重要一員,與細(xì)胞分化、凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程有關(guān),其在癌癥發(fā)展中的調(diào)控作用復(fù)雜且關(guān)鍵[5]。例如,circFOXO3在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中下調(diào)表達(dá),過表達(dá)circFOXO3能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長、遷移和侵襲[6]。微小RNA(miRNA)穩(wěn)定存在于血清中,為生物標(biāo)志物檢測提供了一種易于獲取和無創(chuàng)來源。既往研究表明,miRNA的異常表達(dá)與胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[7]。其中miR-151-3p已證實(shí)參與乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等多種癌癥過程[8]。然而,circFOXO3、miR-151-3p在胰腺癌中的表達(dá)與臨床病理特征及對胰腺癌的診斷效能尚不清楚。本研究通過檢測胰腺癌癌組織及血清中circFOXO3、miR-151-3p表達(dá)變化,分析癌組織circFOXO3、miR-151-3p表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系,以及血清circFOXO3、miR-151-3p診斷胰腺癌的效能。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2019年1月至2021年12月在本院行手術(shù)治療的100例胰腺癌患者為PC組,其中年齡40～75歲,≥60歲47例,<60歲53例,男、女分別為58、42例,TNM分期:Ⅰ+Ⅱ期63例,Ⅲ期37例;胰頭患者79例,胰體尾者21例。對照組為同期在本院健康體檢的90例志愿者,年齡40～72歲(≥60歲患者40例,<60歲患者50例),男、女分別為48、42例。PC組與對照組年齡分布(t=1.161,P=0.247)、性別(χ2=0.418,P=0.518)比例無顯著差異(P>0.05)。納入標(biāo)準(zhǔn):①原發(fā)性胰腺癌,可行手術(shù)切除;②術(shù)前未進(jìn)行免疫治療,放、化療;③術(shù)前經(jīng)胰腺穿刺活檢、臨床檢查、影像學(xué)檢查確診;④術(shù)后腫瘤組織經(jīng)本院專業(yè)醫(yī)師檢測確診為胰腺癌。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并非胰腺癌惡性腫瘤;②合并肝硬化、肝炎、急性感染;③近期糖皮質(zhì)激素服用史;④胰腺囊腫患者。

1.2 標(biāo)本收集

血清標(biāo)本收集:對照組90例志愿者于體檢時(shí)、100例胰腺癌患者于手術(shù)前采集空腹外周血,離心后取血清,-80 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

組織標(biāo)本收集:手術(shù)期間收集胰腺癌患者切除的癌組織、癌旁組織(距癌灶邊緣>3 cm),編號后立即速凍于液氮中,隨后貯存在-80 ℃統(tǒng)一檢測。

1.3 circFOXO3、miR-151-3p表達(dá)水平的檢測

qRT-PCR技術(shù)檢測癌組織及血清中circFOXO3、miR-151-3p表達(dá)水平。使用TRIzol試劑從癌組織、癌旁組織以及血清中提取總RNA,通過微量核酸蛋白分析儀檢測RNA純度和濃度;使用cDNA合成試劑盒(東洋紡,上海)得到cDNA,按照 SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(Takara,日本)配制成10 μL反應(yīng)體系,然后在CFX96 Real-Time System(Bio-Rad,美國)上通過實(shí)時(shí)PCR測定circFOXO3、miR-151-3p的表達(dá),反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 3 min,95 ℃ 10 s和60 ℃ 30 s,39個(gè)循環(huán)。引物序列見表1,所有引物均由金唯智生物公司合成。circFOXO3以GADPH為內(nèi)參,miR-151-3p以U6為內(nèi)參,使用2-△△Ct法計(jì)算表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組織中circFOXO3、miR-151-3p表達(dá)水平比較

與癌旁組織相比,癌組織中circFOXO3表達(dá)水平降低,miR-151-3p表達(dá)水平升高(P<0.05),見表2。

表2 組織中circFOXO3、miR-151-3p表達(dá)水平比較

2.2 circFOXO3、miR-151-3p表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系

低分化、Ⅲ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者癌組織中circFOXO3表達(dá)水平低于中高分化、Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者,而miR-151-3p表達(dá)水平則高于中高分化、Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05),見表3。

表3 circFOXO3、miR-151-3p表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 血清circFOXO3、miR-151-3p表達(dá)水平比較

PC組與對照組血清circFOXO3、miR-151-3p表達(dá)水平比較差異顯著(P<0.05)。PC組circFOXO3表達(dá)水平顯著低于對照組,miR-151-3p表達(dá)水平顯著高于對照組(P<0.05),見表4。

表4 兩組血清circFOXO3、miR-151-3p表達(dá)水平比較

2.4 circFOXO3與miR-151-3p表達(dá)的相關(guān)性分析

采用ENCORI在線軟件預(yù)測結(jié)果顯示,circFOXO3與miR-151-3p存在結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,血清中circFOXO3與miR-151-3p存在負(fù)相關(guān)性(γ=-0.619,P=0.000);癌組織中circFOXO3與miR-151-3p同樣存在負(fù)相關(guān)性(γ=-0.610,P=0.000)。見圖2、3。

圖1 circFOXO3序列中含有與miR-151-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

圖2 血清circFOXO3與miR-151-3p的相關(guān)性分析

圖3 癌組織中circFOXO3與miR-151-3p的相關(guān)性分析

2.5 血清circFOXO3、miR-151-3p診斷胰腺癌的ROC曲線

ROC結(jié)果顯示,circFOXO3診斷的胰腺癌曲線下面積為0.879(95%CI:0.829～0.928),最佳截?cái)嘀禐?.87。miR-151-3p診斷胰腺癌的曲線下面積為0.937(95%CI:0.904～0.971),截?cái)嘀禐?.24。circFOXO3聯(lián)合miR-151-3p診斷的曲線下面積為0.968(95%CI:0.945～0.992),見圖4。

圖4 血清circFOXO3、miR-151-3p診斷胰腺癌的ROC曲線

2.6 血清circFOXO3、miR-151-3p診斷胰腺癌的效能

血清circFOXO3診斷胰腺癌的截?cái)嘀禐?.87,低于0.87判定為陽性,高于0.87則為陰性;circFOXO3診斷胰腺癌的靈敏度為83.00%,準(zhǔn)確率為83.16%,特異度為83.33%。miR-151-3p診斷胰腺癌的截?cái)嘀禐?.24,高于1.24判定為陽性,否則為陰性;miR-151-3p診斷胰腺癌的特異度為87.78%,準(zhǔn)確率為87.37%,靈敏度為87.00%。circFOXO3聯(lián)合miR-151-3p診斷的特異度為91.11%,靈敏度為90.00%,準(zhǔn)確率為90.53%,具體結(jié)果見表5。

表5 血清circFOXO3、miR-151-3p診斷胰腺癌的效能

3 討論

胰腺癌是一種高致死率的胃腸道癌癥,早期癥狀較隱匿,難以發(fā)現(xiàn),5年生存率低[9]?！?020年全球癌癥統(tǒng)計(jì)》顯示,僅在2020年全球共有胰腺癌新病例495773例,相關(guān)死亡病例為466003例,其死亡率與發(fā)病率幾乎一致[10]。預(yù)計(jì)到2050年,全球胰腺癌的發(fā)病率將增加到每10萬人中18.6例,年均增長1.1%[9]。胰腺癌的確切病因尚不清楚,但許多因素與該病發(fā)展有關(guān),包括年齡、性別、ABO血型、微生物群、飲食因素、種族、胰腺炎、糖尿病家族史、慢性胰腺炎、胰腺囊性病變、遺傳易感性、吸煙、飲酒等[11]。目前,手術(shù)仍然是治愈胰腺癌的唯一方法,然而多數(shù)患者由于早期無癥狀,在確診時(shí)已錯過最佳手術(shù)切除時(shí)機(jī),即便手術(shù)成功,仍要面臨局部轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[12]。因此,急需篩選用于早期胰腺癌診斷的分子標(biāo)志物。

circRNA源于前體信使RNA(mRNA)的反向剪接,具有穩(wěn)定的共價(jià)環(huán)狀結(jié)構(gòu),能抵抗RNase R的消化,并具有獨(dú)立于宿主基因的功能[13]。研究發(fā)現(xiàn)circRNA(hsa_circ_0000069、hsa_circ_0006117、hsa_circ_0007334)在胰腺癌組織中異常表達(dá),參與胰腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[14]。例如,hsa_circ_0006117在胰腺癌組織和細(xì)胞系中呈高表達(dá),并通過調(diào)節(jié)miR-96-5p/KRAS/MAPK促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展[13]。既往研究顯示,circFOXO3在非小細(xì)胞肺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、卵巢癌、膀胱癌等惡性腫瘤中異常下調(diào)表達(dá),低表達(dá)circFOXO3者預(yù)后較差[15]。膀胱癌組織中circFOXO3呈下調(diào)表達(dá),過表達(dá)circFOXO3后能夠抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[16]。Zhang等[17]發(fā)現(xiàn),circFOXO3通過海綿化miR-155和激活非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中的FOXO3基因表達(dá),抑制癌細(xì)胞增殖和侵襲,并認(rèn)為circFOXO3是非小細(xì)胞肺癌中的腫瘤抑制因子。本研究顯示,癌組織中circFOXO3表達(dá)水平較癌旁組織顯著降低,血清circFOXO3表達(dá)水平明顯低于對照組,提示circFOXO3的異常低表達(dá)參與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展。張輝等[18]有關(guān)胃癌的研究顯示,circFOXO3的異常表達(dá)與浸潤深度、TNM分期、組織分化有關(guān)。circFOXO3與胰腺癌臨床病理特征的關(guān)系尚未明確。本研究中Ⅲ期胰腺癌患者癌組織circFOXO3表達(dá)水平較Ⅰ+Ⅱ期患者顯著降低,低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺癌患者中circFOXO3表達(dá)水平減少,提示circFOXO3不僅在胰腺癌中呈現(xiàn)低表達(dá),且參與了胰腺癌的發(fā)展進(jìn)程,與患者部分病理特征有關(guān),其低表達(dá)可促進(jìn)胰腺癌惡化。本研究采用ROC曲線分析血清circFOXO3表達(dá)水平診斷胰腺癌的效能,結(jié)果顯示最佳截?cái)嘀禐?.87,曲線下面積為0.879(95%CI:0.829～0.928)。將低于0.87判定為陽性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)circFOXO3診斷胰腺癌的靈敏度為83.00%,準(zhǔn)確率為83.16%,特異度為83.33%。鑒于circFOXO3較高的檢測效能,且與胰腺癌進(jìn)展有關(guān),其有作為胰腺癌診斷的血清標(biāo)志物的潛能,可以輔助臨床早期診斷胰腺癌。

miRNA能夠在血液、唾液、尿液、腹腔液等體液或組織中檢測到,并被認(rèn)為是潛在的癌癥生物標(biāo)志物[19]。血清mir-25已被提議作為胰腺癌的診斷生物標(biāo)志物,而mir-25聯(lián)合CA19-9檢測Ⅰ期和Ⅱ期胰腺癌的敏感性為97.50%,特異性為90.11%[11]。其中miR-151-3p作為miRNA中的一員,已被證實(shí)能夠調(diào)節(jié)多種與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的信號通路,影響腫瘤進(jìn)展[20]。近期有關(guān)胰腺癌的研究顯示,胰腺癌細(xì)胞中mir-151a-3p表達(dá)水平升高,下調(diào)mir-151a-3p表達(dá)水平會抑制癌細(xì)胞侵襲、增殖及遷移[21]。同時(shí)過表達(dá)mir-151a-3p能夠抑制胰腺癌細(xì)胞凋亡,但促進(jìn)細(xì)胞侵襲、增殖[22]。本研究結(jié)果顯示,癌組織和血清中miR-151-3p表達(dá)水平升高,與既往研究一致,提示胰腺癌中miR-151-3p的異常表達(dá)可能參與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展,其可能成為一種新的血清學(xué)指標(biāo)用于診斷胰腺癌。另有研究顯示,miR-151-3p在鼻咽癌中表達(dá)水平升高與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度低、臨床分期高及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)[23]。然而,miR-151-3p的異常表達(dá)與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系尚未有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn),Ⅲ期胰腺癌患者癌組織中miR-151-3p表達(dá)水平較Ⅰ+Ⅱ期高,且miR-151-3p在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和低分化的胰腺癌患者中均顯著增加,提示miR-151-3p可能在腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移中起著重要作用,其高表達(dá)對胰腺癌進(jìn)展有促進(jìn)作用。本研究結(jié)果顯示,miR-151-3p診斷胰腺癌的曲線下面積為0.937(95%CI:0.904～0.971),最佳截?cái)嘀禐?.24,高于1.24的患者判定為胰腺癌,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-151-3p診斷特異度為87.78%,準(zhǔn)確率為87.37%,靈敏度為87.00%,說明miR-151-3p診斷胰腺癌的效能較好。circFOXO3聯(lián)合miR-151-3p診斷的曲線下面積為0.968(95%CI:0.945～0.992),靈敏度為90.00%,準(zhǔn)確率為90.53%,特異度為91.11%,優(yōu)于circFOXO3或miR-151-3p單獨(dú)檢測效能。提示circFOXO3聯(lián)合miR-151-3p檢測可以彌補(bǔ)單一指標(biāo)檢測對胰腺癌的診斷不足之處,防止出現(xiàn)漏診現(xiàn)象,提高胰腺癌的診斷準(zhǔn)確性及檢出率。

CircRNA具有互補(bǔ)的miRNAs結(jié)合位點(diǎn),可以競爭性結(jié)合miRNAs以抑制其功能。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),circFOXO3與miR-151-3p存在結(jié)合位點(diǎn);進(jìn)一步采用Pearson法分析示,癌組織及血清circFOXO3與miR-151-3p均存在負(fù)相關(guān)性,提示二者在胰腺癌中可能存在某種調(diào)控作用,這也是我們后續(xù)探究方向。

綜上所述,胰腺癌中circFOXO3表達(dá)水平降低,miR-151-3p表達(dá)水平升高,癌組織circFOXO3、miR-151-3p表達(dá)與部分臨床病理特征有關(guān),血清circFOXO3聯(lián)合miR-151-3p診斷胰腺癌的效能較佳。然而,本研究納入樣本量較小,所得結(jié)果有待后續(xù)擴(kuò)大樣本進(jìn)行驗(yàn)證。