徐日紅 祝宏宇 吳 專

作者單位：334600 江西省上饒市廣豐區(qū)人民醫(yī)院

miR-506-3p在惡性腫瘤中被認為是抑癌基因,本研究旨在確定miR-506-3p在肝癌的診斷及預后評估中的作用。據(jù)報道,在2005年到2015年期間,肝癌的發(fā)病率增加了4.6%,盡管總體上癌癥的發(fā)病率呈下降趨勢,但肝癌仍是全球第四大致命癌癥[1]。由于早期肝癌的臨床癥狀不明顯且缺乏特異性,通常被發(fā)現(xiàn)時多處于晚期[2-3]。外科手術被認為是肝癌患者最有效的治療策略,但超過80%患者在診斷肝癌時,已經失去了手術治療的機會[4]。由于晚期肝癌患者對臨床治療不敏感,其總生存期僅為3～16個月[5]。因此,研究肝癌診斷及預后相關的標志物,探索其發(fā)病機理尤為重要。

1 材料與方法

1.1 臨床信息及標本收集

收集廣豐區(qū)人民醫(yī)院2016年6月至2019年12月收治的92例肝癌患者作為研究對象,保留手術切除肝癌組織標本及癌旁正常組織樣本。所有患者具有完整臨床病理資料。另選取了同期健康體檢者92例作為對照。所有受試者均抽取肘靜脈血5 mL保存于凝膠管中,在30 min內以1500 g離心,取血清轉移至1.5 mL試管中保存-80 ℃低溫冰箱中備用。該研究得到了我院倫理審查委員會的批準。

1.2 實時定量PCR(qRT-PCR)

根據(jù)說明書,使用TRIzol分離試劑盒(美國Invitrogen公司)在組織、血清和細胞中提取總RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度計(美國 Nanodrop公司)和15%變性聚丙烯酰胺凝膠測定RNA濃度與完整性。使用TaqMan MicroRNA逆轉錄試劑盒(美國Applied Biosystems公司)對RNA樣品進行逆轉錄反應。接著在ABI 7500 Real-Time PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)上用TaqMan Universal PCR Master Mix(美國Applied Biosystems公司)進行一式三份的qPCR實驗。用SDS 2.0.1軟件計算周期閾值(Ct),使用U6作為內源對照,并對miRNA的表達進行標準化。2-△△ct計算基因的表達。引物序列由賽默飛世爾科技有限公司(上海,中國)設計合成。miR-506-3p forward,5′-ACACTCATAAGGCACCCTTC-3′ and reverse,5′-TCTACTCAGAAGGGGAGTAC-3′);U6 forward,5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′ and reverse,5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′)。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉染

人正常肝細胞THLE-3和肝癌細胞CSQT-2,SK-HEP-1(基因科技生物技術有限公司,中國)在補充有10%胎牛血清,50 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基(福州邁新,中國)中培養(yǎng)。將所有細胞培養(yǎng)物培養(yǎng)在潮濕為5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中。根據(jù)Lipofectamine 3000試劑(美國Invitrogen公司)說明書,將miR-506-3p-mimics和NC-mimics轉染在細胞中,每個孔中轉染的每個miRNA的濃度為50 nM。轉染48 h后,將細胞用于后續(xù)實驗。miR-506-3p mimics (5′-UAAGGCACCCUUCUGAGUAGA-3′) or negative control (NC) mimics (5′-UGUGCGACGCGGCUGGAUGCG-3′) 購自賽默飛世爾科技有限公司(上海,中國)。

1.4 細胞增殖測定

采用細胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8)(吉至生化科技有限公司,上海,中國)試驗評估細胞增殖能力。將細胞接種在96孔板中(3000細胞/孔),在培養(yǎng)0、24、48、72 h后添加10 μL CCK-8溶液。培養(yǎng)2 h后,使用PBS洗滌,采用酶標儀(Multiskan FC,賽默飛世爾科技有限公司,上海,中國)測量450 nm處的吸光度(OD)。

1.5 統(tǒng)計學分析

使用GraphPad Prism 6.0軟件(美國GraphPad Software公司)和SPSS 17.0軟件(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。計數(shù)數(shù)據(jù)用例數(shù)/百分率[n(%)]表示,組間比較采用卡方檢驗。計量數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標準差(Meas±SD)表示,組間比較使用獨立樣本t檢驗。繪制受試者工作特征(ROC)曲線來評估各個參數(shù)的診斷效能。從確定的診斷日期至死亡或最后一次隨訪之日計算總生存期。采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線計算生存率;Log-rank檢驗進行生存分析;Cox回歸分析影響肝癌患者的預后因素。

2 結果

2.1 miR-506-3p在肝癌患者及肝癌細胞中的表達

為了確定miR-506-3p在肝癌中的表達情況,我們進行了qRT-PCR檢測。圖1A數(shù)據(jù)顯示,與癌旁組織相比,肝癌組織中miR-506-3p的表達明顯降低。接下來,我們檢測了肝癌患者與健康人群血清樣本中miR-506-3p的表達,我們注意到肝癌患者血清miR-506-3p表達顯著下調(圖1B)。此外,與人正常肝細胞THLE-3相比,肝癌細胞CSQT-2,SK-HEP-1中miR-506-3p表達也出現(xiàn)下調(圖1C)。Pearson相關系數(shù)顯示了肝癌組織和血清樣本中miR-506-3p的表達呈正相關性(圖1D)。

注:A:qRT-PCR檢測肝癌組織中miR-506-3p的表達。B:qRT-PCR檢測肝癌患者血清中miR-506-3p的表達。C:qRT-PCR檢測人正常肝細胞THLE-3和肝癌細胞CSQT-2,SK-HEP-1中miR-506-3p的表達。D:Pearson分析肝癌組織和血清樣本中miR-506-3p表達的相關性。*為P<0.05。

2.2 miR-506-3p與患者特征的關系

我們收集了受試者的臨床信息,檢測了患者miR-506-3p的血清濃度,選取miR-506-3p表達水平的中位數(shù)作為標準,將miR-506表達水平分為高、低表達。miR-506-3p表達與患者臨床病理特征之間的相關性如表1所示,肝癌患者血清miR-506-3p表達與性別、年齡、肝硬化、HBV感染、甲胎蛋白(AFP)水平之間無相關性。此外,經過統(tǒng)計學分析顯示,miR-506-3p低表達的患者具有顯著的腫瘤體積大(P=0.029)、高TNM分期(P=0.002)和差分化特點(P=0.015)。

表1 肝癌患者血清miR-506-3p表達與臨床病理特征之間的相關性(例,%)

2.3 血清miR-506-3p在肝癌中的診斷價值

接下來,我們生成了ROC曲線,以此來評估血清miR-506-3p作為非侵入性生物標志物對肝癌的診斷潛力,表2為ROC參數(shù)。我們的ROC分析表明,血清miR-506-3p表達在區(qū)分肝癌患者與健康人群具有診斷價值,AUC值為0.911(95%CI = 0.870～0.953),靈敏度為89.13%,特異度為80.43%(圖2A)。此外,血清miR-506-3p區(qū)分腫瘤大小的AUC值為0.751(95%CI = 0.645～0.858),靈敏度為87.50%,特異度為51.67%(圖2B)。區(qū)分TNM分期的AUC值為0.825(95%CI =0.743～0.907),靈敏度為97.67%,特異度為53.06%(圖2C)。區(qū)分病理分化程度的AUC值為0.777(95%CI =0.684～0.871),靈敏度為96.77%,特異度為50.82%(圖2D)。

表2 血清miR-506-3p在肝癌中的診斷效能

注:A:血清miR-506-3p診斷肝癌的ROC曲線;B:血清miR-506-3p在肝癌不同腫瘤大小患者中的表達及其ROC曲線;C:血清miR-506-3p在肝癌不同TNM分期患者中的表達及其ROC曲線;D:血清miR-506-3p在肝癌不同病理分化程度患者中的表達及其ROC曲線。*為P<0.05。

2.4 血清miR-506-3p與肝癌患者生存期的關系

為了進一步評估血清miR-506-3p是否可作為肝癌患者的預后指標,我們生成了診斷肝癌患者預后的ROC曲線。經隨訪顯示,肝癌患者存活54例,死亡38例,診斷預后的AUC值為0.758(95%CI = 0.661～0.855),靈敏度為57.89%,特異度為81.48%(圖3A)。隨后進行了Kaplan-Meier生存分析顯示,肝癌患者血清中miR-506-3p表達的降低預示患者的總體生存率降低(圖3B)。此外,單因素分析顯示,肝癌患者預后不良與TNM分期、分化程度、AFP水平、血清miR-506-3p表達相關;重要的是,多變量分析顯示了TNM分期,血清miR-506-3p低表達是肝癌患者的獨立預后因素。這表明miR-506-3p可作為肝癌患者總體生存率的獨立預后指標(表3～4)。

表3 總生存期的單因素Cox回歸分析

表4 總生存期的多因素Cox回歸分析

注:A:肝癌患者預后的ROC曲線。B:Kaplan-Meier曲線進行了生存分析。

2.5 miR-506-3p能夠抑制肝癌細胞的增殖

進一步驗證miR-506-3p在肝癌中的作用,將miR-506-3p瞬時轉染到CSQT-2,SK-HEP-1細胞中。轉染miR-506-3p mimic后,與NC-mimic相比,miR-506-3p的表達顯著上升(圖4A)。此外,CCK-8試驗表明,上調miR-506-3p后細胞的增殖能力明顯降低(圖4B)。

注:A:用qRT-PCR檢測轉染miR-506-3p mimic,NC-mimic后CSQT-2,SK-HEP-1細胞中miR-506-3p的表達。B:CCK-8測定細胞的增殖能力。*為P<0.05。

3 討論

MicroRNA(miRNA)是一類內源性的單鏈非編碼RNA,長度為18～25個核苷酸,能夠與mRNA的3'-非翻譯區(qū)(UTR)特異性結合,誘導這些基因的直接降解或翻譯破壞[6]。既往的研究已證實了miRNA在細胞增殖、分化及轉移過程中起著關鍵作用[7]。miRNA的異常表達與多種疾病發(fā)生與進展有關,尤其在惡性腫瘤當中[8]。先前報道表明,miR-506-3p在卵巢癌組織中明顯下調,是一類抑癌基因,能夠通過負調節(jié)肌微管蛋白相關蛋白6的表達抑制卵巢癌細胞的增殖[9]。在骨肉瘤中,miR-506-3p起著抑癌作用,能夠通過抑制RAB3D表達抑制骨肉瘤細胞的增殖和轉移[10]。在非小細胞肺癌細胞中miR-506-3p表達顯著降低,miR-506-3p的下調會導致吉非替尼耐藥,恢復miR-506-3p可能是克服癌細胞吉非替尼耐藥的潛在治療方法[11]。以前的大多數(shù)關于miRNA的研究多集中在組織樣本上進行的,但也有一些研究顯示了循環(huán)miRNA的診斷和預后潛力[12]。例如先前的研究證明,miR-21,miR-155和miR-145的組合是區(qū)分NSCLC患者與對照組的合適生物標志物,因為它產生的靈敏度為76.5%,特異性為81.3%,曲線下面積(AUC)為0.87[13]。但目前對于miR-506-3p在肝癌診斷及預后評估中的作用尚不清楚。

在這項研究中,我們驗證了miR-506-3p在肝癌患者中表達明顯下調,并可作為疾病早期及嚴重程度的鑒別診斷指標。此外,miR-506-3p能夠抑制癌細胞的增殖能力。

肝癌在手術切除和放化療后,其預后情況仍不容樂觀[14-15]。因此,對肝癌進行早期診斷及預后評估,可以幫助醫(yī)生及時為患者提供適當?shù)闹委?這對提高患者的生存率具有重要意義。越來越多的證據(jù)表明,miRNA的失調表達在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[16-17]。miR-506與腫瘤細胞中的耐藥性、增殖、侵襲和轉移密切相關[18]。在卵巢癌中miR-506-3p起到抑癌基因作用,可通過靶向EZH2/β-catenin在漿液性卵巢癌中增加對聚(ADP-核糖)聚合酶抑制劑和順鉑的反應[19]。80%的宮頸癌樣本中miR-506的表達下調,可通過直接靶向人宮頸癌中的hedgehog途徑轉錄因子Gli3充當腫瘤抑制因子[20]。在我們的研究中,我們發(fā)現(xiàn)miR-506-3p在肝癌組織、血清樣本和細胞中的表達被抑制,這表明miR-506-3p在肝癌中起到抑癌基因作用。我們進一步研究了血清miR-506-3p與患者臨床病理特征的關系,miR-506-3p表達降低的患者往往具有較大的腫瘤尺寸或TNM分期較高、分化程度較差。在非小細胞肺癌中miR-506-3p表達下調,預示著患者預后不良,并與TNM分期較晚或淋巴結轉移存在關聯(lián)[21]。由此提示,miR-506-3p可能是肝癌患者的潛在的生物標志物,通過靶向遞送miR-506-3p可能是治療肝癌的有效策略。

血清miRNA被認為是臨床診斷中一個有前景的研究領域[22-23],并具有診斷和預測癌癥患者預后的潛力[24]。研究報道,miR-30e和miR-223在肝癌患者血清中顯著下調,可作為肝細胞癌的新型非侵入性生物標志物[25]。我們的研究顯示,血清miR-506-3p對肝癌具有較好的診斷價值,此外,對腫瘤大小、TNM分期、分化程度具有鑒別價值。有研究表明,miR-506在卵巢癌、胰腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中表達降低,與患者的總體生存率低有關[26]。我們通過隨訪顯示,miR-506-3p的下調與肝癌患者的不良預后密切相關。我們的數(shù)據(jù)表明,miR-506-3p可能是肝癌患者新型的診斷及預后評估標志物。盡管如此,miR-506-3p在腫瘤進展中的作用仍然存在爭議[27-28]。在Xiang等的報道中,miR-124-3p和miR-506-3p在肝癌組織和細胞系中被下調,上調兩者后,能夠使肝癌細胞中SIRT1蛋白表達降低,并能夠抑制了肝癌細胞的生長,遷移和侵襲[29]。我們研究初步發(fā)現(xiàn)了miR-506-3p能夠抑制肝癌細胞增殖能力?？傊?miR-506-3p可以作為肝癌診斷及判斷預后的新型生物標志物,但我們的研究仍存在一定的缺陷,對miR-506-3p下游靶向基因未進行深入研究。此外,未構建肝癌動物模型,以此驗證miR-506-3p在肝癌動物模型中的作用機制。這些不足之處,將是我們未來的重點研究方向。