石俊英 王 慧 張斯佳 李 銘

近些年,肺癌的發(fā)病率正逐年升高,其具有較高的致死率和發(fā)病率,嚴重威脅人們的生命安全[1]。但由于早期肺癌并無特異性癥狀,直至確診已進展至中晚期[2]。CT檢查已被逐步運用多種癌癥的早期檢查中,可有效觀察病灶的情況,但常規(guī)CT的輻射較大,具有局限性,因此低劑量CT(Low dose CT,LDCT)已被逐步運用在早期肺癌的診斷當中,尤其是針對于肺部小結節(jié)的診斷率更高,但也存在假陽性率較高的特點[3]。已有研究發(fā)現(xiàn),腫瘤的發(fā)生和發(fā)展途中所生成的相關抗原,均會被免疫系統(tǒng)識別,隨后會生成相關抗體[4]。P5、RNA解螺旋酶自身抗體4-5(RNA helicase autoantibody 4-5,GBU4-5)、黑色素瘤抗原A1(Melanoma antigen A1,MAGE A1)、腫瘤相關基因(Tumor related genes,CAGE)、性別決定基因家族2(Sex determining gene family 2,SOX2)、蛋白基因產(chǎn)物9.5(Protein gene product 9.5,PGP9.5)、G抗原7(G antigen 7,GAGE7)均是腫瘤相關自身抗體的一種,已在多種腫瘤的早期診斷運用[5]。組織因子途徑抑制物-2(Tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2)是抑癌基因的一種,與腫瘤的發(fā)生存在一定關系,且其甲基化成都也隨著腫瘤的分期和升高[6]。但目前其與LDCT以及腫瘤相關自身抗體的聯(lián)合檢測運用仍較少,因此本研究為此展開討論,旨在研究LDCT、腫瘤相關自身抗體以及TFPI-2甲基化聯(lián)合檢測診斷早期肺癌的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院 2019年5月至2021年5月收治的109疑似早期肺癌患者作為研究對象,其中男性69例,女性40例,年齡49～63歲,平均年齡(55.17±2.57)歲。納入標準:①患者疑似肺癌診斷標準;②患者術后經(jīng)病理學檢查符合早期肺癌診斷標準;③患者無其他系統(tǒng)惡性腫瘤;④患者于我院首次接受治療;排除標準:①患者存在LDCT檢查禁忌癥;②患者年齡>80歲;③患者神經(jīng)意志不正常;④患者臨床資料不完整。

1.2 研究方法

金標準:以手術病理結果作為金標準,術后結果發(fā)現(xiàn)109例疑似早期肺患者中陽性101例,陰性8例,鱗癌19例,腺癌79例,小細胞癌11例。

LDCT檢查方法:由我院醫(yī)學影像科進行檢查,采用SIEMENS Defintiion 64層CT檢查設備,檢查前需要將患者身上佩戴的金屬物品全部去除。采用特制衣物遮擋非監(jiān)測部位后,囑咐患者進行呼吸,在深吸氣后閉氣。對患者的肋膈角到肺尖進行掃描,持續(xù)10 s左右。其中掃描參數(shù):管電流50 mA,電壓120 kV,層厚1.0 mm,層距1.0 mm,重建層厚1.0 mm。最終圖像由兩名主治醫(yī)師資歷以上醫(yī)師完成閱片,如遇到意見不合需要溝通交流最后完成閱片。

腫瘤相關自身抗體檢測:所有患者均于入院后首日抽取清晨空腹靜脈血5 mL,以美國貝克曼庫爾特醫(yī)療有限公司的Microfuge 16臺式微量離心機進行離心,3500 r/min,高速離心10 min,獲得上清液并在6 h內(nèi)完成檢查。SOX2和MAGE A1選取上海研啟生物科技有限公司的檢測試劑盒進行檢測;PGP9.5和P5選取北京生研生物技術有限公司的檢測試劑盒進行檢測;GAGE7、GBU4-5和CAGE選取上海心語生物科技有限公司的檢測試劑盒進行檢測,以上均采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法進行檢測。BK-EL10A酶標儀購自山東歐萊博醫(yī)療器械有限公司。其中P53<13.1 kU L、MAGE A1<11.9 kU/L、CAGE<7.2 kU/L 、SOX2<10.3 kU/L、PGP9.5<11.1 kU/L、GAGE7<7.2 kU/L、GBU4-5<17.0 kU/L,以上任何一項大于正常范圍即為陽性,七種抗原中任何1項診斷為陽性即為聯(lián)合診斷陽性。

TFPI-2基因甲基化:DNA提取試劑盒與PCR擴增試劑盒均購自全式金生物技術有限公司,EZDNA甲基化修飾試劑盒購自ZYMO公司,CpG甲基轉移酶購自NEB公司,引物購自Invitrogen公司。按照說明書進行DNA提取,運用甲基化特異性引物和非特異性引物PRC擴增完成修飾的DNA。TFPI-2甲基化引物為5'-TTTCGTATAAAGCGGGTATTC-3',5'-ACGACCCG-CTAAACAAAACG-3',擴增產(chǎn)物為95bp,TFPI-2非甲基化引物為5'-GGATGTTTGTTTTGTATAAAGTG-3',5'-AAACATCCAAAAAAACACCTAAC-3',擴增產(chǎn)無語為89bp,以試劑盒進行PCR反應體系的設計,甲基化的退火溫度為54 ℃,非甲基化退火溫度為60 ℃,同時設置被甲基轉移酶SssI修飾的正常組織為陽性組、沒有被甲基轉移酶SssI修飾的正常組織為陰性組,最后通過10 μL的PCR擴增產(chǎn)物完成凝膠電泳,并對結果進行判定。

1.3 臨床指標

所有患者均接受LDCT檢查,以術后病理學檢查作為金標準,分析LDCT檢出率以及陽性患者和陰性患者腫瘤相關自身抗體、TFPI-2基因甲基化陽性率,分析LDCT聯(lián)合SOX2、PGP9.5、GAGE7和TFPI-2基因甲基化對于早期肺癌的診斷價值。

1.4 方法

2 結果

2.1 LDCT對早期肺癌的檢出率分析

109例疑似肺癌患者經(jīng)過病理學檢查確診101例,LDCT診斷肺癌陽性85例,檢出率為84.15%,見表1。

表1 LDCT對早期肺癌的檢出率分析/例

2.2 陽性患者與陰性患者腫瘤相關自身抗體水平對比

與陰性組患者相比,陰性組患者腫瘤相關自身抗體P53、MAGE A1、GAGE、SOX2、PGP9.5、GAGE7和GBU4-5水平顯著更高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

表2 陽性患者與陰性患者腫瘤相關自身抗體水平對比

2.3 陽性患者和陰性患者TFPI-2基因甲基化陽性率對比

與陰性組患者TFPI-2基因甲基化陽性率[12.50%(1/8)]相比,陽性組患者[48.51%(49/101)]顯著更高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

表3 陽性患者和陰性患者TFPI-2基因甲基化陽性率對比(例,%)

2.4 LDCT、腫瘤相關自身抗體聯(lián)合TFPI-2基因甲基化對早期肺癌的診斷價值

經(jīng)過ROC曲線分析結果發(fā)現(xiàn),LDCT+P53+MAGEA1+GAGE+SOX2+PGP9.5+GAGE7+GBU4-5聯(lián)合TFPI-2基因甲基化對于早期肺癌的診斷靈敏度和特異度均高于任意單一指標(P<0.05),見表4,圖1。

圖1 LDCT、腫瘤相關自身抗體聯(lián)合TFPI-2基因甲基化對于早期肺癌的診斷價值ROC曲線圖

表4 LDCT、腫瘤相關自身抗體聯(lián)合TFPI-2基因甲基化對早期肺癌的診斷價值

3 討論

肺癌現(xiàn)如今已是惡性腫瘤致死率最高的癌癥,其5年生存率僅有12%左右,對于肺癌的早期診斷意義較高[7]。目前肺癌的金標準仍然是術后病理學檢查,但是由于屬于有創(chuàng)操作,具有創(chuàng)傷性[8]。因此尋找更加有效的早期肺癌診斷方式是近些年的研究重點。

CT檢查是近些年常用的癌癥檢查手段,可清晰的檢查組織結構,并從多個角度進行顯示,同時也能夠重組層厚,重建重點區(qū)域部分,使得醫(yī)師能夠從多個維度進行觀察[9]。但是常規(guī)CT輻射性較高,有一定幾率使良性病變惡化,局限性較高。LDCT以低劑量進行掃描,不僅能夠保留CT的敏感度,還能降低劑量,降低不良反應的發(fā)生[10]。本研究結果顯示,LDCT診斷肺癌陽性85例,檢出率為84.15%?？梢?雖然降低了劑量的使用,但并不會使檢出率降低。腫瘤的發(fā)生途中會生成少量異常蛋白,這被稱之為腫瘤相關性抗原[11]。這一類抗原在突變、過表達、異常表達、折疊錯誤等方式得到免疫源性,進而生成所對應的抗體。P53、MAGE A1、GAGE、SOX2、PGP9.5和GAGE7是自身抗體的抗體譜。有研究發(fā)現(xiàn),該6種自身抗體的檢測診斷早期肺癌陽性率較高[12]。據(jù)陳婕等[13]研究發(fā)現(xiàn),CAGE,GAGE7,GBU4-5,MAGE A1,P53,PGP9.5,SOX2自身抗體聯(lián)合檢測明顯優(yōu)于腫瘤標志物的檢測。本研究結果顯示,與陰性組患者相比,陰性組患者腫瘤相關自身抗體P53、MAGE A1、GAGE、SOX2、PGP9.5、GAGE7和GBU4-5水平顯著更高。這提示,腫瘤相關自身抗體P53、MAGE A1、GAGE、SOX2、PGP9.5、GAGE7和GBU4-5在早期肺癌的發(fā)生中起到關鍵作用。原癌基因高表達以及抑癌基因低表達是癌癥發(fā)生的重要途徑。抑癌基因的和基因突變有關,同時和表觀遺傳修飾也有一定的關系[14]。DNA甲基化則是表觀遺傳的主要方式,在腫瘤的初期即可出現(xiàn)。TFPI-2的蛋白酶抑制劑的一種,可抑制腫瘤生長以及轉移,是潛在的抑癌基因[15]。TFPI-2基因啟動啟動子CpG島高度甲基化是引起其水平在惡性腫瘤中水平降低的主要機制[16]。本研究結果顯示,與陰性組患者TFPI-2基因甲基化陽性率相比,陽性組患者顯著更高,展開ROC分析發(fā)現(xiàn)其對于早期肺癌具有較高的敏感度。提示TFPI-2基因甲基化是一種重要的肺癌標志物,其檢測有利于早期肺癌的診斷。本研究進一步將LDCT、腫瘤相關自身抗原和TFPI-2基因甲基化聯(lián)合檢測發(fā)現(xiàn),其了靈敏度和特異性均高于各項單獨檢測,臨床運用價值較高,值得推廣和運用。但本次研究選取的是早期肺癌患者,并且大多數(shù)患者均為腺癌,鱗癌和小細胞肺癌選取較少,可能會使實驗存在一定偏差,因此以后應當擴大樣本量進一步進行研究。

綜上所述,LDCT、7種腫瘤相關自身抗原聯(lián)合TFPI-2基因甲基化聯(lián)合檢測可提高對于早期肺癌的診斷價值,運用效果較高,靈敏度和特異性明顯高于各項單獨檢測。