王俊鵬 魏 紅 孫 凱

作者單位：450003 鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院

肺癌是癌癥相關(guān)死亡的主要原因,根據(jù)組織病理學(xué)特征,主要分為非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLS)和小細(xì)胞肺癌,其中包括鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌和腺癌在內(nèi)的NSCLC占原發(fā)性肺癌的80%以上[1],并以高轉(zhuǎn)移和高死亡率為特征的肺腺癌(lung adenocarcinoma,LAC)為主要亞型[2]。研究表明,肺癌轉(zhuǎn)移與超過(guò)70%的死亡有關(guān)[3],研究肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制,尋找有效治療靶點(diǎn),對(duì)臨床藥物研發(fā)、應(yīng)用及提高患者生存率將具有重要意義。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation,EMT)是從上皮表型到間充質(zhì)表型的動(dòng)態(tài)過(guò)渡狀態(tài),在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用[4]。研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (transforming growth factor β,TGF-β)在NSCLC細(xì)胞中高度表達(dá),增強(qiáng)TGF-β/Smad信號(hào)可有效地促進(jìn)LAC中的EMT和腫瘤轉(zhuǎn)移[5],提示TGF-β/Smad通路可能是肺癌治療的潛在靶點(diǎn)。越來(lái)越多的證據(jù)表明,包括麻醉劑在內(nèi)的圍手術(shù)期因素會(huì)影響手術(shù)后的癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,其中揮發(fā)性麻醉劑七氟醚已被證明可抑制肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲并誘導(dǎo)凋亡[6],但關(guān)于其是否可介導(dǎo)TGF-β/Smad通路影響肺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為及小鼠體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移的相關(guān)報(bào)道較少,故本研究擬體外培養(yǎng)小鼠LAC Lewis細(xì)胞株,經(jīng)不同濃度七氟醚暴露,觀察體外Lewis肺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲變化及小鼠體內(nèi)肺癌轉(zhuǎn)移情況,并檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)因子表達(dá)以探討其可能作用機(jī)制,以期為肺癌治療靶點(diǎn)及臨床藥物研發(fā)提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞(CL-0140)購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡SPF級(jí)C57BL/6小鼠32只,體質(zhì)量(20±2)g,雌雄各半,購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào)為SCXK(湘)2019-0014。恒溫(24±2)℃、恒濕(相對(duì)濕度50%～60%)環(huán)境下普通飼養(yǎng),給予充足水和普通飼料,12 h光照與12 h黑暗交替,適應(yīng)性培養(yǎng)1周。

1.1.3 試劑和儀器 Matrigel基質(zhì)膠(354248)購(gòu)自美國(guó)Corning公司;AnnexinV-FITC/PI試劑盒(E-CK-A211)購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;TGF-β1(ab92486)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin,E-cad)(ab181296)、鋅指蛋白Snail(ab216347)抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;波形蛋白(Vimentin,Vim)(bs-8533R)抗體購(gòu)自北京博奧森生物科技有限公司;N-鈣黏蛋白(N-cadherin,N-cad)(PAB17213)、Smad2/3(ABP52462)、Smad7(3670-100)抗體購(gòu)自武漢艾美捷生物科技有限公司;p-Smad2/3(K25210)抗體購(gòu)自北京百奧萊博生物科技有限公司;TβRⅠ(ENT4627)抗體購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司;BI 7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)ABI公司;550型全自動(dòng)酶標(biāo)儀、Gel Doc XR+凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及七氟醚暴露 DMEM完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清+100 μg/mL鏈霉素+100 U/mL青霉素)復(fù)蘇并培養(yǎng)Lewis肺癌細(xì)胞,于培養(yǎng)箱參數(shù)為37 ℃、5% CO2的加濕環(huán)境下培養(yǎng),當(dāng)細(xì)胞鋪至80%左右,利用胰蛋白酶消化傳代。選擇傳代2～3次后的Lewis肺癌細(xì)胞于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至70%密度左右,分別放置于37 ℃恒溫水浴箱中的無(wú)菌密閉氣體室內(nèi),利用封閉箱出口處氣體監(jiān)測(cè)儀校準(zhǔn)七氟醚濃度:①細(xì)胞僅通入0.5 L/min 95% O2和5% CO2混合氣體;②細(xì)胞通入0.5 L/min 95% O2和5% CO2混合氣體并通過(guò)揮發(fā)罐攜帶0.75%濃度七氟醚;③細(xì)胞通入0.5 L/min 95% O2和5% CO2混合氣體并通過(guò)揮發(fā)罐攜帶1.5%濃度七氟醚;④細(xì)胞通入0.5 L/min 95% O2和5% CO2混合氣體并通過(guò)揮發(fā)罐攜帶3%濃度七氟醚。均暴露培養(yǎng)4 h。

1.2.2 CCK8法檢測(cè)不同濃度七氟醚對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用 經(jīng)氣體暴露培養(yǎng)4 h后,胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞,DMEM完全培養(yǎng)液重懸,以每孔1×104個(gè)/mL細(xì)胞密度接種100 μL至96孔板中培養(yǎng)24 h(各設(shè)5個(gè)復(fù)孔),加入10 μL CCK8溶液,培養(yǎng)箱內(nèi)靜置孵育2 h,450 nm處測(cè)定吸光度(OD)值,細(xì)胞存活率(%)=七氟醚組OD值/無(wú)七氟醚組OD值×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Lewis肺癌細(xì)胞凋亡率 經(jīng)氣體暴露培養(yǎng)4 h后放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h,胰蛋白酶消化法收集各組細(xì)胞,預(yù)冷PBS洗滌2遍,3000 r/min離心5 min,100 μL×結(jié)合緩沖液重懸,5 μL Annexin V-FITC溶液和5 μL PI溶液室溫避光染色10 min,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,重復(fù)3次。

1.2.4 傷口愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Lewis肺癌細(xì)胞遷移能力細(xì)胞經(jīng)氣體暴露培養(yǎng)4 h,無(wú)菌20 μL移液槍頭垂直于細(xì)胞表面制造劃痕,PBS洗滌,繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在劃痕0 h和24 h時(shí)拍照,ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度,劃痕愈合率評(píng)估細(xì)胞遷移能力,其中劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Lewis肺癌細(xì)胞侵襲能力經(jīng)氣體暴露培養(yǎng)4 h后,收集細(xì)胞,利用無(wú)血清培養(yǎng)液以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種至Transwell 24孔板上室(涂布Matrigel基質(zhì)膠),下室加入1 mL DMEM完全培養(yǎng)液,于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后,棉簽拭去未侵入細(xì)胞,甲醇固定上室下表面細(xì)胞15 min,結(jié)晶紫染色后鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)數(shù)視野中的平均細(xì)胞數(shù)。重復(fù)3次。

1.2.6 小鼠體內(nèi)Lewis肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移檢測(cè) 細(xì)胞經(jīng)不同濃度七氟醚(0、0.75%、1.5%、3%)氣體暴露培養(yǎng)4 h后,酶消化法收集,并調(diào)整細(xì)胞密度為2×107個(gè)/mL;經(jīng)尾靜脈注射100 μL細(xì)胞懸液于小鼠體內(nèi),每個(gè)濃度組各8只,常規(guī)普通飼養(yǎng)21 d。脫頸法處死各組小鼠,解剖并收集完整肺組織,后于Bouin固定液中固定24 h,無(wú)水乙醇浸泡至肺組織顏色恢復(fù),轉(zhuǎn)移灶為白色結(jié)節(jié),解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)肺癌轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目(轉(zhuǎn)移灶為類圓形小突起呈結(jié)節(jié)狀,呈圓形半透明點(diǎn)狀2～ 5 mm,部分轉(zhuǎn)移灶可融合在一起)。肺轉(zhuǎn)移抑制率(%)=(對(duì)照組平均肺表面轉(zhuǎn)移灶數(shù)-七氟醚組平均肺表面轉(zhuǎn)移灶數(shù))/對(duì)照組平均肺表面轉(zhuǎn)移灶數(shù)×100%[7]。

1.2.7 RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)Lewis肺癌細(xì)胞中EMT相關(guān)因子mRNA表達(dá)情況 細(xì)胞經(jīng)不同濃度七氟醚(0、0.75%、1.5%、3%)氣體暴露培養(yǎng)4 h后,酶消化法收集,Trizol法提取各濃度下Lewis肺癌細(xì)胞總RNA,測(cè)定RNA純度及濃度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,制備RT-qPCR反應(yīng)體系并進(jìn)行定量檢測(cè)。反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min 40個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。以GAPDH為內(nèi)參基因,2-ΔΔCT法量化mRNA表達(dá)水平。引物序列如下:E-cad:F:5'-GACCG AGAGAGTTTCCCTACG-3'、R:5'-TCAGGCACCTGACCCTTGTA-3';N-cad:F:5'-GAGATCCTACTGGACGGTTCG-3'、R:5'-TCTTGGCGAATGATCTTAGGA-3';Vim:F:5'-CCTTGAACGCAAAGTGGAATC-3'、R:5'-TGAGGTCAGGCTTGGAAACAT-3';Snail:F:5'-CTGCGGGAAGG-CCTTCTCT-3'、R:5'-CGCCTGGCACTGGTACTTCTT-3';GAPDH:F:5'-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'、R:5'-AGCCAAATTCGTTGTCATAC-3'。

1.2.8 Western blot技術(shù)檢測(cè)Lewis肺癌細(xì)胞中TGF-β通路及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)情況 細(xì)胞經(jīng)不同濃度七氟醚(0、0.75%、1.5%、3%)氣體暴露培養(yǎng)4 h后,酶消化法收集,預(yù)冷PBS洗滌2遍,于RIPA裂解液中裂解,離心后取上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度,加熱變性,加等量蛋白樣品于SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行分離,并濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上,5%脫脂牛奶封閉,一抗內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜,洗膜,辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗內(nèi)室溫孵育2 h,洗膜,PVDF膜與ECL發(fā)光溶液反應(yīng)顯影,凝膠成像系統(tǒng)成像并使用Image J軟件量化,以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 七氟醚對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞增殖的影響

Lewis肺癌細(xì)胞存活率隨七氟醚作用濃度增大而降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度七氟醚作用下Lewis肺癌細(xì)胞存活率比較

2.2 七氟醚對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞凋亡的影響

Lewis肺癌細(xì)胞凋亡率隨七氟醚作用濃度增大而升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1,表2。

圖1 不同濃度七氟醚作用下Lewis肺癌細(xì)胞凋亡情況

表2 不同濃度七氟醚作用下Lewis肺癌細(xì)胞凋亡率比較

2.3 七氟醚對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞遷移的影響

Lewis肺癌細(xì)胞劃痕愈合率隨七氟醚作用濃度增大而降低(P<0.05)。見(jiàn)表3,圖2。

圖2 各組Lewis肺癌細(xì)胞遷移情況(×100)

表3 不同濃度七氟醚作用下Lewis肺癌細(xì)胞劃痕愈合率比較

2.4 七氟醚對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞侵襲的影響

Lewis肺癌細(xì)胞侵襲數(shù)隨七氟醚作用濃度增大而減少(P<0.05)。見(jiàn)圖3,表4。

圖3 各組Lewis肺癌細(xì)胞侵襲情況(×200)

表4 不同濃度七氟醚作用下Lewis肺癌細(xì)胞侵襲數(shù)比較

2.5 七氟醚對(duì)小鼠Lewis肺癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的影響

小鼠Lewis肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移灶數(shù)隨七氟醚作用濃度增大而減少,轉(zhuǎn)移抑制率隨七氟醚作用濃度增大而升高(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 不同濃度七氟醚作用下Lewis肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移灶數(shù)及轉(zhuǎn)移抑制率比較

2.6 七氟醚對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞EMT相關(guān)基因表達(dá)的影響

Lewis肺癌細(xì)胞中E-cad mRNA相對(duì)表達(dá)量隨七氟醚作用濃度增大而升高,N-cad、Vim及Snail mRNA相對(duì)表達(dá)量隨七氟醚作用濃度增大而降低(P<0.05)。見(jiàn)表6。

表6 Lewis肺癌細(xì)胞EMT相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量比較

2.7 七氟醚對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞中TGF-β通路及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Lewis肺癌細(xì)胞中TGF-β1、TβRⅠ、p-Smad2/3蛋白及N-cad、Vim、Snail蛋白相對(duì)表達(dá)量隨七氟醚作用濃度增大而降低,Smad7和E-cad蛋白相對(duì)表達(dá)量隨七氟醚作用濃度增大而升高(P<0.05)。見(jiàn)圖4,圖5,表7,表8。

注:A:無(wú)七氟醚組;B:0.75%七氟醚組;C:1.5%七氟醚組;D:3%七氟醚組。

表7 Lewis肺癌細(xì)胞TGF-β通路相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

表8 Lewis肺癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

七氟醚作為一種揮發(fā)性麻醉劑,廣泛用于肺癌外科手術(shù),因有大量臨床數(shù)據(jù)支持其安全性,關(guān)于其對(duì)腫瘤和器官系統(tǒng)的生物學(xué)效應(yīng)以及所涉及的分子機(jī)制的相關(guān)研究逐漸深入[8]。據(jù)報(bào)道,七氟醚預(yù)處理肺癌A549細(xì)胞30 min可改變幾種凋亡相關(guān)的miRNA,提高細(xì)胞凋亡率,減少癌細(xì)胞數(shù)量[9],另可通過(guò)細(xì)胞分化及代謝相關(guān)通路減輕LAC的惡性生物學(xué)行為、順鉑耐藥和體內(nèi)致瘤性[10]。本研究利用不同濃度七氟醚作用LAC Lewis細(xì)胞,并將作用后的細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)進(jìn)行肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,七氟醚可呈濃度依賴性降低Lewis肺癌細(xì)胞存活率、劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)及小鼠肺內(nèi)轉(zhuǎn)移灶數(shù),并提高細(xì)胞凋亡率及轉(zhuǎn)移抑制率,說(shuō)明七氟醚可抑制肺癌細(xì)胞體外惡性生物學(xué)行為,對(duì)小鼠體內(nèi)肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移也具有積極的抑制意義,提示其對(duì)肺癌患者的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移性惡性進(jìn)展可能具有一定的干預(yù)效果,但其涉及的具體機(jī)制還需進(jìn)一步探究。

與原發(fā)腫瘤本身的影響相比,轉(zhuǎn)移灶中癌細(xì)胞的破壞性擴(kuò)散對(duì)肺癌相關(guān)死亡的影響最大,而EMT與腫瘤轉(zhuǎn)移高度相關(guān)[11]。一般來(lái)說(shuō),EMT是上皮細(xì)胞通過(guò)一系列基因表達(dá)調(diào)控作用如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Snail轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)表型細(xì)胞的病理生理過(guò)程,并伴隨一系列生物學(xué)事件,如上皮標(biāo)志物E-cad蛋白表達(dá)降低,而N-cad和Vim的表達(dá)增加,表現(xiàn)出多種間充質(zhì)細(xì)胞特性,遷移和侵襲潛力增強(qiáng)[12]。E-cad負(fù)責(zé)細(xì)胞粘附和細(xì)胞骨架組織,其丟失是EMT過(guò)程中的關(guān)鍵步驟,導(dǎo)致上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榍忠u性間充質(zhì)細(xì)胞[13];Vim、N-cad為間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物,二者表達(dá)上調(diào)與肺癌的惡性進(jìn)展密切相關(guān)[14];Snail是EMT的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,已被發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)腫瘤上皮細(xì)胞向基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲能力并促進(jìn)細(xì)胞遷移,研究表明,敲低Snail可逆轉(zhuǎn)EMT表型,下調(diào)N-cad和Vim,上調(diào)E-cad,可降低非小細(xì)胞肺癌的侵襲和遷移能力[15]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)七氟醚作用后,Lewis肺癌細(xì)胞中Snail、Vim及N-cad mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低,E-cad mRAN和蛋白相對(duì)表達(dá)水平均升高,提示七氟醚可能通過(guò)抑制EMT進(jìn)展而抑制肺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為及小鼠體內(nèi)肺癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。

TGF-β誘導(dǎo)的EMT是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的一個(gè)主要特征,其中TGF-β1信號(hào)控制細(xì)胞增殖、分化、凋亡和遷移,據(jù)報(bào)道,在健康細(xì)胞和癌前細(xì)胞中,TGF-β1主要作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用,而在癌癥晚期,TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[16],其中TGF-β1/Smad2/3信號(hào)通路激活可促進(jìn)肺癌EMT[17]。TGF-β1與其受體TβR結(jié)合形成跨膜復(fù)合物,其下游Smad2/3蛋白被磷酸化并與Smad4結(jié)合形成相對(duì)穩(wěn)定的三聚體復(fù)合物易位至細(xì)胞核,通過(guò)與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同作用共同調(diào)節(jié)EMT過(guò)程靶基因的轉(zhuǎn)錄,Smad7對(duì)該過(guò)程具有抑制作用[18]。Xue等[19]研究發(fā)現(xiàn),TGF-β1可通過(guò)Smad2、Smad3和Smad4作用誘導(dǎo)下游靶基因Snail1易位進(jìn)入細(xì)胞核,與E-cad啟動(dòng)子結(jié)合并抑制E-cad的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而導(dǎo)致EMT中E-cad丟失,通過(guò)激活TGF-β1/Smad/Snail通路可促進(jìn)肺癌EMT;抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路可抑制Lewis肺癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展[20]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)七氟醚作用后,TGF-β1、TβRⅠ及p-Smad2/3蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低,Smad7蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高,提示TGF-β1/Smad2/3通路被抑制,結(jié)合上述EMT相關(guān)因子表達(dá)情況,提示七氟醚可能通過(guò)抑制TGF-β1/Smad2/3通路激活,降低其下游靶基因Snail的細(xì)胞核含量,減少其于核內(nèi)與E-cad啟動(dòng)子的結(jié)合和EMT中E-cad的丟失,減緩EMT進(jìn)展,進(jìn)而減弱癌細(xì)胞的惡性增殖、遷移及侵襲能力,并發(fā)揮體內(nèi)抗癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移作用。

綜上所述,七氟醚可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡,抑制癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及癌細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的肺轉(zhuǎn)移,其作用機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad通路激活進(jìn)而減緩EMT進(jìn)程有關(guān)。