孫曉鳳， 李 蘭

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島 266109）

0 引 言

小鼠卵母細(xì)胞體外成熟是實(shí)驗(yàn)胚胎學(xué)的重要內(nèi)容。小鼠的卵母細(xì)胞從卵泡釋放之后，可以在體外自發(fā)成熟，且小鼠卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)操作步驟簡單，所需時(shí)間較短，比較容易安排實(shí)驗(yàn)，因此可以考慮在相關(guān)專業(yè)本科生尤其是生物科學(xué)專業(yè)細(xì)胞生物學(xué)或者發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程中引入該實(shí)驗(yàn)。小鼠卵母細(xì)胞體外成熟過程中生發(fā)泡期（Geminal Vesicle，GV），生發(fā)泡破裂期（GV Breakdown，GVBD）以及第1 極體排出各時(shí)期的特征清晰，示教效果非常好。對(duì)卵母細(xì)胞成熟過程的知識(shí)也在人類胚胎體外受精（IVF）和動(dòng)物生產(chǎn)中具有重要的實(shí)際應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)的開設(shè)可以加深學(xué)生對(duì)減數(shù)分裂以及卵子發(fā)生的理論認(rèn)識(shí)水平，提高學(xué)生對(duì)胚胎操作以及生物科學(xué)，生殖生物學(xué)的興趣。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與器材

（1）實(shí)驗(yàn)儀器。體式顯微鏡，倒置熒光顯微鏡，二氧化碳培養(yǎng)箱。

（2）實(shí)驗(yàn)器材。3 cm直徑培養(yǎng)皿，口吸管。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

（1）實(shí)驗(yàn)材料。青春期雌性小鼠。

（2）實(shí)驗(yàn)試劑。生理鹽水，米力農(nóng)，M2 培養(yǎng)基，M16 培養(yǎng)基，青霉素，鏈霉素，熒光染料Hoechst33342。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 卵巢分離與卵母細(xì)胞收集

在M2 培養(yǎng)基中加入米力農(nóng)（米力農(nóng)工作濃度為2.5 μmol/L）配制撿卵洗卵緩沖液，M2 培養(yǎng)基成分如下：二水氯化鈣0.251 37 g/L，無水硫酸鎂0.164 9 g/L，氯化鉀0.356 35 g/L，磷酸氫鉀0.162 g/L，碳酸氫鈉0.35 g/L，氯化鈉5.531 93 g/L，牛白蛋白4.0 g/L，葡萄糖1.0 g/L，HEPES 5.427 26 g/L，丙酮酸鈉0.036 3 g/L，乳酸鈉2.95 g/L，酚紅0.010 6 g/L。成熟培養(yǎng)之前的所有操作步驟均在撿卵洗卵緩沖液中進(jìn)行。利用頸椎脫臼法將青春期雌性小鼠處死，取出小鼠卵巢，剝離周圍其他組織，去掉最外層的致密膜，用添加了青霉素、鏈霉素的生理鹽水清洗3 次后將卵巢轉(zhuǎn)移到撿卵洗卵緩沖液中，用注射器針頭進(jìn)行機(jī)械穿刺后不斷擠壓，徹底釋放卵母細(xì)胞，之后用移液器輕輕吹打，在顯微鏡下觀察到卵母細(xì)胞周圍沒有粘附的顆粒細(xì)胞即可。在體式顯微鏡下用口吸管取出卵母細(xì)胞，用撿卵洗卵緩沖液清洗3 次，準(zhǔn)備成熟培養(yǎng)。

1.3.2 卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)

在3 cm直徑培養(yǎng)皿中，用成熟培養(yǎng)基做成多個(gè)液滴，每個(gè)液滴60 μL。成熟培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為M16，主要成分如下：二水氯化鈣0.251 37 g/L，無水硫酸鎂0.164 9 g/L，氯化鉀0.356 35 g/L，磷酸氫鉀0.162 g/L，碳酸氫鈉2.101 g/L，氯化鈉5.531 93 g/L，牛白蛋白4.0 g/L，丙酮酸鈉0.036 3 g/L，葡萄糖1.0 g/L，乳酸鈉2.95 g/L，酚紅0.010 6 g/L。液滴做好后，蓋上一層礦物油，避免培養(yǎng)液中的水分蒸發(fā)，影響滲透壓，加蓋礦物油后的液滴見圖1。成熟培養(yǎng)前在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中至少平衡4 h［1］。將1.3.1 步驟中清洗干凈的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到成熟培養(yǎng)液的液滴中，每個(gè)液滴培養(yǎng)20 個(gè)卵母細(xì)胞。在倒置顯微鏡下拍照，觀察GV期卵母細(xì)胞形態(tài)。拍照后將培養(yǎng)皿迅速放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中成熟培養(yǎng)16 ～18 h。取出培養(yǎng)皿置于倒置顯微鏡下拍照，觀察統(tǒng)計(jì)GV 期、GVBD期和MII期的卵母細(xì)胞。

圖1 加蓋礦物油后的液滴

1.3.3 Hoechst33342 染色

收集卵母細(xì)胞，加入Hoechst33342 染色液染色2 min后可直接在熒光倒置顯微鏡下觀察，拍照。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 GV期卵母細(xì)胞

GV期卵母細(xì)胞屬于初級(jí)卵母細(xì)胞階段，減數(shù)分裂Ⅰ啟動(dòng)后經(jīng)歷前期Ⅰ的細(xì)線期、偶線期、粗線期并停留在雙線期，此時(shí)期內(nèi)去掉顆粒細(xì)胞的裸卵，細(xì)胞核清晰可見，形態(tài)特征與洪燈等描述［2］一致。細(xì)胞核大，呈圓球形，染色質(zhì)高度疏松，核膜完整且明顯，含有折光強(qiáng)的核仁，胞漿中心稍變黑并呈顆粒狀（見圖2）。

圖2 GV期卵母細(xì)胞

2.2 GVBD卵母細(xì)胞

生發(fā)泡破裂標(biāo)志著卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)的開始，其形態(tài)特征與王憲的描述一致［3］。此時(shí)期核膜破裂，完全解散，核仁消失，原來位于核內(nèi)的物質(zhì)與核質(zhì)混合在一起（見圖3）。

圖3 GVBD期卵母細(xì)胞

2.3 MⅡ卵母細(xì)胞

卵母細(xì)胞發(fā)生生發(fā)泡破裂后，染色體凝聚并排列在中央赤道板上，此時(shí)為第1 次減數(shù)分裂的中期，之后著絲粒與微管及微管組織中心結(jié)合，微管從此中心伸出到達(dá)核基質(zhì)，著絲粒與每對(duì)同源染色體的單體相連，形成紡錘體。之后卵母細(xì)胞在細(xì)胞核動(dòng)物極附近排出第1 極體。由于這是一次不均等分裂，產(chǎn)生的2 個(gè)細(xì)胞大小不均等，被稱為極體的是小細(xì)胞。大細(xì)胞是次級(jí)卵母細(xì)胞，次級(jí)卵母細(xì)胞進(jìn)入第2 次減數(shù)分裂并停滯在MⅡ期（見圖4）。第1 極體的排出標(biāo)志著卵母細(xì)胞核的成熟。

圖4 MⅡ期卵母細(xì)胞

2.4 Hoechst33342 細(xì)胞核染色

為了進(jìn)一步觀察第1 極體的排出情況，在顯微鏡下通過口吸管挑選排出第1 極體的卵母細(xì)胞，置于Hoechst33342 細(xì)胞核染色液中進(jìn)行染色，染色后在倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照?？梢姲l(fā)出熒光的卵母細(xì)胞核和極體核（見圖5）。

圖5 MⅡ期卵母細(xì)胞Hoechst33342顯示細(xì)胞核

3 討 論

3.1 實(shí)驗(yàn)開設(shè)的現(xiàn)狀

卵母細(xì)胞的體外成熟技術(shù)是動(dòng)物繁殖領(lǐng)域以及生殖醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常用技術(shù)，此知識(shí)點(diǎn)已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域本科畢業(yè)生學(xué)習(xí)和工作的常用技術(shù)。但是，目前大部分高校生物科學(xué)專業(yè)僅有相關(guān)理論課開設(shè)，實(shí)驗(yàn)課還基本處于空白狀態(tài)，因此針對(duì)生物科學(xué)專業(yè)本科生開設(shè)本實(shí)驗(yàn)是非常有必要的，并且隨著教學(xué)改革的深入和國家對(duì)創(chuàng)新型人才的需求，各高校對(duì)實(shí)驗(yàn)教學(xué)越來越重視，并逐漸把科研前沿技術(shù)融入本科生的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中［4］。本實(shí)驗(yàn)的開設(shè)不僅可以通過理論與實(shí)踐的結(jié)合，加深對(duì)理論知識(shí)的深入理解；掌握本實(shí)驗(yàn)技術(shù)還有助于以后的學(xué)習(xí)和相關(guān)工作的開展。

3.2 實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)

（1）米力農(nóng)抑制卵母細(xì)胞體外自發(fā)成熟。研究表明，卵泡液中含有能夠抑制卵母細(xì)胞成熟的物質(zhì)，如次黃嘌呤，cAMP和磷酸二酯酶等［5］，這些卵母細(xì)胞成熟抑制劑使得哺乳動(dòng)物體內(nèi)的卵母細(xì)胞，可以在排卵前長時(shí)間停留在第1 次減數(shù)分裂的雙線期，排卵前，在促性腺激素的作用下，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)，生發(fā)泡破裂。而GV期卵母細(xì)胞被釋放到不含激素的培養(yǎng)液中，也能夠恢復(fù)減數(shù)分裂，這種現(xiàn)象叫自發(fā)成熟。米力農(nóng)是一種磷酸二酯酶的抑制劑，能有效抑制卵母細(xì)胞體外自發(fā)成熟［6］。在卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)前的操作中，米力農(nóng)的少量添加可通過特異性抑制磷酸二酯酶的活性，阻止cAMP降解，阻滯卵母細(xì)胞成熟分裂，使體外分離的卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核協(xié)同成熟［7］，在成熟培養(yǎng)前處于相同的時(shí)期，以便在成熟培養(yǎng)后獲得同期成熟的卵母細(xì)胞。除此之外，米力農(nóng)還可以提高核移植過程中的去核率，提高胚胎發(fā)育率，增加克隆胚的產(chǎn)量［8-9］，未見明顯的負(fù)面作用。

（2）M16 培養(yǎng)基的提前平衡。由于成熟培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基液滴較小，很容易受到外界環(huán)境的影響，因此在成熟培養(yǎng)前需要提前做好液滴，蓋上礦物油，避免培養(yǎng)液中的水分蒸發(fā)，影響滲透壓，并在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中至少平衡4 h。

（3）所用礦物油純度要高。如果礦物油不純，一些水溶性物質(zhì)從礦物油中進(jìn)入培養(yǎng)液，將會(huì)影響培養(yǎng)液的成分［1］，整個(gè)液滴只有60 μL，緩沖能力較低，卵母細(xì)胞成熟質(zhì)量很容易受到影響。

（4）獲得裸卵。釋放卵母細(xì)胞后，用移液槍多次輕輕吹打，以去掉顆粒細(xì)胞，獲得裸卵。

3.3 教學(xué)的組織安排

本實(shí)驗(yàn)因?yàn)樾∈篌w外成熟時(shí)間為16 ～18 h，這個(gè)時(shí)間要求比較嚴(yán)格，所以可以分成兩次實(shí)驗(yàn)，總共安排8 學(xué)時(shí)。第1 次實(shí)驗(yàn)安排在下午從培養(yǎng)液準(zhǔn)備，小鼠處死，卵巢分離到卵母細(xì)胞收集共需要4 學(xué)時(shí)，下午5：00 左右放入培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。第2 次實(shí)驗(yàn)也需要4學(xué)時(shí)，安排在第2 天上午，教師進(jìn)行卵母細(xì)胞不同成熟階段的講解后，大約9：00 從培養(yǎng)箱取出體外成熟的卵母細(xì)胞，在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察拍照，進(jìn)一步區(qū)別GV期卵母細(xì)胞，GVBD卵母細(xì)胞和MⅡ卵母細(xì)胞。并收集排出第一極體的卵母細(xì)胞進(jìn)行Hoechst33342 染色，2 min 后倒置顯微鏡下進(jìn)一步觀察經(jīng)過減數(shù)分裂的卵母細(xì)胞其細(xì)胞核的變化并拍照。

4 結(jié) 語

生殖細(xì)胞減數(shù)分裂是生物科學(xué)專業(yè)本科生的學(xué)習(xí)重點(diǎn)，理解起來也有一定難度，由于種種原因，據(jù)了解，目前高校生物科學(xué)專業(yè)中開設(shè)這個(gè)實(shí)驗(yàn)的并不多，該實(shí)驗(yàn)的開設(shè)在幫助學(xué)生理解減數(shù)分裂以及卵母細(xì)胞成熟過程方面具有重要的意義，因此生物科學(xué)專業(yè)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)或者發(fā)育生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中本實(shí)驗(yàn)的開設(shè)非常有必要，對(duì)生物科學(xué)創(chuàng)新型科研人才的培養(yǎng)具有重大的促進(jìn)作用，尤其是針對(duì)生物科學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)班的開設(shè)，將與其專業(yè)培養(yǎng)目標(biāo)高度契合［10］，通過完善實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容，提高學(xué)生創(chuàng)新實(shí)踐能力［11］，有效克服傳統(tǒng)教學(xué)中重知識(shí)輕實(shí)踐，重理論輕操作的現(xiàn)象［12-15］。并且隨著生物科學(xué)專業(yè)畢業(yè)生就業(yè)范圍的不斷擴(kuò)大，部分畢業(yè)生畢業(yè)后進(jìn)入大型動(dòng)物繁殖場或者醫(yī)院生殖中心工作，此實(shí)驗(yàn)的開設(shè)也是這部分學(xué)生的實(shí)際需求。從實(shí)際操作情況來看，本實(shí)驗(yàn)所涉及卵母細(xì)胞各時(shí)期的特征清晰，示教效果非常好，所需時(shí)間較短，比較容易安排實(shí)驗(yàn)，所以本實(shí)驗(yàn)的開設(shè)是完全可行的。