王宇瑩, 洪羽劍, 盧鈞勝,2, 曾婧瀟, 付曉鋒, 胡曉東

(1. 天津大學 精密儀器與光電子工程學院, 天津 300072; 2. 天津工業(yè)大學 生命科學學院, 天津 300387)

光學顯微鏡豐富了人們對于微觀世界的認識, 在生物醫(yī)學、 材料科學等領域都有著廣泛的應用[1-2]。 然而, 傳統(tǒng)光學顯微鏡的分辨能力會受到衍射極限的限制[3]。 為了提高成像分辨能力, 2011年, Zengbo Wang等[4]提出了基于微球透鏡的顯微成像技術, 使用直徑為2 μm～9 μm的二氧化硅微球, 結合80×, NA=0.9的物鏡, 成功在鹵素燈照明下實現(xiàn)了最小尺寸為50 nm的微結構的觀測。 2022年, Yurong Cao等[5]使用完全浸沒于PDMS、 直徑為30 μm的鈦酸鋇微球輔助顯微鏡, 對金、 銀、 鉻制成的納米顆粒樣品進行了成像, 能夠分辨出130 nm的間隙距離。 Jianguo Wang等[6]優(yōu)化了浸沒介質, 直徑為10 μm的PS微球在半浸沒狀態(tài)下可以清晰分辨出直徑為200 nm的二氧化硅納米粒子陣列。 基于微球透鏡的顯微成像技術具有成像系統(tǒng)簡單、 可實時成像、 不需要熒光染料進行標記等優(yōu)點, 具有重要的研究意義和廣闊的應用前景。

2015年, T.X.Hoang等[7]基于米氏理論, 仿真了微球對點光源的成像過程, 指出在共振模式下其分辨能力有顯著提升; 2016年, A. V. Maslov和V. N. Astratov[8]對微球成像系統(tǒng)進行了二維仿真, 分析了光源相干性對微球分辨能力的影響, 發(fā)現(xiàn)相干光源照明條件下具有更高的分辨能力; 2020年, L.Y.Yu等[9]建立了三級全波模擬體系來深入分析微球的成像特性, 研究了樣品的材料屬性對微球分辨率的影響, 結果表明, 金屬樣品具有更好的成像效果。 以上研究工作分析了共振模式、 照明條件、 樣品材料等對成像分辨能力的影響, 然而缺乏對于微球尺寸等成像系統(tǒng)參數(shù)變化如何影響成像分辨能力的仿真分析。 目前, 還有許多研究者已經(jīng)開展了使用懸臂梁控制抬高微球脫離樣品表面的成像實驗[10-12], 然而在實驗中并沒有分析微球和樣品距離的變化對成像放大倍數(shù)和成像分辨能力產(chǎn)生的影響。

因此, 本文提出了一種基于點源成像的仿真計算方法, 通過仿真, 分析了成像系統(tǒng)參數(shù)的變化對成像分辨能力產(chǎn)生的影響, 從而能夠更好地指導實驗。 首先, 使用COMSOL軟件仿真了微球與點光源相互作用的過程; 再基于角譜法將仿真得到的遠場進行反向傳播, 獲得了微球對點光源的成像結果, 從而對分辨能力進行分析。 本文分別設計了點光源與微球下端間距為5 nm以及點光源與微球下端間距為100 nm～1 000 nm的仿真模型來模擬實驗中微球緊貼樣品以及抬高微球脫離樣品表面兩種情況。 在微球緊貼點光源的模型中, 僅改變微球半徑, 仿真分析了微球半徑變化對成像分辨能力的影響; 然后, 在仿真模型中移動點光源位置, 分析了微球和點光源距離變化對成像分辨能力的影響。

1 基本原理與方法

本文使用COMSOL軟件仿真了微球與點光源的相互作用過程, 仿真模型如圖1 所示。 微球半徑為R, 折射率為nm, 環(huán)境介質的折射率為nb, 點光源位于微球正下方, 與微球下端之間的距離為d, 波長為600 nm。 遠場觀察線相對于點光源的數(shù)值孔徑為0.9, 模擬顯微鏡物鏡對光場的收集, 記錄下遠場觀察線上的場分布, 再利用角譜理論對平面波反向傳輸計算, 重構出點源的像。

圖1 仿真模型Fig.1 Simulation structure

根據(jù)角譜理論, 記錄平面和待測平面的光場都可以看成是由無數(shù)組傳播方向不同、 幅值不同的平面波疊加而成, 在疊加時每個單色平面波分量的振幅和相位都由相應平面上光場的角譜Ai(fx,fy)和A(fx,fy)決定, 其中fx=cosα/λ,fy=cosβ/λ, cosα和cosβ為傳播方向的方向余弦,λ為波長。 記錄平面和待測平面的光場可以分別表示為

Ui(xi,yi)=

(1)

以及

U(x,y)=

(2)

由式(1)和(2)可知, 根據(jù)Ai(fx,fy)和A(fx,fy)之間的關系, 可以計算得到在傳播過程中每一個平面波分量的振幅和相位的變化, 從而得到整個光場從記錄平面到待測平面所發(fā)生的變化。 角譜傳播規(guī)律的基礎是標量波動方程

(3)

所以, 根據(jù)標量衍射的亥姆霍茲方程, 可以得到Ai(fx,fy)和A(fx,fy)之間的關系式

Ai(fx,fy)=

(4)

其中, 傳遞函數(shù)H(fx,fy)的表達式為

H(fx,fy)=

(5)

式(4)描述了角譜的傳遞規(guī)律, 根據(jù)記錄平面上的角譜, 就可以得到待測平面上的角譜, 然后進行傅里葉逆變換, 就可以得到待測平面光場的復振幅分布, 計算公式為

Ui(xi,yi)=F-1{F[U(x,y)]×H(fx,fy)}。

(6)

因此, 基于角譜法, 可以將遠場觀察線位置處的場反向傳播到空間中的任何平面位置, 此處選擇重構圖像沿y軸強度最強位置為微球對點光源的成像位置y′。 為了分析微球尺寸以及微球和樣品距離對成像分辨能力的影響, 采用如圖2 所示的方式, 根據(jù)成像位置和點光源的位置, 可計算得出成像放大倍數(shù)

圖2 點源成像放大倍數(shù)計算示意圖Fig.2 Schematic diagram of point source imaging magnification calculation

(7)

點源成像的圖樣寬度用點擴散函數(shù)(point spread function, PSF)的半高全寬值(full width at half maximum, FWHM)來表示, 即w。 通過計算點源成像圖樣寬度和放大倍數(shù)的比值來分析微球的成像分辨能力[13], 即w/M, 該比值越小說明分辨能力越強。

2 仿真結果與分析

2.1 微球尺寸對分辨能力的影響

為了分析微球尺寸對成像分辨能力的影響, 仿真了不同尺寸微球對距微球下端距離d均為5 nm的點光源的成像過程。 在仿真模型中設定微球折射率nm為1.46, 環(huán)境介質的折射率nb為1, 波長λ為600 nm。 以0.5 μm為間隔改變微球的半徑值R, 從5 μm增大至10 μm。 微球半徑分別為6.5 μm和8.5 μm時的仿真結果如圖3(a)和圖3(c)所示, 在相對于點光源的數(shù)值孔徑為0.9的位置劃定遠場觀察線, 模擬顯微鏡物鏡對光場的收集, 并基于角譜法將仿真結果中遠場觀察線處的場分布進行反向傳播, 計算得到其成像結果分別如圖3(b)和圖3(d)所示。

(a) 點光源位于半徑為6.5 μm的微球下方5 nm處的仿真結果

計算并繪制得到成像圖樣寬度和放大倍數(shù)的比值w/M隨微球半徑R的變化曲線, 如圖4 所示。 微球半徑為5 μm時,w/M最小, 約為0.37λ。 當R從5 μm增大至10 μm時,w/M從0.37λ增大至0.52λ, 可以看出分辨能力隨微球尺寸的增大而降低, 增長趨勢逐漸趨于平緩。 仿真結果表明, 在其他參數(shù)保持不變時, 減小微球的半徑可以有效地提高分辨能力。

圖4 成像圖樣寬度和放大倍數(shù)的比值與微球半徑的關系Fig.4 Relationship between w/M and radius of microsphere

由圖4 可知, 成像圖樣寬度和放大倍數(shù)的比值與微球半徑的關系曲線在R=9 μm處下降,R=9 μm時的仿真結果如圖5 所示, 此時出現(xiàn)了明顯的共振現(xiàn)象, 因此其分辨能力得到了提高。

圖5 點光源位于半徑為9 μm的微球下方5 nm處的仿真結果Fig.5 The field intensity for a point source located at d=5 nm below the microsphere of R=9 μm

2.2 點光源與微球的距離對分辨能力的影響

為了分析點光源與微球的距離的變化對分辨能力的影響, 在仿真中改變了點光源和微球之間的距離, 模擬了微球對不同位置樣品的成像。 在仿真中, 選取了半徑分別為5 μm, 7.5 μm和10 μm的微球(微球折射率nm為1.46)進行分析, 環(huán)境介質折射率nb為1, 波長為600 nm, 仍與2.1節(jié)保持一致。 將點光源和微球下端的間距d從5 nm增加至1 000 nm, 仿真并計算得出微球對不同位置點光源進行成像的結果。 微球半徑為7.5 μm時, 點光源和微球下端的距離d分別為200 nm和600 nm時的仿真結果如圖6(a)和圖6(c)所示, 在相對于點光源的數(shù)值孔徑為0.9的位置劃定遠場觀察線, 模擬顯微鏡物鏡對光場的收集, 并基于角譜法將仿真結果中遠場觀察線處的場分布進行反向傳播, 計算得到其成像結果, 分別如圖6(b)和圖6(d)所示, 二者對比可以看出, 點光源和微球距離增大時, 其成像圖樣寬度變寬。

(a) 點光源位于R=7.5 μm的微球下方d=200 nm處的仿真結果

計算和分析不同直徑微球對不同位置點光源的成像分辨能力, 表1～表3 展示了半徑分別為5 μm, 7.5 μm和10 μm的微球對不同位置點光源的成像圖樣半高全寬w、 放大倍數(shù)M以及二者的比值w/M。

表1 半徑為5 μm的微球對不同位置點光源的成像圖樣寬度、 放大倍數(shù)及二者比值Tab.1 Simulatedw, magnification M, and ratio w/M of 5 μm-radius microsphere based imaging system for different positions of the point source

表2 半徑為7.5 μm的微球對不同位置點光源的成像圖樣寬度、 放大倍數(shù)及二者比值Tab.2 Simulatedw, magnification M, and ratio w/M of 7.5 μm-radius microsphere based imaging system for different positions of the point source

表3 半徑為10 μm的微球對不同位置點光源的成像圖樣寬度、 放大倍數(shù)及二者比值Tab.3 Simulatedw, magnification M, and ratio w/M of 10 μm-radius microsphere based imaging system for different positions of the point source

表1～表3 的結果表明, 隨著點光源和微球之間距離d的增加, 成像圖樣寬度w隨之增大, 在圖6中也有較為直觀的體現(xiàn), 放大倍數(shù)M隨d的增大而增大。 以半徑為5 μm的微球為例, 隨著點光源與微球之間的距離d從5 nm增加至1 000 nm,w從0.67 μm增加至1.75 μm, 同時, 其成像放大倍數(shù)M從3增加至4.84, 這與幾何光學的透鏡成像規(guī)律具有相似性。 隨著d的增加, 半徑為7.5 μm和10 μm微球的w和M也具有同樣的變化趨勢。 對w/M進行計算, 可以對分辨能力的變化趨勢進行分析, 當點光源和微球的距離從5 nm增加至1 000 nm時, 半徑為5 μm微球的w/M從0.37λ增大至0.60λ, 半徑為7.5 μm微球的w/M從0.5λ增大至0.62λ, 半徑為10 μm微球的w/M從0.52λ增大至0.63λ。 通過w/M的變化趨勢對分辨能力進行分析可知, 當間距小于800 nm時, 分辨能力隨著點光源和微球距離的增加有明顯的下降趨勢。 當間距增大至800 nm～1 000 nm時, 其成像倍數(shù)仍然在增大, 但是分辨能力并沒有明顯的下降, 這一結果與Martí Duocastella[14]提出的“空放大效應”一致。

分析微球分辨能力隨間距d的增大而下降的原因, 本文認為, 根據(jù)Abbe的成像理論, 物平面的光場分布是由不同空間頻率信息線性組合而成的, 可以將在空間中傳播的波表示為

E=Aexp(ikr)=

Aexp[i(xkx+yky+zkz)]=

Aexp[i(xkx+yky)]*exp(izkz),

(8)

微球成像過程中倏逝波被耦合進微球并轉換成微球內(nèi)的傳輸波, 從而散射至遠場參與成像[15]。 而隨著微球和點光源距離的增加, 倏逝波不斷衰減, 微球可以收集到的高頻信息也隨之減少, 因此, 成像分辨能力也隨之降低。 當距離增大至800 nm時, 倏逝波衰減趨于0而無法被耦合進微球, 因此, 此時距離繼續(xù)增大, 其分辨能力沒有明顯變化。

3 結 論

本文設計了微球對點光源成像的仿真模型, 并對微球的成像分辨能力進行了分析。 結果表明, 微球尺寸的增加以及微球和點光源距離的增加, 都會使分辨能力下降, 并根據(jù)微球通過耦合近場倏逝波提高成像分辨能力的理論對結果進行了合理的解釋。 仿真結果對基于微球透鏡的成像實驗具有指導意義: 為了提高成像分辨能力, 在實驗條件允許的情況下, 可以選擇小尺寸微球; 當需要抬高并控制微球位置從而對樣品不同區(qū)域進行成像時, 仿真結果表明, 成像分辨能力將隨著微球和樣品距離的增加而下降, 因此, 在實驗中應當小幅度準確地調(diào)控距離, 使樣品與微球間距離小于800 nm, 以獲得更好的成像效果和更高的分辨能力。 本文提出的微球成像仿真分析方法也對今后開展微球成像分辨能力的相關仿真分析工作提供了方法基礎。