陳 明,閆曉明,王海艷,尚國旗, 李蓮花, 程楚楚,陳 瑤,張佩青

(1黑龍江省中醫(yī)藥科學院·黑龍江 哈爾濱 150036;2黑龍江省中醫(yī)藥科學院研究生·黑龍江 哈爾濱 150036)

IgA腎病(IgAN)是原發(fā)性腎小球疾病中最常見的一種,在我國占原發(fā)性腎小球疾病患者的39.6%～44.6%[1]。多以反復發(fā)作的肉眼血尿或鏡下血尿為主要癥狀,病理表現(xiàn)為以IgA為主的免疫復合物沉積在腎小球系膜區(qū),伴系膜增生等。20～25年30%～40% 的IgA腎病患者進展至終末期腎病(ESRD)[2]。IgAN發(fā)病機制可能與多重免疫打擊有關(guān),包括半乳糖缺陷型IgA1(Gd-IgA1)的形成,抗Gd-IgA1的自身抗體合成;循環(huán)免疫復合物形成,并在腎小球系膜中沉積,引發(fā)腎損傷,導致IgAN的發(fā)生和發(fā)展[3]。越來越多的證據(jù)證明黏膜受到細菌及病毒等感染導致B細胞活化因子(BAFF)及增殖誘導配體(APRIL)表達上調(diào),其直接誘導產(chǎn)生更多Gd-IgA1;或通過Toll樣受體(TLRs)和BAFF、APRIL信號傳遞引起IgA異常增多在IgAN的發(fā)生、進展中來發(fā)揮至關(guān)重要作用[4]。另外有證據(jù)表明BAFF可抑制核心1β1,3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶伴侶蛋白(Cosmc)表達,進而影響IgA1鉸鏈區(qū)O-糖基化,最終形成大量Gd-IgA1[5]。

全國名中醫(yī)張佩青教授認為IgAN病位在肺、脾、腎三臟,并以三臟三腑(肺-大腸、脾-胃、腎-膀胱)為病機核心,結(jié)合IgAN發(fā)病核心機制(黏膜免疫異常引起Gd-IgA1異常增多),提出“三臟三腑-黏膜軸”理論[6],以補益肺、脾、腎三臟,兼以清熱涼血止血、活血化瘀為治則,擬方腎炎止血丸。前期研究已證實腎炎止血丸能改善IgAN患者臨床癥狀,減少尿紅細胞及尿蛋白,降低血肌酐及尿素氮,提高內(nèi)生肌酐清除率,減少血IgA含量[7],減少IgA在腎小球系膜區(qū)的沉積[8],減輕腎損傷;降低白介素6(IL-6)、核因子κB(NF-κB)的表達[9-10]。本文通過動物實驗基于TLR4介導BAFF/APRIL通路進一步探討腎炎止血丸的作用機制,為腎炎止血丸治療IgAN提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗藥物 腎炎止血丸:黑龍江省中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供,批號:170903,規(guī)格:0.04 g/粒,主要組成藥味:黃芪、黨參、熟地、茅根、側(cè)柏葉、旱蓮草、小薊、地榆、蒲黃、赤芍、生地、大黃炭、阿膠。氯沙坦鉀片(陽性對照):杭州默沙東制藥有限公司,批號:H20000371,規(guī)格:50 mg/片。

1.2 實驗動物 健康雄性SPF級SD大鼠48只,鼠齡8周,體質(zhì)量(200±10)g,購自哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部,動物許可證號:SCXK(黑)2019-001。微生物控制等級:一級。經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學院實驗動物管理委員會批準。

1.3 主要試劑 尿蛋白試劑盒:上海執(zhí)誠生物技術(shù)有限公司;TLR4、NF-κB、BAFF、APRIL、Cosmc、Gd-IgA1、IL-6 ELISA試劑盒:江蘇酶免實業(yè)有限公司;蘇木素-伊紅染液: 國藥集團化學試劑有限公司;蘇木素染液:江蘇艾迪生生物科技有限公司。IgA、C3熒光抗體:英國Abcam公司。

1.4 主要儀器 325型酶標儀:芬蘭Labsystems Multiskan MS 公司;AU480全自動生化儀:貝克曼庫爾特有限公司;CX-33光學顯微鏡:奧林巴斯株式會社;邁瑞B(yǎng)S400全自動生化分析儀:中國邁瑞醫(yī)療器械有限公司;NIKON ECLIPSE CI正置光學顯微鏡:日本尼康株式會社;NIKON DS-U3成像系統(tǒng):日本尼康株式會社。

2 方法

2.1 動物分組、造模及給藥 48 只大鼠完全隨機分組法分為正常對照組、模型組、腎炎止血丸高劑量組、中劑量組、低劑量組、陽性(氯沙坦鉀片)組,每組8 只。除正常對照組外,其余各組大鼠采取牛血清白蛋白(BSA)、皮下注射四氯化碳(CCl4)、靜脈注射脂多糖(LPS)聯(lián)合造模方法制備IgAN模型[11];從實驗第1天開始以BSA 400 mg/kg(配成水溶液2 mL)隔日灌胃,持續(xù)6 周,蓖麻油0.5 mL+CCl40.1 mL皮下注射,每周1次,持續(xù)9 周,第6、8周LPS 0.05 mg尾靜脈注射,造模時間為10周;正常對照組:隔日灌服0.1%稀鹽酸配制酸化水,每次2 mL,持續(xù)6周;生理鹽水0.6 mL皮下注射,每周1次,持續(xù)9周;于第6、8周0.2 mL生理鹽水尾靜脈注射。實驗第10周末各組大鼠開始給藥,腎炎止血丸高、中、低劑量組分別按3.6、1.8、0.9 g/(kg·d)灌胃,陽性組予氯沙坦鉀(科索亞) 20 mg/(kg·d)灌胃,連續(xù)灌胃給藥6 周;正常組和模型組予等量蒸餾水灌胃。

2.2 觀察指標及檢測方法

2.2.1 尿紅細胞計數(shù)、尿白蛋白檢測 給藥6周末收集各組大鼠24 h尿液(此期間禁食不禁水),離心后留取上清液;采用尿沉渣計數(shù)法檢測尿紅細胞個數(shù),采用雙縮脲比色法檢測24 h尿蛋白定量。

2.2.2 血清TLR4、NF-κB、BAFF、APRIL、Cosmc、Gd-IgA1、IL-6水平測定 末次給藥后禁食不禁水12 h,用1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠,腹主動脈采血,3 000 r/min離心10 min,離心半徑10 cm,留取血清;按試劑盒說明書步驟,采用ELISA法檢測血清TLR4、NF-κB、BAFF、APRIL、Cosmc、Gd-IgA1、IL-6含量。

2.2.3 腎組織病理變化觀察 1%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射,處死大鼠,取左腎組織,4%多聚甲醛固定,乙醇脫水、透明、浸蠟后,石蠟包埋并切片,HE、Masson、PAS染色,鏡下觀察腎小球、腎小管的形態(tài)、大小,腎小球內(nèi)細胞數(shù),系膜區(qū)有無免疫復合物沉積以及腎小管間質(zhì)損害程度、纖維化程度,膠原纖維等并拍照。

2.2.4 腎組織IgA、C3表達檢測 直接免疫熒光法。取右腎組織4%多聚甲醛固定,制備組織切片;滴加FITC標記的IgA、C3熒光抗體,4 ℃避光過夜;滴加抗熒光淬滅劑,中性樹膠封片;在熒光顯微鏡下觀察IgA、C3在腎組織的沉淀情況并拍攝。應用Image-pro plus 6.0軟件分析得出每張照片陽性的累積光密度值(IOD)。

3 結(jié)果

3.1 腎炎止血丸對 IgAN大鼠血尿、蛋白尿的影響 見表1。

表1 各組大鼠尿紅細胞計數(shù)、尿蛋白比較

3.2 腎炎止血丸對IgAN大鼠血清TLR4、NF-κB、BAFF、APRIL、Cosmc、Gd-IgA1、IL-6的影響 見表2。

表2 各組大鼠血清TLR4、NF-κB、BAFF、APRIL、Cosmc、Gd-IgA1、IL-6含量比較

3.3 腎炎止血丸對IgAN大鼠腎臟病理變化的影響 HE、Masson、PAS染色結(jié)果顯示:正常組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)完整,囊腔大小正常,血管袢結(jié)構(gòu)清晰;腎小管結(jié)構(gòu)完整,未見明顯水腫,近曲小管及遠曲小管上皮細胞排列有序,刷狀緣結(jié)構(gòu)正常。模型組系膜中、重度細胞增生及基質(zhì)增多,腎小球可見大量炎癥細胞浸潤;腎小球內(nèi)可見個別中性粒細胞。低劑量組腎間質(zhì)見少量炎細胞浸潤;腎小球結(jié)構(gòu)基本完整,血管袢結(jié)構(gòu)清晰,腎小球囊腔大小正常,組織中未見明顯出血。中劑量組腎小球結(jié)構(gòu)基本完整,血管袢清晰,腎小球囊腔大小結(jié)構(gòu)正常;腎小管未見明顯水腫,近曲及遠曲小管上皮細胞排列正常,刷狀緣結(jié)構(gòu)正常。高劑量組腎小球結(jié)構(gòu)完整,腎小球囊腔大小正常。陽性組腎小球視野中見個別腎小管上皮細胞脫落;腎小球血管袢結(jié)構(gòu)清晰,組織未見明顯炎癥細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理變化(A.HE染色,×200;B.Masson染色,×200;C.PAS染色,×200)

3.4 腎炎止血丸對IgAN大鼠腎組織IgA、C3表達的影響 模型組可見IgA沿腎小球系膜區(qū)呈團塊或顆粒狀彌漫沉積,合并C3沉積,與IgA分布基本一致;腎炎止血丸低、中、高劑量組及陽性組IgA、C3少量沿腎小球系膜區(qū)團塊及顆粒樣沉積。IgA、C3的免疫熒光累積光密度值(IOD)見表3。

表3 各組大鼠腎組織IgA、C3表達的比較

4 討論

目前IgAN發(fā)病機制雖然尚未完全清楚,但越來越多的證據(jù)提示Gd-IgA1是IgAN發(fā)生發(fā)展始發(fā)及驅(qū)動的關(guān)鍵因素。自20世紀70年代以來,人們就認識到IgAN與黏膜之間的聯(lián)系。黏膜免疫系統(tǒng)感染引起 IgA異常分泌為 IgAN 的發(fā)生提供原動力[12]。臨床中多見呼吸道、胃腸道或泌尿道等黏膜部位感染出現(xiàn)在IgAN發(fā)病前[13],在黏膜感染過程中多出現(xiàn)血尿、蛋白尿[14],由此可見黏膜免疫系統(tǒng)的失?？赡苁荌gAN發(fā)病的關(guān)鍵因素。研究表明IgAN的發(fā)病與黏膜感染引發(fā)的樹突狀細胞活化,導致B細胞活化Gd-IgA1增加密切相關(guān)[15]。B細胞成熟的兩個關(guān)鍵因子APRIL和BAFF在 IgAN中的作用也逐漸明確[16],抗原刺激后BAFF、APRIL上調(diào),B細胞增殖,啟動免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換(CSR),刺激幼稚B細胞轉(zhuǎn)化為分泌IgA或IgG的漿細胞[17]。也有證據(jù)表明在IgAN患者扁桃體生發(fā)中心存在BAFF、APRIL異常表達的B細胞[18-19]。體外培養(yǎng)也證實外源性APRIL刺激IgAN患者淋巴細胞產(chǎn)生更多Gd-IgA1,并伴隨B細胞成熟抗原(BCMA)和跨膜蛋白活化物及親環(huán)蛋白配體相互作用分子(TACI)表達上調(diào)[20]。

TLRs是特有識別入侵微生物的細胞因子之一,參與非特異性免疫的重要蛋白分子,促進IgA的類別轉(zhuǎn)換,并作為BAFF受體的跨膜激活劑和鈣調(diào)親環(huán)素配體相互作用分子發(fā)揮作用[21]。研究表明,當黏膜屏障受到外源致病微生物侵犯損傷時,抗原觸發(fā)TLRs,呈遞細胞活化并釋放炎癥因子。包括白介素(IL-6和IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子-β、BAFF、APRIL等觸發(fā)B細胞形成Gd-IgA1[22-24]。也有研究發(fā)現(xiàn)炎癥(TLR4、NF-κB)信號轉(zhuǎn)導與BAFF介導的炎癥介質(zhì)表達密切相關(guān)[25-26]。也有一些特異性的細菌可通過細胞壁的脂多糖誘導TLR4進而使Cosmc甲基化水平升高進一步導致Gd-IgA1產(chǎn)生[27]。

全國名中醫(yī)張佩青教授認為IgAN病因多因邪毒入侵、飲食不宜、稟賦不足,致正邪交爭,邪盛正衰則肺、脾、腎三臟功能虛衰,肺氣虛則衛(wèi)氣不固,脾虛則統(tǒng)攝失調(diào),腎虛失于封藏,精血及精微物質(zhì)下泄表現(xiàn)為血尿或蛋白尿;外邪(風熱居多)侵襲、濕、毒、熱內(nèi)蘊,熱傷血絡而妄行,久病入絡,血脈瘀阻,久必生虛熱,虛實夾雜而遷延難愈。腎炎止血丸是張佩青教授以調(diào)補腎臟、固護氣陰、扶正治本,兼以清熱活血、祛邪治標為基本原則而成的經(jīng)驗方。

本研究結(jié)果證明了腎炎止血丸(高劑量組作用更加明顯)能夠降低Gd-IgA1的表達,其治療IgAN的機制可能通過抑制TLR4、NF-κB、IL-6炎癥通路減少B細胞關(guān)鍵因子(BAFF、APRIL)表達,進而上調(diào)Cosmc蛋白調(diào)控Gd-IgA1通路。腎炎止血丸能明顯減少腎組織IgA、C3的沉積,減輕腎臟病理損傷,有效減少尿蛋白流失及尿紅細胞計數(shù)。

綜上所述,腎炎止血丸通過抑制TLR4/BAFF/APRIL通路減少Gd-IgA1生成,改善IgAN大鼠蛋白尿、血尿及腎組織病理損傷,從而延緩IgAN進展。