薛丕良,李星宇,王向偉,王文文,莊 巖

(黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院·黑龍江 哈爾濱 150036)

膜性腎病(membranous nephropathy,MN)是以腎小球基底膜上皮細(xì)胞下彌漫的免疫復(fù)合物沉積伴基底膜彌漫增厚為主要病理表現(xiàn),以腎病綜合征或無癥狀性蛋白尿?yàn)橹饕憩F(xiàn)的慢性腎臟疾病。研究表明,足細(xì)胞凋亡在MN發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用,足細(xì)胞的損傷或凋亡是MN及蛋白尿發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[1-3],因此,預(yù)防和治療膜性腎病,抑制足細(xì)胞凋亡可能是其關(guān)鍵手段之一[4]。隨著激素和免疫抑制劑臨床嚴(yán)重不良反應(yīng)的增多[5],中藥治療膜性腎病逐漸得到認(rèn)可和應(yīng)用[6]。參芪蛭龍湯是黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院治療MN的有效處方[7-8]。本研究擬建立膜性腎病小鼠模型,探討參芪蛭龍湯對膜性腎病小鼠腎臟的保護(hù)作用及其對Bcl-2、Bax、Caspase-3信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 參芪蛭龍湯組方中藥(黨參、黃芪、當(dāng)歸、川芎、水蛭、地龍、僵蠶、虎杖等)飲片均由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院提供,經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院田明教授鑒定均為真品;以上藥味,加10倍量水(約1 800 mL)浸泡1 h,煎煮1 h后,濾過,藥渣再加10 倍量水(約1 800 mL),煎煮1 h,濾過,合并2 次濾液,濃縮至1.2 g/mL(按生藥總量計(jì)),分裝后,-80 ℃冰箱凍存。雷公藤多苷片:湖南千金協(xié)力有限公司,批號:1901113B,規(guī)格:10 mg/片。

1.3 試劑 陽離子牛血清白蛋白(c-BSA):美國Chondrex公司;ECL發(fā)光液:沈陽萬類生物科技有限公司;TRIpure:北京百泰克生物技術(shù)有限公司;BeyoRT II M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶:上海碧云天生物技術(shù)有限公司;RNase inhibitor:北京百泰克生物技術(shù)有限公司;2×Taq PCR MasterMix:北京索萊寶科技有限公司;SYBR Green:北京索萊寶科技有限公司。一抗(Caspase-3、Bax、Bcl-2):沈陽萬類生物科技有限公司;二抗羊抗兔IgG-HRP:沈陽萬類生物科技有限公司;過碘酸-雪芙(PAS)染色試劑盒:上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器 H-2050R超速冷凍離心機(jī):湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;ELX-800酶標(biāo)儀:美國BIOTEK;Exicycler 96熒光定量PCR儀:韓國BIONEER;DYY-7C型電泳儀:北京市六一儀器廠;IX53顯微鏡:日本OLYMPUS。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 動物造模、分組及給藥 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,將160 mgC-BSA凍干粉溶于30 mLPBS磷酸緩沖液中,與等量的不完全弗氏佐劑混合后,超聲使其完全乳化。在小鼠腋窩和腹股溝區(qū)域內(nèi)的6處進(jìn)行皮下注射,每處皮下注射量不超過0.05 mL,每只0.3 mL[9]。預(yù)免疫1 周后,對造模小鼠尾靜脈注射乳化液,注射量為16 mg/kg,每周注射3 次。在6 周內(nèi)將注射量逐漸增加至25 mg/kg。于造模第3周,測定小鼠24 h尿蛋白定量(UTP),若超過20 mg即為造模成功。

將造模成功的小鼠40只按體質(zhì)量隨機(jī)分為模型組,參芪蛭龍湯高劑量(24 g/kg,成人臨床等效劑量0.5 倍,按體表面積法換算而得)、低劑量組(12 g/kg,成人臨床等效劑量的0.25倍),雷公藤多苷片組(陽對組)(14 mg/kg),每組10只,另取10只未造模的小鼠作為正常組。正常對照組和模型對照組小鼠灌胃等體積生理鹽水,各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥物10 mL/kg,每日1 次,連續(xù)給藥4 周后處死小鼠。

1.5.2 觀察指標(biāo)及測定

1.5.2.1 腎臟病理學(xué)觀察

七哥不帥，但五官很立體，皮膚微黑，不多言。搞戶外的沒有小白臉，肌肉線條不用說，讓女生見了就忍不住流口水。

HE 染色:取小鼠腎組織放置于組織包埋盒中,福爾馬林固定,石蠟包埋后制成4 μm切片,蘇木素、伊紅染色,封片。在光學(xué)顯微鏡200 倍視野下觀察各組病理變化。

Masson 染色:切片脫蠟入水,蘇木精染液5 min,充分水洗后1%鹽酸乙醇分化,經(jīng)麗春紅染色5 min,2%冰醋酸水溶液浸洗1 min,沖洗后滴加1 %磷鉬酸溶液分化5 min, 隨后用苯胺藍(lán)液復(fù)染5 min,再用2%冰醋酸處理1 min,之后脫水、透化、中性樹膠封片固定,顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

PAS染色:石蠟切片常規(guī)脫蠟后蒸餾水洗滌,過碘酸溶液平衡至室溫后滴加100 μL,在濕盒中避光反應(yīng)10 min后,去除過碘酸溶液,蒸餾水中洗滌5 min。滴加100 μLSchiff試劑,放入濕盒中,置于37 ℃烘箱避光染色1 h。去除染色液,蒸餾水中洗滌5 min。滴加100 μL蘇木素染色液,染色30 s。去除染色液,蒸餾水漂洗兩次以上,每次3 s,直到浮色洗去。使用鹽酸乙醇分化液分化30 s,自來水返藍(lán)5 min。中性樹膠封片,顯微鏡下觀察和拍照。

1.5.2.2 RT-PCR檢測腎組織Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA表達(dá)

腎組織加入TRIpure裂解液、氯仿、異丙醇等提取樣本總RNA。酶標(biāo)儀檢測RNA濃度稀釋至100 mg/L。

反轉(zhuǎn)錄得到對應(yīng)的cDNA后進(jìn)行實(shí)時熒光定量分析,反應(yīng)體系為1 μLcDNA模板,上下游引物(10 μmol/L) 各0.5 μL,10 μLSYBR GREEN mastermix,用ddH2O補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增條件為94 ℃、5 min,94 ℃、10 s,60 ℃、20 s,72 ℃、30 s,40 個循環(huán); 溶解曲線分析94 ℃、10 s,臺階采樣,臺階溫度0.5 ℃。引物序列見表 1。結(jié)果采用 2-△△ CT方法進(jìn)行分析。

表1 實(shí)時熒光定量PCR引物

1.5.2.3 Western-blot檢測腎組織Caspase3、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

將小鼠腎組織用裂解液裂解后,離心取上清后進(jìn)行蛋白定量,上樣量為40 μg。制備聚丙烯酰胺凝膠,5 %的濃縮膠,10 %～12 %的分離膠。轉(zhuǎn)膜后,脫脂奶粉封閉,1∶(500～1000)稀釋一抗,4 ℃過夜,二抗避光孵育2 h,ECL化學(xué)發(fā)光。將PVDF膜進(jìn)行掃描,用凝膠成像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值,以各組光密度與空白組光密度的比值計(jì)算蛋白相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用 SPSS 26 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,單因素方差分析方法分析多組間差異,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腎組織病理學(xué)變化

HE染色可見正常組小鼠腎小球結(jié)構(gòu)完整,模型組小鼠腎小球體積增大,腎小球毛細(xì)血管袢擴(kuò)張,血細(xì)胞溢出,空泡、變性等,腎小球系膜增厚,局部腎小囊腔壁上皮嚴(yán)重破損。與模型組比較,參芪蛭龍湯高劑量組腎小球體積減小,僅有炎性細(xì)胞浸潤減少。Masson 染色可見藍(lán)色膠原纖維組織,與模型組比較,各給藥組可見腎小球體積有所減小,基底膜增厚及組織纖維化有所減輕。PAS染色發(fā)現(xiàn),模型組小鼠基底膜增厚明顯,皺縮,出現(xiàn)釘突樣及空泡狀改變,各給藥組基底膜病變狀態(tài)較模型組顯著減輕,參芪蛭龍湯高劑量組并未出現(xiàn)明顯基底膜增厚等改變。見圖1。

圖1 各組小鼠腎組織病理變化(20×)

2.2 各組小鼠腎組織Bcl-2、Bax、Caspase3 mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測結(jié)果 見表2。

表2 各組小鼠腎組織Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá)的比較

2.3 各組小鼠腎組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)的Western-blot檢測結(jié)果 見圖2,表3。

注:A.模型組;B.正常組;C.參芪高劑量組;D.參芪低劑量組;E.雷公藤組圖2 各組小鼠腎組織Bcl-2、Bax、Caspase3蛋白表達(dá)的Western blot 檢測結(jié)果

表3 各組小鼠腎組織Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量比較

3 討論

膜性腎病在古代中醫(yī)典籍未有相關(guān)的論述,根據(jù)其具有水腫、大量蛋白尿的臨床特征,可將其歸屬于中醫(yī)“水腫”“尿濁”范疇。目前大多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為正氣不足是膜性腎病的基本病機(jī),屬本虛標(biāo)實(shí)證;以氣(陽)虧虛為主,主要累及腎、脾兩臟,與肺、肝相關(guān),水濕、濕熱、瘀血等在病機(jī)演變過程中既是病理產(chǎn)物,又是病情加重、纏錦難愈的重要因素。以脾腎虧虛為本,濕濁瘀血為標(biāo)。

參芪蛭龍湯是本院治療膜性腎病的經(jīng)驗(yàn)方,方中以黨參、黃芪、淫羊藿為君藥,其中黃芪補(bǔ)氣升陽、利水消腫,適用于氣虛失運(yùn)、水濕停聚引起的肢體面目浮腫、小便不利;黨參補(bǔ)中益氣,為脾胃氣虛之要藥;淫羊藿補(bǔ)益腎陽、鼓舞腎氣;當(dāng)歸、川芎、水蛭、地龍、僵蠶為臣藥,其中當(dāng)歸、川芎活血化瘀;水蛭、地龍、僵蠶蟲類藥入絡(luò)、化瘀消癥;虎杖、鳳尾草活血化瘀、利水消腫為佐藥。全方共奏補(bǔ)益脾腎、化瘀利濕之效。

腎小球?yàn)V過膜主要由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球基膜和臟層上皮細(xì)胞組成。臟層上皮細(xì)胞又稱足細(xì)胞,是腎小球?yàn)V過膜的最后一道防線。足細(xì)胞的損傷程度及數(shù)量變化直接導(dǎo)致腎小球?yàn)V過功能不可逆性的受損,是膜性腎病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素,因而抑制足細(xì)胞的凋亡,保護(hù)足細(xì)胞數(shù)量及結(jié)構(gòu)正常是治療膜性腎病的關(guān)鍵[10-13]。研究表明,Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶,Caspase-3激活后將啟動細(xì)胞凋亡[14];抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax 同屬于Bcl-2家族,二者可形成更加穩(wěn)固的Bax-Bcl-2異源二聚體抑制細(xì)胞凋亡[15],Bcl-2/Bax比值是衡量細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo),可決定Caspase-3激活狀況和細(xì)胞凋亡的嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)顯示,經(jīng)參芪蛭龍湯治療的MN小鼠腎組織Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)比模型組下降顯著,Bcl-2蛋白表達(dá)比模型組升高顯著,提示凋亡減少。表明參芪蛭龍湯抑制MN小鼠鼠腎臟足細(xì)胞凋亡可能與調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax、Caspase-3信號通路有關(guān)。

因此,參芪蛭龍湯可明顯改善MN小鼠腎組織的病理狀態(tài),Bcl-2、Bax、Caspase-3信號通路可能是參芪蛭龍湯改善膜性腎病小鼠腎組織細(xì)胞凋亡的作用靶點(diǎn)。