王曉衛(wèi),趙佳麗,徐海虹,尚 韜

(1浙江省臨海市中醫(yī)院醫(yī)療衛(wèi)生服務共同體·浙江 臺州 317000;2 浙江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院,浙江省中醫(yī)院·浙江 杭州 310018)

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)屬于臨床常見惡性腫瘤,每年發(fā)病率及死亡率逐步上升,目前臨床治療多采用化療,不僅會使機體產生耐藥性還會降低患者的依從性[1]。研究證實,中草藥在抗炎及治療腫瘤方面發(fā)揮了重要的作用,其中甘草提取物在治療腫瘤及腸道相關疾病中療效更為顯著[2-3]。

鐵死亡體現為細胞產生了鐵依賴性的ROS聚集現象以及細胞和亞細胞層面上的形態(tài)學變化[4]。有關鐵死亡的研究發(fā)現,鐵死亡進程與體內的多種癌癥疾病相關,不僅可以抑制肝癌、前列腺癌、乳腺癌,還能夠減緩其他癌癥的進程[5]。前期研究發(fā)現鐵死亡能夠抑制CRC細胞增殖[6-7]?；诖?本實驗探討了甘草水提物(Licorice extract,LE)聯(lián)合鐵死亡誘導劑Erastin對CRC荷瘤裸鼠體內鐵死亡的影響。

1 實驗材料及方法

1.1 實驗藥物 甘草水提物(Licorice extract,LE)制備:甘草粉25 g,將其溶于400 mL沸水中,并不斷攪拌使其完全溶解,濾紙過濾并取濾液離心,離心所得上清液即為LE,置于冰箱中留待后續(xù)實驗用。Erastin:上海源葉生物科技有限公司,ACS號:571203-78-6,規(guī)格5 mg, 98%。

1.2 實驗動物及細胞 18只SPF級雌性BALB/c裸鼠,6 周齡,體質量(20±2) g,購于上海斯萊克動物實驗有限公司,實驗動物生產許可證號:SCXK(滬)2017-0005,飼養(yǎng)于無特定病原微生物體的實驗環(huán)境中。CACO2細胞(iCell-h032):賽百慷(上海)生物技術股份有限公司。

1.3 實驗試劑及儀器 xCT Antibody、Ki67 Antibody、Anti-SLC7A11 antibody、Anti-GAPDH antibody、Anti-DPP4 antibody、Anti-NOX 1 antibody:Affnity;山羊抗兔IgG H&L (HRP)預吸附二抗:Abcam;細胞丙二醛(MDA)測定試劑盒、還原型谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒:南京建成生物工程研究所有限公司。Nikon Eclipse E100光學顯微鏡:日本尼康公司;CMaxPlus酶標儀:美國MD公司;低溫高速離心機:美國賽默飛公司;化學發(fā)光儀:上海勤翔公司。

1.4 細胞培養(yǎng) CACO2細胞(iCell-h032)在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),并加入10%FBS、1%NEAA、1%青霉素和鏈霉素溶液,環(huán)境條件為37 ℃含5% CO2。

1.5 異種移植瘤動物模型制備 模型制備參照博慶麗[10]等報道,小鼠接種CACO2細胞(4×106),用于體內致瘤。待瘤體積長到100 mm3開始分組給藥。

1.6 實驗分組 造模后小鼠隨機分組,模型組:灌胃及腹腔注射同體積生理鹽水;LE組:灌胃2 mg/kg LE;LE+Erastin組:灌胃2 mg/kg LE,并腹腔注射30 mg/kg Erastin,每組6 只。給藥4 周。

1.7 觀察指標

1.7.1 腫瘤體積和重量 末次給藥12 h,安樂死處死小鼠并剝離腫瘤組織,測量腫瘤體積并稱重。

1.7.2 病理學觀察 取腫瘤組織固定后切片,行常規(guī)石蠟包埋后進行HE染色,觀察腫瘤組織病理變化。

1.7.3 腫瘤組織MDA和GSH含量的檢測 ELISA法檢測腫瘤組織MDA和GSH含量。

1.7.4 腫瘤組織Ki-67和SLC7A11 表達的免疫組化檢測 石蠟切片脫蠟至水,加入阻斷內源性過氧化物酶后用一抗(xCT Antibody、Ki67 Antibody)、二抗(山羊抗兔IgG H&L (HRP)預吸附二抗)孵育,DAB顯色后用蘇木精復染細胞核。鏡檢觀察,藍色為細胞核,抗原陽性表達呈棕黃色至褐色;Image J計算平均光密度值。

1.7.5 腫瘤組織SLC7A11、DPP4和NOX1蛋白表達的 Western blot檢測 制備瘤組織蛋白樣品,進行凝膠電泳并轉移到PVDF膜,加入一抗(Anti-SLC7A11 antibody、Anti-GAPDH antibody、Anti-DPP4 antibody、Anti-NOX 1 antibody)、二抗(山羊抗兔IgG H&L (HRP)預吸附二抗)進行封閉劑抗原反應,孵育結束后顯影并拍攝圖像。

2 結果

2.1 各組小鼠腫瘤體積、重量比較 見表1。

表1 各組小鼠腫瘤體積、重量比較

2.2 各組小鼠腫瘤組織 HE染色結果 模型組小鼠腫瘤組織無變化。LE組腫瘤細胞周圍有大量的淋巴細胞和白細胞浸潤,瘤組織結構破壞,部分細胞固縮成為孤立的細胞,可見大量壞死細胞。LE+Erastin組異型細胞減少,病理損傷程度更嚴重。見圖1。

圖1 各組小鼠腫瘤組織病理學改變(HE,×400)

2.3 各組小鼠腫瘤組織MDA含量和GSH活性測定結果 見表2。

表2 各組小鼠腫瘤組織MDA、GSH比較

2.4 各組小鼠腫瘤組織Ki-67和SLC7A11 表達免疫組化檢測結果 見圖2。

注:與模型組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與LE組比較,*P<0.05,**P<0.01圖2 各組小鼠腫瘤組織Ki-67和SLC7A11 表達的免疫組化檢測結果(× 400)

與模型組比較,LE 組與LE+Erastin組小鼠腫瘤組織SLC7A11及Ki-67的表達顯著減弱(P<0.05或P<0.01);與LE組比較,LE+Erastin組小鼠腫瘤組織中SLC7A11的表達顯著減弱(P<0.01)。

2.5 各組腫瘤組織SLC7A11、DPP4和NOX1蛋白表達的Western Blot 檢測結果 見圖3。

注:與模型組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01;與LE組比較,*P<0.05圖3 各組小鼠腫瘤組織SLC7A11、DPP4和NOX1蛋白的表達的Western blot檢測結果比較

與模型組比較,LE組和LE+Erastin組瘤組織DPP4蛋白表達水平顯著升高(P<0.05和P<0.01),SLC7A11、NOX1蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05或P<0.01);與LE組比較,LE+Erastin組瘤組織中SLC7A11、NOX1蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)。

3 討論

CRC具有惡性程度高、易轉移等特點,臨床治療效果不佳且易反復,給患者帶來嚴重的心理壓力及身體負擔,因此尋找安全有效的治療藥物已經成為研究的重點。研究表明,甘草及其提取物能夠通過多基因、多靶點等途徑發(fā)揮抗CRC的作用[11]。甘草屬于豆科植物,最早記載于《神農本草經》,具有清熱解毒、補脾益氣、緩急止痛等功效[12]。徐上云[13]實驗結果顯示,用甘草酸處理人結腸癌細胞后,細胞的增殖、遷移及相關信號通路蛋白均受到抑制,表明甘草提取物具有抗結直腸癌作用。

裸鼠皮下移植瘤能夠更好地觀測腫瘤的生長情況、評估抑瘤效果。本文通過對裸鼠皮下注射CRC細胞建立皮下移植瘤模型。本文研究結果顯示,LE組和LE+Erastin組小鼠腫瘤體積及瘤重均顯著降低,表明LE能夠顯著抑制腫瘤的增殖,加入鐵死亡誘導劑后表現出進一步的抑制腫瘤生長趨勢,表明鐵死亡可以發(fā)揮抑瘤作用,且LE與Erastin聯(lián)合的效果更顯著。通過HE染色結果可見,除模型組外,兩給藥組細胞均表現出炎性細胞浸潤及結構破壞,其中LE組瘤組織結構破壞,部分細胞固縮成為孤立的細胞,壞死細胞增多;LE+Erastin組異型細胞減少,病理損傷程度更嚴重。由此可見LE及LE聯(lián)合Erastin能夠較大程度的破壞腫瘤細胞結構,造成腫瘤細胞壞死。

Erastin屬于經典的鐵死亡誘導劑,能夠通過抑制System XC-活性,進而阻斷細胞中GSH的合成,降低細胞的抗氧化能力,導致鐵死亡的發(fā)生[4]。MDA的大量產生標志著體內的脂質過氧化反應不斷增強,提示鐵死亡進程正向移動。本實驗中LE組、LE+Erastin組小鼠腫瘤組織中MDA含量升高而GSH含量降低,并且LE+Erastin組相較于LE組趨勢更明顯,提示兩組細胞鐵死亡均增強。

Fan Z[14]研究顯示SLC7A11能夠增強System XC-的轉運能力,從而減輕細胞的鐵死亡。Ki-67是惡性腫瘤增殖效率的反映指標,其高表達時也可作為細胞增殖活躍的標志[15]。NOX1是腸黏膜內催化氧自由基生成的重要催化酶,其表達量與腸黏膜氧化應激相關[16]。DPP4與多種底物和蛋白分子相互作用,其含量與鐵死亡呈正相關[17]。本文實驗結果顯示,LE 組與LE+Erastin組小鼠腫瘤組織SLC7A11、Ki-67 mRNA及SLC7A11、NOX1蛋白的表達顯著降低,而DPP4蛋白表達水平顯著升高;提示,LE可以促進腫瘤細胞發(fā)生鐵死亡,阻礙其增殖進程。

綜上所述,LE聯(lián)合Erastin能夠促進CRC細胞在裸鼠體內發(fā)生鐵死亡進而抑制腫瘤生長。