楊 敏,高文倉,龐德湘,張云超

(1浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院·浙江 杭州 310000;2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院·上海 200437)

肺癌是起源于支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤,死亡率在癌癥相關(guān)的死亡中位居第一,其5 年生存率為19.4%[1]。肺癌中有一部分具有自我更新能力的細胞亞群,被稱為肺癌干細胞(Lung Cancer Stem Cells, LCSC),可調(diào)控腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移,誘發(fā)對當前治療的耐藥。研究表明,LCSC的干性受多種分子調(diào)節(jié),如CD133、八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(OCT4)、SOX2等[2]。其中CD133,也稱為Prominin-1,是鑒定和分離LCSC的可靠標志物[3]。肺癌患者化療后其腫瘤組織中的CD133表達增加,從中分離的CD133+的腫瘤細胞亞群具有更高的致瘤性及耐藥性,并高表達AKT/PKB與BCL-2,促進腫瘤細胞存活[4]。OCT4與SOX2是重要的干性維持基因,在LCSC自我更新中起至關(guān)重要的作用[5-7]。LCSC通過自我更新能力進行腫瘤特征性的無限的增殖分裂,產(chǎn)生新生的LCSC或分化為具有特定耐藥表型的肺癌細胞,在臨床治療中,LCSC的自我更新能力是導(dǎo)致治療失敗的主要原因,因此,找到抑制LCSC自我更新的藥物具有重要意義[8]。

肺金生方由我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)典籍《金匱要略》中的經(jīng)典方“澤漆湯”結(jié)合現(xiàn)代藥理學(xué)實驗結(jié)果加減化裁得來,在臨床肺癌患者的治療中取得了較好的療效,其聯(lián)合化療可顯著改善患者咳嗽、氣急、痰中帶血等肺癌常見癥狀[9]。但其發(fā)揮抑制肺癌的作用是否與調(diào)控LCSC自我更新有關(guān)仍未可知。

Notch信號通路廣泛存在于各種細胞中,干細胞中主要負責(zé)調(diào)控細胞的自我更新和與其他細胞間通訊,與肺癌及多種腫瘤干細胞的發(fā)展密切相關(guān)。本研究使用肺金方對LCSC進行干預(yù),檢測其對LCSC自我更新能力的影響并探究其可能的作用機制,報道如下。

1 實驗材料與方法

1.1 細胞 人肺癌A549細胞系購于上海中國科學(xué)院細胞庫。

1.2 實驗藥物 肺金生方:將肺金生方(澤漆、生曬參、桂枝、制半夏、石見穿、白前、炒黃芩、露蜂房、制膽南星、生姜、甘草)藥液濃縮滅菌后定量分裝,制作成凍干粉,使用前用PBS溶解,0.22 μm 微孔濾膜過濾,根據(jù)前期實驗結(jié)果[10],制成1 g/L及2 g/L的中藥原液,-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器 DMEM /F12 培養(yǎng)基和胎牛血清:美國 Gibco;CD133抗體:美國 Cell Signaling Technology 公司;EGF、FGF-basic:美國peprotech公司;小鼠抗兔二抗:美國Santa cruz公司;RIPA蛋白裂解液、胰蛋白酶及PCR引物:上海生工生物工程股份有限公司;BCA蛋白定量試劑盒:中國賽默飛世爾有限公司;兔抗人/鼠CD133、兔抗人/鼠SOX2、兔抗人/鼠OCT4、兔抗人/鼠Notch1、兔抗人/鼠Jagged1、兔抗人/鼠GAPDH辣根過氧化酶標記單克隆抗體、辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG(二抗):美國Cell Signaling Technology公司。CO2恒溫孵育箱:法國Jouan公司;高速低溫離心機:美國SIGMA公司;超凈工作臺:北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠。

1.4 細胞培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基于25 cm2培養(yǎng)瓶中進行常規(guī)培養(yǎng),于CO2含量5%的37 ℃恒溫孵育箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。每2～3 d進行換液,待培養(yǎng)瓶中的細胞增殖至覆蓋培養(yǎng)瓶底部的80%～90%即對數(shù)生長期時,吸棄培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基,使用無Ca+、Mg+的PBS沖洗2 次,加入0.5 mL胰蛋白酶-EDTA分離細胞,按1∶3的比例進行常規(guī)傳代,代數(shù)不超過30,即含血清培養(yǎng)(serum containing medium, SCM)。

1.5 肺癌干細胞培養(yǎng) 將A549肺癌細胞0.5 mL胰蛋白酶-EDTA進行消化,使用不含Ca+、Mg+的PBS及無血清DMEM清洗后制成單細胞懸液,以1×103cells/孔接種于超低粘附6 孔板中,使用含20 mL/LB27,20 μg/L 重組人表皮生長因子(EGF)與20 μg/L 重組人酸性成纖維細胞生長因子(bFGF)的DMEM進行懸浮培養(yǎng),2～3 d更換培養(yǎng)基,即無血清培養(yǎng)(SFM)。定期于倒置顯微鏡下進行觀察,約2～3 周可見3D懸浮細胞球落形成,收集并離心,以1∶3的比例進行傳代用于后續(xù)實驗。

1.6 二次球落形成實驗 將收集的肺癌干細胞以2×103cells/孔接種于超低粘附6 孔板中,分別以不同濃度的肺金生方提取液進行干預(yù),7 d后收集細胞,再次以2×103個cells/孔接種于另一6 孔板中使用不同濃度肺金生方進行干預(yù),7～10 d后于顯微鏡下觀察,計算3D懸浮腫瘤球落形成數(shù)量并拍照記錄。

1.7 實時熒光定量PCR實驗 檢測CD133、OCT4、SOX2及Notch1,Jagged1 mRNA的表達 收集常規(guī)培養(yǎng)的A549細胞及不同濃度肺金生方干預(yù)后的肺癌干細胞,使用TRIzol法分別提取細胞總RNA,并進行檢測。PCR擴增條件:95 ℃ 預(yù)變性30 s;95 ℃ 預(yù)變性15 s;63 ℃ 退火60 s,每組設(shè)置3 個復(fù)孔。共40 個循環(huán)。以2△△Ct值表示目的基因的表達水平,檢測CD133、OCT4、SOX2、Notch1 及Jagged1的表達。

1.8 Western blot檢測CD133、SOX2、OCT4、Notch1、Jagged1蛋白的表達 收集A549細胞及不同濃度肺金生方干預(yù)后的肺癌干細胞,加入RIPA強裂解液,于冰上靜置裂解5 min,裂解結(jié)束后12 000 r/min 4 ℃離心15 min,使用BCA法測定蛋白濃度。計算后每組取等量蛋白樣品進行10% SDS-PAGE電泳,使用220 Ma恒流2 h將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。并使用5%的脫脂奶粉的TBST室溫下進行封閉1 h,清洗后分別使用不同抗體進行孵育,4 ℃過夜,室溫下使用ECL法顯色并拍照記錄。使用Image J對蛋白的灰度值進行分析,以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH灰度值之比表示目的蛋白的相對表達水平。

表1 實時熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 體外培養(yǎng)肺癌干細胞 在體外適宜條件的干細胞培養(yǎng)液中形成3D懸浮腫瘤細胞球落是腫瘤干細胞的典型特征之一[11-13]。結(jié)果表明,干細胞條件培養(yǎng)液可使A549細胞形成非粘附性的懸浮腫瘤球落,與常規(guī)培養(yǎng)狀態(tài)下的A549細胞差異明顯。見圖1。

圖1 A549細胞及干細胞培養(yǎng)細胞形態(tài)(×200)

2.2 體外培養(yǎng)干細胞CD133、SOX2、OCT4表達 與A549細胞相比,肺癌干細胞中CD133、SOX2、OCT4在轉(zhuǎn)錄及蛋白水平表達更高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2,圖3。以上結(jié)果提示肺癌干細胞具有更高的干性,即成功建立了肺癌干細胞模型。

注:與SCM比較,*P<0.05;**P<0.01圖2 肺癌干細胞CD133、SOX2、OCT4 mRNA表達

2.3 肺金生方對肺癌干細胞自我更新能力(球落形成)抑制作用 與對照組相比,不同濃度的肺金生方提取液可抑制肺癌干細胞形成的球落數(shù)量及大小,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)見圖4～圖5。

注:與0 g/L組比較,*P<0.05,**P<0.01圖4 肺金生方對肺癌干細胞球落體積的影響(×200)

注:與0 g/L組比較,*P<0.05,**P<0.01圖5 肺金生方對肺癌干細胞球落形成數(shù)量的影響(×100)

2.4 肺金生方對肺癌干細胞CD133、Sox2、OCT4 mRNA表達的影響 不同濃度的肺金生方可顯著抑制肺癌干細胞中CD133、Sox2、OCT4 mRNA的表達,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 見表2。

表2 各組肺癌干細胞CD133及OCT4、SOX2 mRNA表達的比較

2.5 肺金生方對肺癌干細胞Notch1通路標志物Notch1、Jagged1 mRNA表達的影響 不同濃度的肺金生方可顯著抑制肺癌干細胞中Notch1、Jagged1 mRNA的表達,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組肺癌干細胞Notch1、Jagged1 mRNA表達的比較

2.6 肺金生方對肺癌干細胞Notch1通路標志物Notch1、Jagged1蛋白表達的影響 不同濃度的肺金生方可顯著抑制肺癌干細胞中Notch1、Jagged1 蛋白的表達,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

注:與0 g/L組比較,*P<0.05,**P<0.01圖6 肺生金方對肺癌干細胞Notch1、Jagged1 蛋白表達的作用

4 討論

在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中,肺癌屬于“肺積”“咳嗽”“胸痛”等范疇,《雜病源流犀燭》認為:“邪積胸中,阻塞氣逆,氣不得通……遂結(jié)成形而有塊”?！端貑枴び駲C真藏論》詳細記載了晚期肺癌發(fā)熱、胸痛引肩背、惡液質(zhì)的癥狀,指出“大骨枯槁,大肉陷下,胸中氣滿,喘息不便,內(nèi)痛引肩項,身熱脫肉破”。龐德湘教授經(jīng)過臨床上多年實踐經(jīng)驗的總結(jié),結(jié)合現(xiàn)代中藥藥理學(xué)研究成果,自擬肺金生方以治療肺癌,該方可由“澤漆湯”化裁而來,已廣泛應(yīng)用于臨床上肺癌患者的治療,可抑制肺癌的生長及轉(zhuǎn)移、減少放化療的副作用并延長患者生存期[14]。相關(guān)研究表明,肺金生方提取物可下調(diào)Lewis肺癌細胞VEGF-C與nm23的表達,進而抑制肺癌細胞的增殖與轉(zhuǎn)移[15]。LCSC與生長腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān),通過抑制LCSC中α-Catulin的表達可降低LCSC的干性,發(fā)揮抑制肺癌生長轉(zhuǎn)移的作用[16]。但肺金生對肺癌發(fā)生發(fā)展的抑制作用是否與調(diào)控LCSC自我更新相關(guān)仍待闡明。

2008年,研究者發(fā)現(xiàn)了一種存在于造血、神經(jīng)、內(nèi)皮和上皮譜系的未分化細胞群,可在含有表皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子的無血清培養(yǎng)基中無限生長為腫瘤球體、高表達CD133、可自我更新并產(chǎn)生無限的非致瘤細胞后代的細胞群,將其定義為LCSC[17]。在肺癌的臨床治療過程中,部分表達特定分子的腫瘤細胞作為藥物作用的靶點被殺滅,但部分LCSC通過自我更新獲得耐藥性,通過不斷增殖成為導(dǎo)致后續(xù)腫瘤復(fù)發(fā)的主要因素[18]。CD133為一種常用于鑒定腫瘤組織中干細胞的標記物,基因特異定位于染色體4p15,是一種5次跨膜細胞蛋白[19]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),CD133+的肺癌細胞可通過高表達ATP結(jié)合盒G2表現(xiàn)出更強的轉(zhuǎn)移能力與耐藥性,CD133+肺癌細胞對于9-氨基蒽環(huán)類藥物氨柔比星的耐藥性是CD133-肺癌細胞的4.3倍,故在肺癌中CD133的高表達往往與患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[17, 20, 21]。使用順鉑干預(yù)肺癌患者的SCID小鼠的腫瘤異種移植模型,可在減小腫瘤體積的同時,顯著提高腫瘤組織中CD133+肺癌細胞的占比,而在后續(xù)停止順鉑干預(yù)腫瘤繼續(xù)生長時,CD133+肺癌細胞的占比又恢復(fù)至原先的水平[22]。研究表明,CD133+非小細胞肺癌患者腫瘤中的血管生成擬態(tài)情況表現(xiàn)高于正常組織,且CD133的表達與患者的臨床腫瘤分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期均呈正相關(guān),可作為預(yù)測肺癌患者預(yù)后的潛在標志物[23]。在非小細胞肺癌患者中與八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(OCT4)由Pou5f1基因編碼,是POU結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族的成員,最早于胚胎干細胞中和生殖細胞中發(fā)現(xiàn)[24]。研究表明,OCT4在多種惡性腫瘤中調(diào)控腫瘤干細胞的自我更新與多能性,高表達的OCT4與肺癌患者的不良預(yù)后相關(guān),臨床病理學(xué)相關(guān)性現(xiàn)實OCT4表達水平與肺癌細胞低分化和較高的TNM分期相關(guān)[25]。OCT4在肺癌細胞中可通過激活早期生長反應(yīng)基因1(Egr1)的啟動子并上調(diào)其表達,以增強肺癌細胞的轉(zhuǎn)移能力[26-27]。另一項研究表明,OCT4的表達與肺腺癌患者中的STAT1表達呈正相關(guān),STAT1下游基因Mcl-1在過表達OCT4的肺癌細胞中表達增加,在人肺腫瘤異種移植模型中,沉默STAT1可抑制OCT4過表達誘導(dǎo)的腫瘤生長[28]。OCT4+腫瘤細胞在干細胞條件培養(yǎng)基中更容易形成懸浮腫瘤球,并且其他干細胞標志物如CD133、CD34和ALDH1的表達水平更高,在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出更高的致瘤潛力[7]。SOX2是SOX基因家族的重要成員,在干細胞中編碼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,該因子通過高度保守的高遷移率基團(HMG)結(jié)構(gòu)域與DNA相互作用的,生理狀態(tài)下,SOX2存在于胚胎干細胞的細胞核中維持細胞干性,在胚胎發(fā)育的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用[29-30]。近年來研究表明,SOX2被發(fā)現(xiàn)與肺癌的進展密切相關(guān)。其可通過上調(diào)胱氨酸轉(zhuǎn)運蛋白SLC7A11的表達,增加胱氨酸攝取和谷胱甘肽合成以降低肺癌細胞對鐵死亡的敏感性[31]。一些高表達SOX2的腫瘤干細胞在其細胞表面具有ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白,可將細胞毒性藥物泵出,阻止其與靶細胞的DNA結(jié)合,使腫瘤干細胞對藥物治療產(chǎn)生耐藥性,致使治療后腫瘤復(fù)發(fā)[32]。研究表明,SOX2在包括小細胞和鱗狀細胞癌以及腺癌所有類型的肺癌組織中均過表達,下調(diào)SOX2的表達可顯著抑制肺鱗狀細胞癌的增殖[5-6]。在非小細胞肺癌中SOX2的基因拷貝數(shù)與FGFR1和PIK3CA的表達呈正相關(guān),與肺癌患者生存率和患者預(yù)后的改善相關(guān)[33]。本研究選用無血清富集培養(yǎng)法(SFM)誘導(dǎo)培養(yǎng)LCSC,與誘導(dǎo)前的肺癌貼壁細胞相比,LCSC表達更高水平的干細胞標志物CD133及核轉(zhuǎn)錄因子SOX2、OCT4,表明成功建立了肺癌干細胞體外培養(yǎng)體系。二次球落形成實驗是研究肺癌干細胞自我更新能力的重要方法,通過觀察腫瘤干細胞懸浮球落形成的大小及數(shù)量評估干細胞的自我更新能力。本研究結(jié)果顯示肺金生方作用于肺癌干細胞后,與0 g/L相比,肺金生干預(yù)組二次球落形成數(shù)量減少,球落形成體積變小,表明肺金生方可抑制肺癌干細胞的自我更新。進一步研究發(fā)現(xiàn)肺金生方可顯著降低LCSC中干性標志物CD133及干細胞核轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2的表達。

Notch是細胞中一種較為保守的信號通路,與癌癥生物學(xué)的多個方面密切相關(guān),如腫瘤干細胞、血管生成及腫瘤免疫信號通路等[34]。具有5 種配體,即Delta-like 1、Delta-like 3、Delta-like 4、Jagged-1和Jagged-2,以及4 個受體成員(Notch 1-4)。可通過配體結(jié)合誘導(dǎo)Notch的構(gòu)象變化,導(dǎo)致S2位點暴露,由蛋白酶A解聚素和金屬蛋白酶家族的成員和γ分泌酶復(fù)合物依次切割以釋放Notch胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域至細胞核發(fā)揮作用[35]。多項研究表明,Notch信號通路在肺癌及肺癌干細胞的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。肺癌發(fā)展過程中Notch信號通路的異常激活可促進肺癌干細胞的增殖,miR-211/222可通過激活Notch1信號通路,上調(diào)肺癌細胞中CD133及OCT4等干細胞相關(guān)基因的表達,促進小鼠體內(nèi)肺癌細胞的生長[36-38]。Notch1在缺氧誘導(dǎo)的CD133表達升高和化療藥物耐藥中發(fā)揮重要作用,其可介導(dǎo)Jumonji蛋白家族成員JAEID2上調(diào)肺癌細胞干性標志物,并誘導(dǎo)腫瘤組織對順鉑的耐藥[39-40]。相關(guān)研究表明,Notch1的高表達或與肺腺癌的不良預(yù)后密切相關(guān),通過靶向肺癌中Jagged1/Nocth1軸可抑制肺腺癌細胞的干細胞樣表型和腫瘤生長[41-42]。實驗結(jié)果顯示肺金生方提取物可顯著降低LCSC中Notch1信號通路相關(guān)分子Notch1、Jagged1在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平的表達,這可能是其抑制肺癌干細胞自我更新的作用機制。

由于LCSC具有自我更新的特性,導(dǎo)致肺癌的高復(fù)發(fā)率及高耐藥性仍是威脅患者預(yù)后及生存率的重要因素,但對于LCSC自我更新的機制仍知之甚少。本研究結(jié)果顯示肺金生方可能通過抑制Notch信號通路關(guān)鍵分子Notch1及其配體Jagged1的表達,降低LCSC中干性標志物CD133、干細胞核轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2的表達,抑制LCSC的自我更新能力,發(fā)揮抑制肺癌發(fā)生發(fā)展的作用。本研究揭示了肺金生方抑制肺癌的新機制,有助于肺金生方在肺癌患者的臨床治療中的應(yīng)用。但仍需要進一步的研究來評估詳細的機制和途徑,以更好地了解肺金生方的抗腫瘤作用。