王娟　趙玉霞　茹雅維　汪子涵　付婷　李光

摘要：目的 研究二甲雙胍對(duì)Ⅰ型成骨不全小鼠（oim）脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（oimADSCs）向成骨細(xì)胞分化的影響并初步探討二甲雙胍在oim中的治療效果。方法 從oim中分離培養(yǎng)oimADSCs，通過觀察細(xì)胞形態(tài)，堿性磷酸酶（ALP）染色和油紅O染色對(duì)其分化能力進(jìn)行鑒定；將oimADSCs分組進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，通過觀察ALP染色、檢測(cè)ALP活性和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測(cè)幾種成骨分化相關(guān)分子的表達(dá)情況，分析二甲雙胍對(duì)oimADSCs向成骨細(xì)胞分化的影響；利用微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)（Micro-CT）分析股骨的骨骼微觀結(jié)構(gòu)，觀察二甲雙胍在oim模型小鼠中的治療效果。結(jié)果 在二甲雙胍處理oimADSCs后，ALP染色顯著加深、ALP活性顯著提高，骨鈣素（Bglap）、Ⅰ型膠原（Col1a1）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）以及骨形成蛋白2（BMP2）的mRNA表達(dá)水平升高；Micro-CT分析發(fā)現(xiàn)oim模型小鼠經(jīng)過二甲雙胍治療后，股骨骨小梁的骨體積/總體積增加，股骨骨小梁數(shù)目增多、厚度增加。結(jié)論 二甲雙胍能夠促進(jìn)oimADSCs向成骨細(xì)胞分化，改善oim的骨骼生長(zhǎng)情況。

關(guān)鍵詞：成骨不全；間質(zhì)干細(xì)胞；二甲雙胍；Ⅰ型成骨不全；脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；成骨分化

中圖分類號(hào)：R681.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20221341

Study of effects of metformin on osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells and bone tissue regeneration in type I osteogenesis imperfecta mice

WANG Juan， ZHAO Yuxia， RU Yawei， WANG Zihan， FU Ting， LI Guang

Department of Genetics， School of Basic Medicine， Tianjin Medical University， Tianjin 300070， China

Corresponding Author E-mail： lig@tmu.edu.cn

Abstract： Objective To evaluate the effect of metformin on the osteogenic differentiation of adipose derived mesenchymal stem cells of type I osteogenesis imperfecta mice （oimADSCs）， and the therapeutic effect of metformin on bone tissue regeneration in oim mice. Methods The oimADSCs were isolated and cultured. Cell morphology observation， alkaline phosphatase staining and oil red O staining were used to validate the multiple differentiation potential of oimADSCs．After osteogenic induction，ALP staining and ALP activity were compared between groups. qPCR was applied to analyze the expression of osteogenic differentiation associated genes. Micro-CT was used to detect the femoral microstructure and analyze effects of metformin on bone regeneration in oim mice. Results Compared with the control group， ALP staining was more deeper and the ALP activity level was obviously increased in the osteogenesis+metformin group. The transcription levels of Bglap， Col1a1， Runx2 and BMP2 were significantly up-regulated. The micro-CT results revealed that after metformin treatment， BV/TV， trabecular number and Tb.Th of oim mice were increased. Conclusion Metformin can enhance osteogenic differentiation of oimADSCs in vitro and improve bone microstructure of oim mice in vivo．

Key words： osteogenesis imperfecta; mesenchymal stem cells; metformin; type I osteogenesis imperfecta; adipose derived mesenchymal stem cells; osteogenic differentiation

成骨不全（osteogenesis imperfecta，OI）是以反復(fù)骨折、骨質(zhì)脆弱、骨畸形為臨床特征的遺傳性疾?。?-2］。Sillence等［3］將OI分為Ⅰ—Ⅳ型。Ⅰ型最常見的致病原因是編碼Ⅰ型膠原蛋白α鏈的基因Col1a1突變，導(dǎo)致Ⅰ型膠原數(shù)量減少，進(jìn)一步導(dǎo)致患者單位骨質(zhì)的骨量下降和骨組織的代謝和（或）生長(zhǎng)異常［4-5］。二甲雙胍是臨床治療2型糖尿病的常用藥。有研究發(fā)現(xiàn)其還具有骨保護(hù)作用［6］。糖尿病患者骨折率明顯高于非糖尿病人群，長(zhǎng)期服用二甲雙胍可顯著降低糖尿病患者的骨折發(fā)生率［7］；且骨質(zhì)疏松癥患者服用二甲雙胍可以增加骨密度［8］。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍不僅可以促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，還可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、抑制破骨細(xì)胞的形成［9］。但是目前二甲雙胍在OI患者或動(dòng)物模型中的研究鮮見報(bào)道。本研究通過分離培養(yǎng)Ⅰ型OI小鼠（type Ⅰ osteogenesis imperfecta mice，oim）的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose derived mesenchymal stem cells of oim mouse，oimADSCs），研究二甲雙胍對(duì)oimADSCs向成骨細(xì)胞分化的影響，并初步探討二甲雙胍在oim中的治療效果，以期為二甲雙胍用于治療Ⅰ型OI提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑與儀器

oim由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建［10］：該小鼠品系為C57BL/6小鼠，該小鼠模型為通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除Col1a1外顯子2—5，構(gòu)建而成的Col1a1缺失突變模型。本實(shí)驗(yàn)所用oim為8～9周齡，雄性，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心無特定病原體級(jí)別的屏障系統(tǒng)中。α-MEM培養(yǎng)基、鏈霉素、青霉素購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，地塞米松、β-甘油磷酸酯、抗壞血酸、吲哚美辛、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自以色列Biological Industries公司，堿性磷酸酶（ALP）染色試劑盒、ALP活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Ⅰ型膠原酶購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，組織基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biomiga公司。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基具體成分如下：取100 μL地塞米松溶液（終濃度為1×10-7 mol/L）、10 mL β-磷酸甘油酯溶液（終濃度為1×10-5 mol/L）、2 mL抗壞血酸溶液（終濃度為100 mg/L），加入含5%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基至100 mL。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基具體成分如下：取500 μL地塞米松溶液（終濃度為1×10-6 mol/L）、500 μL 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤溶液（終濃度為5×10-4 mol/L）、100 μL吲哚美辛溶液（終濃度為1×10-6 mol/L）、142.86 μL胰島素溶液（終濃度為5 μg/L），加入含5%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基至100 mL。

1.2 研究方法

1.2.1 oimADSCs的分離和培養(yǎng)

參照文獻(xiàn)［11］，從oim中分離培養(yǎng)oimADSCs。頸椎脫臼法處死oim小鼠，在無菌環(huán)境中取出小鼠兩側(cè)腹股溝和附睪處脂肪組織，去除脂肪表面的結(jié)締組織，將脂肪組織剪碎后加入Ⅰ型膠原酶，37 ℃恒溫?fù)u床消化45 min。加入胎牛血清終止消化，將細(xì)胞過濾離心后培養(yǎng)。用含15%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，第3天更換半量培養(yǎng)基，第4天更換全部培養(yǎng)基，以后每2 d換1次培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)傳代。

1.2.2 oimADSCs的成骨、成脂分化能力鑒定

選用P3代oimADSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化。消化oimADSCs，制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，按1×105個(gè)/孔接種到6孔板中。待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，將細(xì)胞分組進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，分為成骨對(duì)照組（加入α-MEM培養(yǎng)基）、成骨誘導(dǎo)組（加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基）、成脂對(duì)照組（加入α-MEM培養(yǎng)基）、成脂誘導(dǎo)組（加入成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基）。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每3 d更換1次新鮮培養(yǎng)基。對(duì)于成骨對(duì)照組、成骨誘導(dǎo)組在誘導(dǎo)14 d后固定細(xì)胞，隨后進(jìn)行ALP染色鑒定成骨分化能力；對(duì)于成脂對(duì)照組、成脂誘導(dǎo)組在誘導(dǎo)14 d后固定細(xì)胞，隨后進(jìn)行油紅O染液染色鑒定成脂分化能力。

1.2.3 ALP染色及活性檢測(cè)

接種oimADSCs細(xì)胞，將細(xì)胞分為成骨誘導(dǎo)組（加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基）和實(shí)驗(yàn)組（成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基+500 μmol/L二甲雙胍）進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。每組重復(fù)3次，每隔2 d更換相應(yīng)的培養(yǎng)基。在誘導(dǎo)7 d后，分別收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說明書檢測(cè)ALP活性。在誘導(dǎo)14 d后，按照ALP染色試劑盒說明書要求固定細(xì)胞，隨后進(jìn)行ALP染色，通過ALP染色判定細(xì)胞向成骨方向分化能力。

1.2.4 qPCR檢測(cè)成骨相關(guān)因子

消化P3代oimADSCs，計(jì)數(shù)后以1×105個(gè)/孔接種到6孔板，將細(xì)胞分為成骨誘導(dǎo)組（加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基）和實(shí)驗(yàn)組（成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基+500 μmol/L二甲雙胍）進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。每隔2 d更換相應(yīng)的培養(yǎng)基。14 d后收集細(xì)胞，用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，再用試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用qPCR檢測(cè)骨鈣素（Bglap）、Ⅰ型膠原α鏈（Col1a1）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）以及骨形成蛋白2（BMP2）的表達(dá)量，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。以GAPDH為內(nèi)參，2^-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組

取oim 12只，隨機(jī)分為二甲雙胍組（2 mg·kg-1·d-1）和對(duì)照組（生理鹽水），每組6只，治療2個(gè)月，二甲雙胍組每天灌胃含二甲雙胍的生理鹽水，對(duì)照組每天灌胃等體積的生理鹽水。在治療結(jié)束后，頸椎脫臼處死各組小鼠，分離股骨，并在4%多聚甲醛中固定3 d，用于檢測(cè)股骨微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.6 微計(jì)算機(jī)斷層掃描（Micro-CT）檢測(cè)股骨微觀結(jié)構(gòu)

應(yīng)用Micro-CT分析儀（SkyScan 1276）對(duì)小鼠股骨進(jìn)行掃描。掃描完成后用軟件（CTAn，1.15.4）對(duì)股骨三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行重建，并分析從生長(zhǎng)板下緣至骨小梁消失處區(qū)域的微觀結(jié)構(gòu)參數(shù)。骨小梁參數(shù)包括骨體積/總體積（bone volume/total volume，BV/TV）、骨小梁數(shù)目（trabecular number，Tb.N）和骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 oimADSCs的成骨和成脂分化能力鑒定

隨著成骨分化誘導(dǎo)的進(jìn)行，細(xì)胞形態(tài)逐漸由梭形變?yōu)殄F體形，沉淀增多并聚集凝結(jié)在一起形成鈣結(jié)節(jié)；隨著成脂分化誘導(dǎo)的進(jìn)行，細(xì)胞形態(tài)逐漸由梭形變?yōu)閳A形、橢圓形，從胞膜下脂肪小顆粒逐漸形成脂滴，見圖1。ALP染色結(jié)果顯示，oimADSCs在成骨分化誘導(dǎo)后ALP表達(dá)活性增高；油紅O染色結(jié)果顯示oimADSCs在成脂分化誘導(dǎo)后出現(xiàn)紅色的脂滴，見圖2。表明oimADSCs成骨分化、成脂分化誘導(dǎo)成功，分離得到的oimADSCs具有多向分化潛能，為典型的間充質(zhì)干細(xì)胞。

2.2 二甲雙胍對(duì)oimADSCs成骨分化的影響

與成骨誘導(dǎo)組相比，實(shí)驗(yàn)組的ALP染色加深、ALP活性升高［（2.91±0.28）U/L vs. （1.07±0.12）U/L，n=3，t=10.664，P＜0.01］。見圖3。與成骨誘導(dǎo)組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中成骨分化相關(guān)因子BMP2、Runx2、Col1a1、Bglap的mRNA表達(dá)水平升高，見表2。

2.3 二甲雙胍對(duì)oim的治療效果

Micro-CT結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，二甲雙胍組BV/TV增高，Tb. N增多，Tb. Th增厚，見圖4、表3。

3 討論

3.1 OI的臨床癥狀及治療方法

OI患者的臨床表現(xiàn)包括頻繁骨折和骨折愈合不良，給患者帶來極大的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。Ⅰ型OI是發(fā)病率最高的一種OI，最常見的致病原因是Col1a1突變，導(dǎo)致Ⅰ型膠原數(shù)量減少，從而導(dǎo)致骨基質(zhì)量不足。本研究所用的oim經(jīng)過Ⅰ型膠原水平、骨密度、骨量、力學(xué)性能及骨代謝等多方面檢測(cè)，其表型符合oim特征［10］。OI是一種由于基因突變導(dǎo)致的遺傳性疾病，目前尚無治愈的方法，當(dāng)前主要是采用外科手術(shù)和藥物聯(lián)合等方法治療［12-13］。雖然取得了一定的療效，但不能從根本上解決患者干細(xì)胞分化能力缺陷、成骨細(xì)胞功能降低、Ⅰ型膠原合成不足等問題［14-15］。

3.2 二甲雙胍對(duì)骨代謝的影響

作為治療2型糖尿病的經(jīng)典藥物，二甲雙胍具有價(jià)格低廉和療效可靠的優(yōu)點(diǎn)［16］。隨著研究者對(duì)二甲雙胍降糖以及降糖以外作用研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)組織再生的功能。在小鼠皮膚涂抹二甲雙胍可以促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)，其通過腺苷酸活化蛋白激酶和mTOR信號(hào)通路激活自噬，促使毛囊從休止期進(jìn)入生長(zhǎng)期，從而促進(jìn)毛發(fā)再生［17］。Neumann等［18］發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以促進(jìn)大鼠老化的少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的分化功能，并進(jìn)一步促進(jìn)髓鞘再生。多項(xiàng)研究亦證實(shí)二甲雙胍對(duì)骨代謝具有有益的作用，包括抑制成脂分化、減少破骨細(xì)胞數(shù)目、修復(fù)骨缺損等［19-20］。二甲雙胍在Ⅰ型OI中是否具有促進(jìn)骨組織再生的作用以及是否對(duì)骨代謝有益有待進(jìn)一步研究。本研究利用Micro-CT分析發(fā)現(xiàn)，oim在經(jīng)二甲雙胍治療后，股骨骨小梁的BV/TV增高，Tb. N增多，Tb. Th增厚，說明在oim中二甲雙胍能夠顯著改善股骨的微觀結(jié)構(gòu)。

3.3 二甲雙胍對(duì)oimADSCs細(xì)胞成骨分化的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍干預(yù)后MC3T3E1細(xì)胞和成骨細(xì)胞中Col1a1的mRNA表達(dá)水平顯著增加［21-22］。本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍不僅能夠促進(jìn)oimADSCs向成骨細(xì)胞分化，還能促進(jìn)Col1a1的表達(dá)。Ⅰ型膠原是由兩條α1（Ⅰ）鏈和一條α2（Ⅰ）鏈構(gòu)成的三股螺旋結(jié)構(gòu)，占骨基質(zhì)有機(jī)物的90%左右，是骨礦物質(zhì)沉積的礦化支架；其中α1鏈?zhǔn)怯苫駽ol1a1編碼合成的，Col1a1的表達(dá)水平直接影響了Ⅰ型膠原的含量。在Ⅰ型OI中由于Ⅰ型膠原的含量減少導(dǎo)致機(jī)體成骨微環(huán)境被破壞，而二甲雙胍可以促進(jìn)Col1a1的表達(dá)，有望提高Ⅰ型膠原的含量并改善Ⅰ型OI患者的成骨微環(huán)境。

綜上所述，本研究利用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明二甲雙胍具有促進(jìn)oimADSCs細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化以及促進(jìn)Col1a1表達(dá)的能力，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在經(jīng)二甲雙胍治療后，oim的股骨的微觀結(jié)構(gòu)有很大程度改善。本實(shí)驗(yàn)為二甲雙胍治療Ⅰ型OI奠定了一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為Ⅰ型OI患者的臨床治療提供了新的思路與方法。

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（2022-09-01收稿 2023-02-28修回）

（本文編輯 李鵬）