林遜汀 歐陽慧 黃明城 林玉妹 謝晨曦

1 廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院消化內(nèi)科（福建廈門 361004）

2 中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院消化內(nèi)科（廣東深圳 518107）

3 中山大學(xué)附屬第七醫(yī)院腎內(nèi)科（廣東深圳 518107）

胃食管反流?。╣astro-esophageal reflux disease，GERD）指的是由胃內(nèi)容物反流引起的癥狀和/或并發(fā)癥。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，反流引起的粘膜損傷是從破壞食管表面上皮的完整性開始的，炎癥逐漸向粘膜下層發(fā)展。但Dunbar KB發(fā)現(xiàn)，食管炎患者中斷質(zhì)子泵抑制劑治療后，組織學(xué)上再次出現(xiàn)基底細(xì)胞間隙增寬、毛細(xì)血管擴(kuò)張、乳頭延長等表現(xiàn)，這些改變與粘膜是否存在破損無關(guān)［1］。我們既往的研究也發(fā)現(xiàn)，反流性食管炎、非糜爛性胃食管反流?。╪on-erosive reflux disease，NERD）及高敏性食管的患者均存在基底細(xì)胞間隙增寬（dilated intercellular spaces，DIS）的現(xiàn)象，DIS與食管酸暴露百分比時間不存在相關(guān)性［2］。Souza RF發(fā)現(xiàn)，胃反流物可以刺激食管上皮分泌細(xì)胞因子，募集炎癥細(xì)胞［3］。炎癥細(xì)胞自基底層向上皮浸潤，導(dǎo)致炎癥先自基層發(fā)生。這些結(jié)果提示，各種因素誘導(dǎo)上皮分泌細(xì)胞因子應(yīng)是GERD重要的病理生理學(xué)機(jī)制。

酸反流（反流發(fā)作時食管pH≤4）是引起GERD的主要原因，對其已有深入的研究。而弱酸反流（反流發(fā)作時食管pH 4~7）可能在NERD中具有更大的作用，可以引起食管外癥狀，可能是難治性GERD的主要病因［4］。它是夜間反流的主要形式之一，嚴(yán)重影響患者的睡眠和生活質(zhì)量［5］。目前對弱酸反流的研究相對較少，有必要進(jìn)一步開展相關(guān)的工作。

p38 MAPK是絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPKs）家族的重要成員，它參與了炎癥、應(yīng)激、細(xì)胞生長和凋亡等多種生理和病理過程。既往研究表明，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以促進(jìn)RAW 264.7巨噬細(xì)胞系產(chǎn)生NO與IL-6，這與促進(jìn)NF-κB的核轉(zhuǎn)移有關(guān)。而抑制ERK1/2及p38的磷酸化，可顯著減低巨噬細(xì)胞炎癥因子的分泌［6］。這提示，p38 MAPK信號通路在調(diào)控炎癥的過程中發(fā)揮重要的作用。但其在GERD發(fā)生發(fā)展中的作用，有待進(jìn)一步研究。

本次研究，我們將采用體外試驗的方法，探索弱酸刺激對人食管內(nèi)皮細(xì)胞（human esophageal endothelial cell，HEEC）的影響，試圖加深對GERD病理生理學(xué)機(jī)制的了解，并為臨床診療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1 主要的實驗材料 （1）細(xì)胞：HEEC，貨號：BNCC359279，購自北納生物科技有限公司；（2）CCK8試劑盒：貨號：70-CCK810，購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；（3）IL-1β ELISA試劑盒：貨號：EK101BHS，購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；（4）p38抗體：貨號：cst8690T，購自Cell Signaling Technology（CST）公司；（5）p-p38抗體：貨號：cst4511T ，購自Cell Signaling Technology（CST）公司；（6）二抗：Goat anti-Mouse IgG 與Goat anti-Rabbit IgG，貨號：GAM007與GAR0072，購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；（7）ECL Plus發(fā)光試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、Western及IP細(xì) 胞裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司；（8）彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)：購自Fermentas 公司。

1.1.2 主要儀器 （1）二氧化碳培養(yǎng)箱：3111型（美國 Thermo Fisher Scientific公司）；（2）微光分光光度計：SMA4000型（美國 Merinton公司），配套使用的軟件為 SMA4000 V4.2.3；（3）全波長酶標(biāo)儀：SpectraMax Plus 384 型（美國Molecular Devices公司）；（4）倒置相差顯微鏡：ECLIPSE Ti-S型（日本 Nikon 公司）；（5）低速自動平衡離心機(jī)：TDZ4-WS型，湖南湘儀實驗儀器有限公司；（6）臺式高速冷凍離心機(jī)：TGL-16型，湖南湘儀實驗儀器有限公司；（7）臺式低速離心機(jī)：TDZ4-WS型，上海盧湘儀離心機(jī)儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞活力檢測

1.2.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞置于含10% FBS、1%丙酮酸鈉的MEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.1.2 鋪板與換液：取正常培養(yǎng)的處于對數(shù)期的細(xì)胞，用0.25% Typsin+0.02% EDTA消化，1 000 rpm離心5 min，鋪96孔，每孔均加入1×104個細(xì)胞，培養(yǎng)箱中過夜。

1.2.1.3 弱酸性培養(yǎng)基由H2SO4調(diào)節(jié)pH至6.0~6.5。實驗分組為弱酸性組（pH 6.0~6.5）和中性組（pH 7.0~7.4）。分別加入對應(yīng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，3 h和6 h。（共2個大組，6個亞組。每個亞組設(shè)置6個復(fù)孔，各測量6次數(shù)據(jù)）。

1.2.1.4 對應(yīng)培養(yǎng)時間結(jié)束后，每孔加入10%的CCK8檢測液，37 ℃避光反應(yīng)1 h。于波長450 nm、650 nm處讀取各孔OD值。

1.2.1.5 實驗結(jié)果按以下公式計算：細(xì)胞活力（%）=實驗組（OD450值-OD650值）/對照組（OD450值-OD650值）×100%。

1.2.2 Western Blot實驗

1.2.2.1 分組：將實驗組1（pH 6.0~6.5）和實驗組2（pH 7.0~7.4）各分為3組?；€組設(shè)為0 h，之后分別培養(yǎng)2 h和6 h。（共2個大組，6個亞組，每個亞組的蛋白均測量3次）。

1.2.2.2 收集樣品與電泳：將各組細(xì)胞樣品收集到1.5 mL EP管中，每管中加入 200 μL Western及IP裂解液（使用前加入PMSF，終濃度1 mM），混勻后4 ℃充分裂解2 h，采用4 ℃離心機(jī)，12 000 r/min離心處理樣品，分別取上清液儲存。上樣前加入5×上樣緩沖液混勻，100 ℃放置10 min，迅速冰浴中冷卻，上樣量為每泳道約30 μg。在電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液，接通電源，80 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)跑完濃縮膠層，分離膠120 V恒壓電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)遷移至分離膠下緣時，關(guān)掉電源，停止電泳。

1.2.2.3 抗體孵育與顯影：將PVDF膜浸入含5%脫脂奶粉的封閉液中，置搖床上緩慢搖動，室溫封閉1 h。取出已封閉的PVDF膜，加入一抗，4 ℃孵育過夜（p-p38、p38稀釋比為1∶1 000，GAPDH稀釋比為1∶5 000）。洗膜3次，每次10 min，之后孵育二抗（稀釋比為1∶5 000），于室溫?fù)u床上孵育1 h。再次洗膜3次，每次10 min。將PVDF膜置于保鮮膜上，取適量ECL試劑盒中等體積的A液和B液混合，混勻后加在膜的表面，移入凝膠成像分析儀中，化學(xué)光敏模式曝光顯影。

1.2.3 ELISA檢測

1.2.3.1 將實驗組1（pH 6.0~6.5）和實驗組2（pH 7.0~7.4）各分為3組?；€組均設(shè)為0 h，之后分別培養(yǎng)2 h、6 h。（共2個大組，6個亞組。每個亞組的IL-8和IL-1β，均測量9次樣本數(shù)據(jù)）。

1.2.3.2 采用5 000 r/min 離心后取細(xì)胞培養(yǎng)液上清待用。將要用的ELISA 板用1×Wash solution 浸泡30 s，去盡洗液，盡量不要使孔板干燥。

1.2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)品孔加入100 μL 2倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔加入100 μL 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，其余孔加入待測樣本100 μL，加上覆膜，300 r/min振蕩，室溫下孵育1.5 h。棄去液體，每孔加入350 μL 1×Washing buffer清洗，浸泡1 min，吸水紙上輕拍移除孔內(nèi)液體，重復(fù)6次。

1.2.3.4 每孔加入100 μL稀釋的檢測抗體，加上覆膜，300 r/min振蕩，室溫下孵育0.5 h。棄去液體，每孔加入350 μL 1×Washing buffer 清洗，浸泡 1 min，吸水紙上輕拍移除孔內(nèi)液體，重復(fù)6次。

1.2.3.5 每孔加100 μL稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，加上覆膜，300 r/min振蕩，室溫下孵育0.5 h。棄去液體，如上述1.2.3.3中步驟進(jìn)行清洗。

1.2.3.6 每孔加入100 μL稀釋的信號增強(qiáng)劑，加上覆膜，300 r/min振蕩，室溫下孵育0.25 h。棄去液體，如上述1.2.3.3中步驟進(jìn)行清洗。

1.2.3.7 每孔加100 μL稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，加上覆膜，300 r/min振蕩，室溫下孵育0.25 h，棄去液體，如上述1.2.3.3中步驟進(jìn)行清洗。

1.2.3.8 每孔中分別加100 μL TMB底物溶液，室溫避光孵育5~30 min。在每孔中加入 100 μL Stop Solution，輕輕混勻，于波長450 nm和570 nm處讀取OD值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3.9 將實驗組1（pH 6.0~6.5）和實驗組2（pH 7.0~7.4）各分為4個亞組。一組設(shè)為對照，另外3組中加入不同濃度的p38抑制劑SBS 203580（低濃度抑制劑為1 μM，中濃度抑制劑2 μM，高濃度抑制劑3 μM）。培養(yǎng)時間為6 h。其余ELISA檢測步驟如上述。（共2個大組，8個亞組。每個亞組均測量9次數(shù)據(jù)）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用單因素方差分析來比較差異。P值小于0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。使用SPSS 23.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）完成統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1 不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞活力的改變

HEEC細(xì)胞分別在中性（pH 7.0~7.4）和弱酸性（pH 6.0~6.5）環(huán)境下培養(yǎng)1 h，3 h和6 h。隨著時間的延長，弱酸性組中的細(xì)胞活力下降。結(jié)果如表1所示。

表1 細(xì)胞活力（%）的對比 （）

表1 細(xì)胞活力（%）的對比 （）

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2.2 不同培養(yǎng)條件下p38和p-p38蛋白表達(dá)的變化

以0 h的蛋白水平設(shè)為基線。2個實驗組基線的p38蛋白水平相似（P＞0.05）。與基線相比，隨著培養(yǎng)時間的延長，2組的p38表達(dá)均沒有明顯變化（P＞0.05）?；€時，2個實驗組中p-p38的含量沒有顯著差異（P＞0.05）。中性組中的p-p38含量隨培養(yǎng)時間的延長，沒有顯著改變（P＞0.05）。在弱酸組中，p-p38的含量在培養(yǎng)2 h和6 h后，較基線水平均明顯增加（P＜0.01），且高于同時段的中性組（P＜0.05）。其結(jié)果如表2與圖1所示。

圖1 弱酸培養(yǎng)促進(jìn)食管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)p-p38 的含量增加

表2 蛋白灰度值比值變化 （）

表2 蛋白灰度值比值變化 （）

注：灰度值比值指蛋白條帶灰度值和內(nèi)參灰度值的比值。

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2.3 不同培養(yǎng)條件下IL-8和IL-1β的表達(dá)情況

HEEC細(xì)胞分別在中性（pH7.0~7.4）和弱酸性（pH6.0~6.5）環(huán)境下培養(yǎng)。采用ELISA法檢測基線時（0 h），以及培養(yǎng)2 h和6 h后上清中IL-8和IL-1β的濃度。我們發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間的延長，IL-8和IL-1β的濃度在中性組中無顯著變化（P＞0.05）。弱酸組中，與基線時相比，IL-8和IL-1β的濃度在培養(yǎng)2 h和6 h后明顯升高，且高于同時段的中性組（P＜0.01）。結(jié)果如表3和圖2所示。

圖2 弱酸培養(yǎng)促進(jìn)IL-8 和IL-1β 的表達(dá)

表3 上清中IL-8和IL-1β濃度的變化 （，pg/mL）

表3 上清中IL-8和IL-1β濃度的變化 （，pg/mL）

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2.4 抑制p38激酶活性對IL-8和LI-1β的影響

和中性對照組相比，弱酸對照組I L-8 和IL-1β濃度升高（P＜0.01）。采用中性培養(yǎng)基的條件下，加入p38抑制劑后，和對照組相比，其余各組IL-8和IL-1β無顯著變化（P＞0.05）。采用弱酸培養(yǎng)基的條件下，加入p38抑制劑后，和對照組相比，其余各組IL-8和IL-1β的濃度明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果如表4和圖3所示。

圖3 抑制p38 催化活性可以減少IL-8 和IL-1β 表達(dá)（培養(yǎng)6 h）

表4 加入p38抑制劑后IL-8和IL-1β濃度的變化 （，pg/mL）

表4 加入p38抑制劑后IL-8和IL-1β濃度的變化 （，pg/mL）

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3 討 論

胃食管反流病是一種臨床常見的疾病，在亞太國家，GERD的發(fā)病率有逐漸上升的趨勢［7］。GERD最常見的癥狀是燒心和反流［8］。通常情況下，反流和燒心的主要病因是酸反流，它是決定食管炎嚴(yán)重程度的主要因素［4］。但在采用質(zhì)子泵抑制劑治療，癥狀仍然持續(xù)的患者中，非酸反流被認(rèn)為是引起癥狀的主要原因［4，9］。在這部分患者中，大部分的反流事件是弱酸反流（pH4~7），堿反流（pH＞7）僅占很小的一部分［9-10］。因此，深入研究弱酸反流有利于加深對難治性GERD的了解，提高臨床療效。本次研究，我們采用體外實驗，探索弱酸刺激對食管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。

我們發(fā)現(xiàn)，在1h以后，弱酸環(huán)境下的食管內(nèi)皮細(xì)胞活力明顯下降，而IL-8和IL-1β的表達(dá)明顯升高。且隨著培養(yǎng)時間的延長，該現(xiàn)象越明顯。這提示，弱酸刺激可能通過炎癥級聯(lián)放大效應(yīng)促進(jìn)食管細(xì)胞死亡和組織損傷。IL-8和IL-1β由巨噬細(xì)胞和多種組織細(xì)胞釋放。既往研究表明，非酸反流可以促進(jìn)食管鱗狀上皮細(xì)胞分泌IL-8和IL-1β，趨化炎癥細(xì)胞，使黏膜固有層或更深層的感覺神經(jīng)元暴露于炎癥介質(zhì)，引發(fā)癥狀［1，11-12］。這和我們的結(jié)果相符。胃食管反流病的組織病理學(xué)特征，如基底細(xì)胞增生，乳頭狀延長，中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤均與黏膜中較高水平的IL-8相關(guān)［13-14］。在高脂飲食的小鼠模型中，IL-8是促進(jìn)食管上皮不典型增生的關(guān)鍵因子［15］。反流性食管炎患者采用蘭索拉唑治療，可以促使黏膜的IL-8水平顯著下降［13］。半胱天冬酶1可以被炎癥小體激活，導(dǎo)致包括Il-1β在內(nèi)的諸多炎癥因子的產(chǎn)生，觸發(fā)食管細(xì)胞焦亡。這與食管炎和食管癌的發(fā)生有關(guān)［16］。在存在嚴(yán)重癥狀或癥狀反復(fù)發(fā)作的GERD患者中，對IL-1β單核苷酸多態(tài)性的評估有利于識別具有巴雷特食管和食管癌風(fēng)險的患者［17］。我們認(rèn)為，進(jìn)一步研究弱酸對食管內(nèi)皮細(xì)胞所處的免疫微環(huán)境的影響，將有利于加深對NERD發(fā)病機(jī)制的了解。

本次研究，我們發(fā)現(xiàn)，p38的總量并沒有隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，也不受培養(yǎng)基pH值的影響。但其活性形式p-p38在弱酸刺激下明顯增加。酪蛋白激酶2（CK2）是p38重要的下游底物，可以引起IκBa的泛素化降解，促進(jìn)NF-κB的核易位，也可以通過磷酸化P65/RelA，增強(qiáng)NF-κB與DNA位點的結(jié)合力［18］。如果食管上皮長期暴露于胃反流物中，會觸發(fā)細(xì)胞發(fā)生基因突變。如果突變發(fā)生于腫瘤蛋白p53基因，突變的p53可以與NFκB一起促進(jìn)腫瘤的發(fā)展［19］。在GERD患者的食道黏膜中發(fā)現(xiàn)了NF-κB的激活，并且NF-κB亞基主要定位于表達(dá)IL-8的細(xì)胞的細(xì)胞核中［20］。因此，我們推測，對于GERD患者，p38 MAPK信號通路可能具有調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥反應(yīng)的作用。SB 203580被廣泛用于分析p38 MAPK在各種生理過程中的作用。SB 203580對p38的激活沒有影響，主要起到阻斷p38 MAPK的催化活性的作用［21］。激活的p38能夠自我活化，增加細(xì)胞內(nèi)p-p38的含量，而SB203580能夠抑制這種正反饋調(diào)節(jié)。我們發(fā)現(xiàn)，加入p38抑制劑后，IL-8和IL-1β的表達(dá)明顯下降，且隨著抑制劑濃度的增強(qiáng)，下降趨勢越明顯。這表明，在弱酸反流的過程中，p38相關(guān)信號通路的激活具有促進(jìn)炎癥的作用，抑制p38 MAPK可能是一種潛在的治療GERD的方案，但還需體內(nèi)實驗進(jìn)一步驗證。

本次研究存在以下不足之處：第一，僅采用CCK8實驗檢測細(xì)胞活力，未進(jìn)一步檢測凋亡相關(guān)蛋白、細(xì)胞緊密連接蛋白等的表達(dá)，也未進(jìn)行細(xì)胞周期檢測，故未能完整、系統(tǒng)的揭示弱酸刺激對食管細(xì)胞功能的影響，這在未來的實驗中將進(jìn)一步驗證；第二，我們未進(jìn)行動物模型的構(gòu)建，體外實驗的結(jié)論能否在體內(nèi)實驗中重現(xiàn)，需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，弱酸培養(yǎng)導(dǎo)致食管內(nèi)皮細(xì)胞活力下降，炎癥因子的表達(dá)增加。抑制p38的激酶活性可以減少IL-8和IL-1β的產(chǎn)生，從而抑制炎癥。進(jìn)一步開展關(guān)于p38 MAPK信號通路的研究，可以加深對難治性GERD發(fā)病機(jī)制的理解，開拓臨床治療思路。