頊嘉琪 劉克海

上海海洋大學食品學院（上海 201306）

納米顆粒（nano particles，NPs）通過高滲透長滯留（enhanced permeability and retention，EPR）效應實現(xiàn)化學治療（化療）藥物的靶向遞送，已經(jīng)成為癌癥治療診斷的有前途的工具［1］。通常，納米制劑的整個體內(nèi)遞送過程包括血液循環(huán)、腫瘤累積、滯留、滲透、細胞內(nèi)化和清除［2］。在這些過程中，NPs的轉(zhuǎn)運受到許多生物屏障的阻礙，例如網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的相互作用和腫瘤的高間質(zhì)液壓力。理想的藥劑應該能夠積聚到腫瘤中，有效地發(fā)揮作用，并且在其功能耗盡后從體內(nèi)消除，以避免長期毒性［3］。為了實現(xiàn)最佳的治療診斷性能，應合理設(shè)計納米顆粒的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)以實現(xiàn)有效遞送。作為NPs的基本性質(zhì)，粒徑在遞送過程中起重要作用。為了實現(xiàn)延長的血液循環(huán)和高腫瘤積聚，直徑在20~200 nm范圍內(nèi)的NPs是一個很好的選擇，因為它有助于通過EPR效應在腫瘤部位蓄積［4］。然而，該尺寸范圍對于腫瘤保留、滲透和機體消除不是最佳的。為了防止NPs重新進入血流或擴散到周圍組織中，可以將大尺寸的NPs捕獲到腫瘤部位中；而需要較小的尺寸來實現(xiàn)令人滿意的穿透深度或快速清除［5］。因此，理想的遞送系統(tǒng)的初始尺寸應該相對較大，以實現(xiàn)更長的循環(huán)和選擇性外滲，但是一旦“對接”在腫瘤部位，它應該可切換為小顆粒以促進腫瘤滲透［6］。這些設(shè)想促進了刺激響應性納米顆粒的發(fā)展，這些納米顆粒能夠通過響應酶、pH或其他條件來縮小其尺寸［7］。

基于此，為了克服尺寸所引發(fā)的遞送障礙，本文設(shè)計了一種酶響應型納米遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)由金屬基質(zhì)蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）敏感多肽交聯(lián)負載化療藥物的小粒徑載體PAMAM/DOX構(gòu)成。聚酰胺-胺樹狀大分子（polyamidoamine dendrimer，PAMAM）是目前被廣泛研究的陽離子聚合物，其尺寸較小，表面富含大量氨基，易于后續(xù)修飾，且疏水空腔內(nèi)可以負載化療藥物［8］。此外，PAMAM表面的氨基質(zhì)子化，在溶酶體中產(chǎn)生“質(zhì)子海綿效應”，使得其從溶酶體中逃逸并進入細胞質(zhì)中。腫瘤細胞及其外基質(zhì)中高表達MMP，針對此在藥物遞送系統(tǒng)中引入酶敏感多肽片段，可實現(xiàn)藥物尺寸的變化［9］。本研究合成了MMP-2敏感多肽pep（CPLGVRGC），用于交聯(lián)超小粒徑納米顆粒形成大尺寸遞送系統(tǒng)［10］。該遞送系統(tǒng)的初始尺寸約為200 nm，有利于其通過EPR效應在腫瘤部位積累，一旦它們到達腫瘤部位，在腫瘤組織中高表達的MMP-2刺激下，其轉(zhuǎn)化為尺寸約為10 nm的小粒徑顆粒，實現(xiàn)化療藥物阿霉素（Doxorubicin，DOX）靶向遞送。本研究對所合成材料進行表征，并進一步對其藥物釋放率、體外對小鼠乳腺癌細胞的抑制效果、細胞攝取效果、靶向性以及可行性與安全性進行考察。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

第四代聚酰胺胺聚合物（PAMAM G4，威海晨源分子新材料有限公司）；鹽酸阿霉素（DOX·HCl，阿拉丁試劑有限公司）；無水乙醇、無水甲醇、三乙胺（國藥集團化學試劑有限公司）；溴化噻唑藍四氮唑（MTT，道賽爾生物科技有限公司）；胰酶、RMPI 1640培養(yǎng)基（Gibco，美國）；多肽pep（CPLGVRGC）通過標準固相合成法制備。小鼠乳腺癌細胞4T1購買于中科院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫（上海）。

1.2 主要儀器

AE-31熒光倒置顯微鏡（Motic，德國）；FA1004N 電子分析天平（Sartoriu，德國）；高速冷凍離心機（Effendorf，德國）；MS-H-PRO 型恒溫磁力攪拌器（上海麥淳光生物公司）；真空冷凍干燥機（Labconco，美國）；Zeta size ZS90型粒度測定儀（Malvern，英國）。

1.3 方 法

1.3.1 PAMAM/DOX的制備與表征 稱取20 mg DOX·HCl溶解在甲醇溶液中，加入數(shù)滴三乙胺中和鹽酸釋放出游離的DOX。隨后，調(diào)整DOX和PAMAM的摩爾比，將一定量的 PAMAM水溶液緩慢滴入甲醇中。避光攪拌24 h后，用去離子水（3.5 kDa）透析過夜。最終的納米復合物通過凍干得到一件紅色的產(chǎn)品［11］。通過透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察顆粒的形態(tài)與粒徑，同時將顆粒溶解在新鮮的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）溶液中，使用激光粒度散射儀（dynamic light scattering，DLS）進一步檢測其粒徑與Zeta電位。檢測不同比例下納米復合物的載藥率，通過核磁共振氫譜對化合物的結(jié)構(gòu)進行表征。

1.3.2 PAMAM/DOX的載藥率、包封率測定 稱量10 mg DOX溶于10 mL甲醇溶劑中，配置得到1 mg/mL的DOX甲醇標準溶液，稀釋至100 μg/mL。以甲醇為空白對照，對DOX標準液進行全波段掃描（200~800 nm），確定DOX標準品的最大吸收峰。配置不同濃度梯度的標準品溶液，在DOX的特征吸收波長下測定各濃度DOX溶液的吸光度，繪制DOX 標準樣品的紫外光譜（ultraviolet spectrum，UV）標準曲線。采用紫外可見分管光度計對各納米復合物在479 nm的吸光度進行檢測，并計算其載藥率與包封率。

1.3.3 PAMAM/DOX-pep的制備與表征 4-（N-馬來酰亞胺基甲基）環(huán)己烷羧酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（SMCC）被用來作為交聯(lián)劑，通過MMP-2敏感的多肽pep交聯(lián)PAMAM/DOX形成大粒徑納米顆粒PAMAM/DOX-pep［12］。首先，將SMCC溶解于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中至溶液濃度為10 mg/mL，與 PAMAM/DOX（10 mg/mL）的溶液按1∶5的摩爾比在磁力攪拌的過程中緩慢混合，室溫攪拌30 min。隨后，將多肽pep緩慢滴加到馬來酰胺活化的 PAMAM/DOX中，4 ℃下攪拌過夜得到PAMAM/DOX-pep。最后，通過離心過濾裝置超濾除去多余的小分子原料并凍干。使用1H核磁共振對產(chǎn)品進行分析；使用Nano-ZS90 Malvern儀器在25 ℃下測量平均粒徑和Zeta電位，同時通過TEM觀察納米顆粒的形態(tài)和尺寸大小。

1.3.4 各納米復合物的藥物釋放率 將2 mL PAMAM/DOX和PAMAM/DOX-pep的PBS溶液（500 μg/mL）加入透析袋（3.5 kDa），浸沒在pH值為5.0或7.4的PBS 溶液中，37 ℃下緩慢攪動透析。每隔4 h，收集釋放的DOX并通過UV-Vis光譜分析來測量釋放的DOX的濃度。將等體積的新鮮PBS補充到釋放介質(zhì)中，以保持溶液的體積不變。

1.3.5 PAMAM/DOX-pep的溶血率 取新鮮兔血5 mL，加入5 mL生理鹽水反復洗滌、離心，直至上清略黃且無血色，棄去上清，取0.2 mL底物稀釋至10 mL，得到2%的紅細胞懸液。將PAMAM/DOX-pep溶于PBS溶液至濃度為10 mg/mL，稀釋后得到一系列濃度梯度的納米復合物溶液（10、20、50、100、200、500 μg/mL）。取等體積的納米制劑與紅細胞溶液共孵育，并設(shè)置陰性（PBS）和陽性（純水）對照。37 ℃下孵育3 h后，通過離心（3 000 rpm，10 min）除去完整的紅細胞。取上清液檢測各處理組541 nm處的吸光度，通過以下公式進行計算以獲得溶血率（HR%）：HR%=（At-Anc）/（Apc-Anc）×100，其中At、Anc和Apc分別是測試樣品，陰性對照和陽性對照的吸光度值。

1.3.6 PAMAM/DOX-pep的體外穩(wěn)定性 為了研究納米集簇的穩(wěn)定性，將PAMAM/DOX-pep置于含有10% 胎牛血清的PBS溶液中，并在4 ℃的黑暗環(huán)境下儲存7天，每24 h取適量溶液稀釋至1 mL，通過納米粒度儀檢測其粒徑，以評價納米顆粒的體外穩(wěn)定性。

1.3.7 各納米復合物的靶向性 當4T1細胞匯合度為80%~90%時，消化離心，收集細胞懸液接種于含有細胞爬片的24孔板內(nèi)。孵育24 h后，棄培養(yǎng)基，將 Free DOX、PAMAM/DOX-pep、PAMAM/DOX-pep（MMP）分別溶解于無血清RMPI 1640培養(yǎng)基中并加入到24孔板中，孵育4 h。隨后，棄培養(yǎng)基，用PBS溫和洗滌3次，每孔加入預冷的300 μL 4 %多聚甲醛固定30 min。棄多聚甲醛，用PBS溫和搖動潤洗 5 次后，每孔加入200 μL DAPI（4，6-diamino-2-phenyl indole，4，6-二氨基-2-苯基吲哚）孵育5 min對細胞核進行染色。PBS溫和搖動潤洗5次洗去多余的核染液后，取出細胞爬片，滴加5 μL防淬滅封片液后倒扣于載玻片上，在共聚焦顯微鏡下觀察細胞攝取情況。取對數(shù)期細胞接種于12孔板中，以同樣的方式處理細胞，收集并通過流式細胞儀定量分析細胞攝取情況。

1.3.8 各納米復合物的體外抗腫瘤效果 離心收集4T1細胞細胞懸液接種于96孔板中（每孔1 000~2 000個細胞），37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。將DOX、PAMAM/DOX、PAMAM/DOX-pep溶于完全培養(yǎng)基中，使DOX 的濃度分別達到0.05 μg/mL、0.5 μg/mL、2.5 μg/mL和5 μg/mL，配置成不同濃度的納米制劑。設(shè)置陽性對照組（僅添加細胞）和陰性對照組（僅添加培養(yǎng)基），每一組設(shè)置5個平行孔。在37 ℃和5% CO2培養(yǎng)24 h后，避光加入20 μg MTT（溶解于PBS，5 mg/mL）和80 μg無血清RMPI 1640培養(yǎng)基，避光孵育4 h。吸出上清，每孔加入150 μL DMSO，低速震搖20 min后，用酶標儀在490 nm處檢測吸光度并計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（AX-A0）/（AC-A0）×100，其中AX為加藥組的吸光度、AC為陽性對照組、A0為陰性對照組），采用Graphpad prism軟件計算DOX的IC50（半抑制濃度）。

1.4 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21. 0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 PAMAM/DOX的表征、載藥率與包封率

將DOX物理包埋于PAMAM的疏水空腔內(nèi)部，形成PAMAM/DOX。通過紫外分光光度計進行檢測，當DOX與PAMAM的摩爾比為30∶1時，納米顆粒的載藥率為23.53%，最適宜用做載藥，選取這一比例下形成的PAMAM/DOX進行后續(xù)實驗（表1）。TEM與粒度儀檢測顯示，納米顆粒的尺寸約為10 nm（圖1a）。TEM 結(jié)果顯示（圖1b），納米顆粒呈圓形，其內(nèi)部疏水空間清晰可見，分散性良好。

圖1 PAMAM/DOX 的DLS 粒徑（A）與TEM 圖（B）

表1 不同比例PAMAM/DOX的粒徑、電位與載藥率

2.2 PAMAM/DOX-pep的表征

PAMAM表面包含大量氨基結(jié)構(gòu)，易于化學修飾。本研究使用SMCC作為交聯(lián)劑，將多肽pep中的半胱氨酸上的巰基與PAMAM上的氨基綴合，以獲得大尺寸的納米顆粒PAMAM/DOX-pep，1H NMR譜圖見圖2，PAMAM/DOX的特征峰δ分別為2.45、2.61、2.81、3.28 ppm，而δ = 8.5 ppm處形成的新峰代表多肽的成功連接。通過TEM觀察納米顆粒PAMAM/DOX-pep，其外觀呈球狀，表面小顆粒立體可見，粒徑約為200 nm（圖3A），與DLS檢測一致（圖3B），電位為-0.3 mV（圖4）。粒徑與Zeta電位的變化也印證了大粒徑納米顆粒的成功合成。

圖2 PAMAM/DOX 和PAMAM/DOX-pep 的核磁共振氫譜

圖3 PAMAM/DOX-pep 的TEM 圖（A）與DLS 粒徑（B）

圖4 PAMAM/DOX-pep 的電位

2.3 DOX的釋放率

將PAMAM@DOX和PAMAM/DOX-pep分別置于pH為7.4和5.0下的 PBS透析液中，以考察化療藥物DOX釋放效率。兩種納米顆粒在不同pH下均表現(xiàn)出一定的緩釋能力，大粒徑的PAMAM/DOX-pep最佳，小尺寸的PAMAM/DOX次之（圖5）。當pH為7.4時，PAMAM/DOX、和PAMAM/DOX-pep的藥物釋放率分別為41%和33%；這說明由于多肽具有豐富的側(cè)鏈功能化位點、多樣的親疏水性以及能夠形成穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)的能力，其修飾后有效延緩了藥物的釋放。當pH為5.0時，PAMAM/DOX和PAMAM/DOX-pep的藥物釋放率分別為79%和68%。

圖5 PAMAM/DOX 和PAMAM/DOX-pep 的藥物釋放率

2.4 PAMAM/DOX-pep的溶血率

通過溶血實驗研究PAMAM/DOX和PAMAM/DOX-pep納米顆粒的血液生物相容性。結(jié)果表明，納米顆粒的溶血率存在一定劑量依賴性。隨著納米集簇濃度的增加，其溶血率也略有增加，其中，PAMAM/DOX-pep的溶血率略低于PAMAM/DOX，見圖6。多肽修飾后PAMAM/DOX-pep溶血率在500 μg/mL下。溶血率仍小于5%，可能的原因是多肽修飾后的納米顆粒正電位降低，從而降低了溶血率。

圖6 PAMAM/DOX 和PAMAM/DOX-pep 的溶血率（n=3）

2.5 PAMAM/DOX-pep的體外穩(wěn)定性

通過馬爾文粒度儀檢測粒徑來確定納米顆粒的體外穩(wěn)定性?？傮w來說，PAMAM/DOX-pep的粒徑在7天內(nèi)均無顯著變化，較為穩(wěn)定，見圖7。而從第5天開始，PAMAM/DOX的粒徑增加，發(fā)生團聚，而PAMAM/DOX-pep依舊保持穩(wěn)定。

圖7 PAMAM/DOX 和PAMAM/DOX-pep 體外7 天內(nèi)的粒徑變化（n=3）

2.6 腫瘤細胞對納米顆粒的攝取行為

使用流式細胞術(shù)檢測各納米制劑的細胞攝取，結(jié)果見圖8。相比于游離DOX，多肽交聯(lián)后形成的大粒徑納米顆粒PAMAM/DOX-pep的細胞攝取量有所增加，但主要集中在細胞質(zhì)中，與細胞核重疊度不高（圖8B）。而PAMAM/DOX與MMP-2共孵育的PAMAM/DOX-pep細胞攝取量顯著提高，可見小粒徑納米顆粒的細胞攝取優(yōu)于大尺寸納米顆粒。同時，酶分解后的納米顆粒小攝取量高于小顆粒PAMAM/DOX，這可能是多肽的修飾改變了其表面電位基團，促進其入胞。通過共聚焦顯微鏡（CLSM）對各納米制劑的細胞攝取情況進行直觀的觀察，結(jié)果與流式細胞術(shù)一致（圖8a，c）。PAMAM/DOX-pep處理過的細胞藥物熒光強度更高，攝取量更多。且Merge圖中，DOX紅色熒光與細胞核藍色熒光相重疊，這說明尺寸可變納米集簇有助于藥物富集在腫瘤細胞核位置。

圖8 各納米制劑處理后4T1 細胞的藥物攝取情況

圖9 DOX、PAMAM/DOX 和PAMAM/DOX-pep 對細胞的毒性（n=5）

2.7 PAMAM/DOX-pep的體外抗腫瘤效果

采用MTT法檢測各納米復合物的體外抗腫瘤效果，作用24 h后，各制劑對細胞均有一定程度的損傷，且呈劑量依賴性。DOX對4T1細胞的IC 50為0.62 μg/mL，相比于游離DOX，PAMAM包載后增加了DOX的細胞攝取量，從而增加了細胞毒性。

3 討 論

本研究構(gòu)建了腫瘤微環(huán)境響應型納米遞送系統(tǒng)PAMAM/DOX-pep，并對其理化性質(zhì)，以及通過尺寸縮小克服體內(nèi)生物學障礙實現(xiàn)靶向遞送的可行性在小鼠乳腺癌細胞模型中進行研究。該納米遞送系統(tǒng)的初始尺寸為200 nm，適宜通過EPR效應在腫瘤部位蓄積；到達腫瘤部位后，多肽pep被腫瘤部位高表達的MMP-2裂解，PAMAM/DOX-pep分解為尺寸約為10 nm的PAMAM/DOX，實現(xiàn)靶向藥物遞送。由于腫瘤部位的 pH 低于正常組織，納米顆粒酸性條件下的高藥物釋放率有助于腫瘤部位靶向藥物釋放，從而提高抗腫瘤作用。結(jié)果表明，大粒徑納米顆粒PAMAM/DOX-pep更有助于化療藥物DOX的緩釋與低pH下的靶向釋放。此外，多肽pep的修飾可以在一定程度改善納米顆粒的體內(nèi)穩(wěn)定性，有助于維持納米顆粒在體內(nèi)的長循環(huán)，納米顆粒在體外7天內(nèi)較為穩(wěn)定；在實驗所需的特定濃度下可以忽略PAMAM/DOX-pep的溶血性能，該材料血液相容性良好，可以認為其安全低毒，適合用于靜脈給藥。體外模擬PAMAM/DOXpep被分解并探究其在4T1細胞攝取量的實驗中，PAMAM/DOX-pep與MMP共孵育后細胞攝取量提高，靶向性增加。在對乳腺癌細胞的細胞毒性與抗腫瘤效果中，多肽pep修飾過的大粒徑納米顆粒細胞毒性略低于PAMAM/DOX，側(cè)面印證了小粒徑納米顆粒的細胞攝取量較高，從而引發(fā)了更高的細胞毒性。這些結(jié)果為下一步的體內(nèi)外抗腫瘤研究奠定基礎(chǔ)，并為設(shè)計與構(gòu)建新型藥物遞送系統(tǒng)實現(xiàn)高效低毒的精準靶向給藥策略提供了方向和依據(jù)。