高 瑩，王本偉，逯海燕，宋真真

（1. 濟(jì)南市人民醫(yī)院，山東 濟(jì)南 271100；2. 山東安捷生物檢測技術(shù)有限公司，山東 濟(jì)南 250101；3. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101）

人參為五加科植物人參（Panax ginsengC. A.Mey. ）的干燥根和根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其味甘，微苦，微溫，歸脾，肺，心，腎經(jīng)；具有大補(bǔ)元?dú)猓瑥?fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肺，生津養(yǎng)血，安神益智等功效[1]。人參的化學(xué)成分主要有人參皂苷、人參多糖、甾醇及其苷、蛋白質(zhì)、黃酮類、礦物質(zhì)和維生素等[2]。其中人參多糖是其最主要的藥效成分之一，藥理學(xué)研究表明，人參多糖有調(diào)節(jié)免疫、降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗氧化和抗衰老等作用[3-9]。由于單糖組分是多糖發(fā)揮藥效的關(guān)鍵，因此單糖組分檢測在人參多糖質(zhì)量控制方面有重要作用。單糖極性較強(qiáng)，結(jié)構(gòu)相近，且缺乏光學(xué)活性，因此為了改善其分離度和提高檢測靈敏度，通常采用三氟乙酸（TFA）水解多糖后，加入1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）進(jìn)行柱前衍生化，然后進(jìn)行高效液相色譜法（HPLC）分析[10-13]。本研究采用快速溶劑萃取方法（ASE）提取人參多糖，然后采用TFA水解-PMP柱前衍生化對人參中多糖組成進(jìn)行HPLC指紋圖譜分析和相對含量研究，并對11批人參多糖進(jìn)行聚類分析，為人參中多糖的質(zhì)量控制研究提供參考。

1 儀器與試劑

Agilent 1260高效液相色譜儀（HPLC，安捷倫），包括G1379B型脫氣機(jī)，G1312B型二元輸液泵，G1367E型自動進(jìn)樣器，G1316A型柱溫箱，G1314F型VWD檢測器及Chemstation數(shù)據(jù)采集軟件；賽默飛Dionex? ASE? 350快速溶劑萃取儀（ASE350，賽默飛世爾）；電子天平（XSE 105DU，梅德勒托利多）；高速冷凍離心機(jī)（5810R，Eppendorf）；Milli-Q超純水機(jī)（Advantage A10，默克化工）；恒溫水浴鍋（HH-4，常州歐邦電子）；渦旋儀[Vortex Genius 3，艾卡（廣州）]。

半乳糖醛酸（批號：111646-201702，含量：95.1 %），葡萄糖（批號：110833-202109，含量：99.9 %），半乳糖（批號：100226-201807，含量：100 %）（中國食品藥品檢定研究院）；鼠李糖（批號：R108982，含量：99 %），阿拉伯糖（批號：A115318，含量：100 %）（上海阿拉?。?；TFA（批號：210231，色譜純，F(xiàn)isher scientific）；PMP（批號：P109105，含量：99 %，上海阿拉丁）；乙腈（批號：214451，色譜純，F(xiàn)isher scientific）；甲醇（批號：216565，色譜純，F(xiàn)isher scientific）；水，Advantage A10 Milli-Q超純水機(jī)制備的超純水；其他試劑為分析純。11批人參藥材購自吉林?。ㄅ枺篐J191001，HJ191021，HJ200911，HJ200918，HJ200925，BG-20-07-09，BG-20-10-03，BG-21-4-11，BG-21-4-12，BG-19-2-11，BG-19-4-10。編號分別為S1-S11）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-磷酸鹽緩沖液[0.1 mol/L，pH 6.7，19:81（V/V）]；柱溫：30 ℃；檢測波長：245 nm；流速：1.0 ml/min；進(jìn)樣體積：20 μl；分析時間：40 min。

2.2 對照品儲備液配制

精密稱取鼠李糖，半乳糖醛酸，葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖適量分別置入10 ml量瓶，加超純水稀釋至刻度，得濃度均為2.0 mg/ml單糖對照品儲備液。

2.3 人參多糖溶液制備

取本品粉末（20～40目）1.0 g，置入10 ml不銹鋼萃取池，萃取池的下端加裝纖維濾膜，設(shè)置萃取參數(shù)（提取溫度：120 ℃；沖洗體積：70 %；壓力：1500 Psi；循環(huán)次數(shù)：1次；靜態(tài)萃取時間：6 min；氮?dú)獯祾邥r間：1 min），用75 %乙醇萃取，萃取液置入25 ml量瓶，用無水乙醇定容至刻度后轉(zhuǎn)移至離心管，2～8 ℃冰箱放置24 h后，4000 r/min離心20 min，棄去上清，沉淀加80 %乙醇洗滌，4000 r/min離心20 min，棄去上清，沉淀用無水乙醇洗滌，4000 r/min離心20 min，棄去上清，最后沉淀加水溶解并轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶定容，搖勻，即得人參多糖溶液。

2.4 人參多糖水解及衍生化

精密量取人參多糖溶液0.5 ml置入5 ml安剖瓶，加入1.0 ml 2 mol/L TFA，熔封后100 ℃水浴加熱6 h，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，加2 ml甲醇，蒸干，重復(fù)3次，以除去TFA。加入1 ml超純水溶解，搖勻，取100 μl置入10 ml具塞玻璃管，加0.6 mol/L氫氧化鈉溶液100 μl，0.5 mol/L PMP甲醇溶液200 μl，混勻，70 ℃水浴反應(yīng)120 min；取出放冷，加200 μl的0.3 mol/L鹽酸中和，然后加900 μl超純水，加入1.5 ml氯仿萃取，4000 r/min離心10 min，棄氯仿相，依法萃取3次，再用0.5 ml超純水洗滌玻璃管2次，合并水相，置入蒸發(fā)皿，50 ℃水浴條件下蒸干，殘留物精密加入1 ml超純水溶解，混勻，轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，13200 r/min離心5 min，取上清，即得。

2.5 人參多糖指紋圖譜的構(gòu)建和評價(jià)

2.5.1 精密度 取人參藥材粉末適量，按2.3項(xiàng)方法制備人參多糖溶液，然后按2.4項(xiàng)和2.1項(xiàng)條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。以葡萄糖峰為參照峰，考察各色譜峰的相對峰面積和相對保留時間的一致性。結(jié)果：各色譜峰相對保留時間的變異系數(shù)均小于0.9 %，相對峰面積的變異系數(shù)均小于1.7 %，表明儀器的精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性 取人參藥材粉末適量，按2.3項(xiàng)制備人參多糖溶液，然后按2.4項(xiàng)和2.1項(xiàng)條件，分別于0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以葡萄糖峰為參照峰，考察各色譜峰的相對峰面積和相對保留時間的一致性。結(jié)果：各色譜峰相對保留時間的變異系數(shù)均小于1.0 %，相對峰面積的變異系數(shù)均小于2.5 %。表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性 取人參藥材粉末6份，按2.3項(xiàng)制備人參多糖溶液，然后按2.4項(xiàng)和2.1項(xiàng)條件，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以葡萄糖峰為參照峰，評價(jià)各色譜峰的相對峰面積和相對保留時間的一致性。結(jié)果：各色譜峰相對保留時間的變異系數(shù)均小于1.5 %，相對峰面積的變異系數(shù)均小于3.0 %，由于半乳糖醛酸在提取過程中容易降解，其相對峰面積的變異系數(shù)為6.5 %。

2.5.4 指紋圖譜的建立及共有峰的確認(rèn) 取單糖混合對照品溶液，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖；取11批人參藥材粉末，按2.3項(xiàng)制備人參多糖溶液，然后按2.4項(xiàng)和2.1項(xiàng)條件，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖?；旌蠈φ掌飞V圖和供試品色譜圖見圖1。

圖1 5種單糖的HPLC色譜圖

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”（2012年版）對11批不同人參多糖指紋圖譜建立共有模式，做出對照指紋圖譜。11批人參多糖的指紋圖譜疊加見圖2。

圖2 11批人參多糖樣品的 HPLC 指紋圖譜

以葡萄糖色譜峰為參照，標(biāo)定出5個共有峰，生成對照指紋圖譜。經(jīng)與對照品相比較，歸屬了5個單糖，確定2，3，4，5，6號共有峰分別為鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖。與葡萄糖的相對保留時間分別為0.716，0.832，1.000，1.129，1.229。

2.6 聚類分析

以11批人參多糖樣品的5個共有峰的相對峰面積為變量，采用組間對比法結(jié)合平方歐氏距離進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，11批人參多糖共聚為三大類：第一類為S1，S2，S3，S5，S7，S9，第二類為S4，S6，S11，第三類為S8和S10。

2.7 相似度計(jì)算

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”（2012版，國家藥典委員會）對11批不同人參多糖建立對照指紋圖譜，將11批人參多糖圖譜與其進(jìn)行比較，計(jì)算相似度。11批人參多糖的相似度均大于0.90，相似度計(jì)算結(jié)果見表1。

表1 人參多糖相似度計(jì)算結(jié)果

2.8 人參多糖中單糖成分的含量測定

2.8.1 線性關(guān)系考察 取單糖對照品儲備液，用超純水稀釋成6個不同濃度的混合對照品溶液，取100 μl對照品溶液置入10 ml具塞玻璃管，加0.6 mol/L氫氧化鈉溶液100 μl，0.5 mol/L PMP甲醇溶液200 μl，混勻，70 ℃水浴反應(yīng)120 min；取出放冷，加200 μl的0.3 mol/L鹽酸中和，然后加900 μl超純水，加入1.5 ml氯仿渦旋，4000 r/min離心10 min，棄氯仿相，依法萃取3次，再用0.5 ml超純水洗滌玻璃管2次，合并水相，置入蒸發(fā)皿，50 ℃水浴條件下蒸干，殘留物精密加入1 ml超純水溶解，混勻，轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管中，13200 r/min離心5 min，取上清進(jìn)樣分析。以濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線性回歸分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見表2。

2.8.2 精密度 取人參藥材粉末（S6）適量，按2.3項(xiàng)制備人參多糖溶液，然后按2.4項(xiàng)和2.1項(xiàng)條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，并計(jì)算峰面積的變異系數(shù)。結(jié)果表明，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD分別為1.4 %，1.6 %，0.3 %，0.8 %，0.8 %，表明該儀器的精密度良好。

2.8.3 穩(wěn)定性 取人參藥材粉末（S6）適量，按2.3項(xiàng)制備人參多糖溶液，然后按2.4項(xiàng)和2.1項(xiàng)條件，分別于0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并計(jì)算峰面積的變異系數(shù)。結(jié)果表明，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD分別為1.8 %，2.5 %，1.1 %，1.0 %，1.7 %，表明供試品溶液衍生化后在室溫條件下放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.8.4 重復(fù)性 取人參藥材粉末（S6）6份，按2.3項(xiàng)制備人參多糖溶液，然后按2.4項(xiàng)和2.1項(xiàng)條件，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并計(jì)算峰面積的變異系數(shù)。結(jié)果表明，鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD分別為2.8 %，6.5 %，2.4 %，2.9 %，2.4 %，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.8.5 加樣回收率 取已知含量的人參藥材粉末（S6）6份，分別按已知含量相同的量加入單糖對照品，按2.3項(xiàng)制備人參多糖溶液，然后按2.4項(xiàng)和2.1項(xiàng)條件，進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并計(jì)算各單糖成分的回收率。結(jié)果表明鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的平均回收率分別為104.8 %，92.6 %，96.4 %，105.3 %，96.6 %，回收率的RSD分別為2.6 %，5.4 %，2.7 %，2.5 %，2.2 %，表明本方法的加樣回收率良好。

2.8.6 含量測定 取11批人參藥材粉末適量，按2.3項(xiàng)制備人參多糖溶液，然后按2.4項(xiàng)和2.1項(xiàng)條件，進(jìn)樣分析，測定不同樣品中鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的含量。結(jié)果鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的含量分別為0.148，1.236，3.373，0.558，0.549 mg/g。含量測定結(jié)果見表3。

表3 人參多糖中單糖含量/mg·g-1（n=3）

3 討論

3.1 水解條件的選擇

多糖水解是檢測單糖的關(guān)鍵步驟，硫酸水解法采用高濃度硫酸易導(dǎo)致多糖炭化，出現(xiàn)較多雜峰，低濃度硫酸水解效果較差，導(dǎo)致分析結(jié)果偏差。因此，采用TFA水解，并嚴(yán)格控制水解條件。

TFA的濃度分別考察了1，1.5，2，2.5，3 mol/L，水解時間分別考察了2，4，6，8，12 h，通過綜合評價(jià)各單糖的峰面積及各單糖峰面積之和選擇最佳水解條件。結(jié)果表明選擇2 mol/L的TFA，水解6 h人參多糖基本水解完全，因此選擇2 mol/L的TFA，水解6 h作為最終水解條件。

3.2 衍生化條件的選擇

PMP是一種弱酸性的化合物，在堿性條件下可與還原糖的醛基定量反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)烈的紫外吸收，而且糖鏈的其他部位不會被破壞，過量的試劑易于除去，衍生化產(chǎn)物非常穩(wěn)定，無立體異構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)主要考察了衍生化時間和溫度。

衍生化時間分別考察了0.5，1，2，3，4 h，衍生化溫度分別考察了30，50，70，90 ℃，通過綜合評價(jià)各單糖的峰面積及各單糖峰面積之和選擇最佳衍生化條件。結(jié)果表明PMP在70 ℃衍生化2 h各單糖的峰面積最大，因此選擇70 ℃，衍生化2 h作為最終衍生化條件。

3.3 指紋圖譜及含量測定結(jié)果分析

中藥指紋圖譜的構(gòu)建和評價(jià)對于提高中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，促進(jìn)中藥現(xiàn)代化具有非常重要的意義。本研究建立了11批人參多糖的指紋圖譜，通過分析發(fā)現(xiàn)，11批樣品的相似度均大于0.90，表明不同批次的人參多糖化學(xué)組成基本相同。通過和對照品的色譜圖比對，共確認(rèn)了5種成分，分別為鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖。為進(jìn)一步比較不同批次人參藥材的質(zhì)量差異，本研究建立了鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖5種單糖成分的含量測定方法。含量測定結(jié)果表明葡萄糖的含量最高，約占5種單糖總含量的50 %以上，總體而言，不同批次的人參藥材單糖含量基本一致，表明不同批次的人參藥材質(zhì)量穩(wěn)定可控。

綜上所述，本研究成功建立了人參多糖的指紋圖譜，并測定了鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖5種單糖成分的含量，所建的方法具有分離效率高、分析時間短、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)。可用于人參多糖成分的質(zhì)量控制。