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        高效液相色譜法測定杜仲葉中4種成分含量

        2023-11-07 04:42:44黃繼紅
        食品與藥品 2023年5期

        黃繼紅

        (湘西土家族苗族自治州食品藥品檢驗所,湖南 吉首 416000)

        杜仲(Eucommia ulmoidesOliv.)為杜仲科植物,《中華人民共和國藥典》2020年版一部記載,杜仲葉(杜仲科植物杜仲的干燥葉),具有補肝腎、強筋骨功能,并確定綠原酸為杜仲葉藥材的主要藥用有效成分,綠原酸含量不得少于0.08 %[1]。研究表明,杜仲葉中含有木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、黃酮類等多種化合物[2-5],杜仲葉或其提取物具有抗氧化、抗炎殺菌、降血壓、降血脂、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老等作用[4-10]。本文建立了高效液相色譜法(HPLC)同時測定杜仲葉中綠原酸、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、異槲皮苷4種成分含量的分析方法,通過檢測武陵山區(qū)3處種植基地杜仲葉中不同采收時間4種活性成分含量數(shù)據(jù),為分析不同提取物的最佳采收期提供技術(shù)和數(shù)據(jù)參考。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器與設(shè)備

        LC-20AT高效液相色譜儀(SPD-M20A光電二極管陣列紫外可見光檢測器,日本島津),KQ5200V型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司),TG16-II醫(yī)用離心機(湖南平凡科技),ML304T /02電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)]。

        1.2 材料與試劑

        桃葉珊瑚苷對照品(純度≥98 %,批號:MUST-21100811,成都曼思特)、京尼平苷酸對照品(純度≥98 %,批號:MUST-21062003,成都曼思特)、綠原酸(純度99.7 %,批號:21081161,壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)、異槲皮苷對照品(純度≥98 %,批號:MUST-21041613,成都曼思特);甲醇、乙腈、磷酸,色譜純。

        1.3 試驗樣品

        武陵山區(qū)3處種植基地的新鮮杜仲葉,于2021年7~11月每月采集一批次,60 ℃低溫烘干,粉碎過篩后,陰涼干燥處保存。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 方法

        2.1.1 對照品溶液的配制 稱取適量桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸,異槲皮苷(精確至0.0001 g),加入70 %甲醇水溶液超聲溶解,定容,配制成桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、異槲皮苷濃度分別為1.02,1.06,1.05,1.07 mg/ml的混合對照品儲備溶液。

        2.1.2 色譜條件 色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);柱溫:30 ℃;檢測器波長范圍:190~400 nm,檢測波長:桃葉珊瑚苷200 nm、京尼平苷酸238 nm、綠原酸326 nm、異槲皮苷354 nm;流動相:0.1 %磷酸水溶液(A)、乙腈(B),流速:1 ml/min;進(jìn)樣量:10 μl。

        表1 不同時間段的流動相梯度

        2.1.3 檢測波長的選擇 對照品經(jīng)HPLC分離和單個對照品以出峰時間定位后,對不同濃度的桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、異槲皮苷色譜峰在190~400 nm區(qū)間吸收光譜圖分析比較,并考慮樣品的實際檢測情況,對4種成分選取了各自適合的檢測波長:桃葉珊瑚苷200 nm、京尼平苷酸238 nm、綠原酸326 nm、異槲皮苷354 nm,對照品4種檢測波長比較見圖1。

        圖1 對照品4種檢測波長比較圖

        2.1.4 樣品前處理方法 稱取制備好的樣品約0.5 g置入50 ml離心管,加入25 ml 70 %甲醇水溶液,混勻,50 ℃超聲波提取30 min,冷卻至室溫,5000 r/min離心5 min,取上清適當(dāng)稀釋后過0.45 μm有機微孔濾膜,待測。

        2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

        取2.1.1項混合對照品儲備溶液適量,用70 %甲醇水溶液稀釋成桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸,異槲皮苷質(zhì)量濃度分別為51,53,52.5,53.5 μg/ml的中間液,再用70 %甲醇水溶液稀釋成質(zhì)量濃度為中間液質(zhì)量濃度的1.0,0.4,0.2,0.1,0.04,0.02倍的6個不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。按2.1.2項條件進(jìn)樣分析,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,各成分在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系,且分離效果良好,線性關(guān)系結(jié)果見表2,混合對照品和杜仲葉樣品色譜圖(波長:200 nm)見圖2。

        圖2 混合對照品和杜仲葉樣品液相色譜圖(波長:200nm)

        表2 杜仲葉中4種成分標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系

        2.3 重復(fù)性試驗

        稱取同一批次的杜仲葉樣品6份,按2.1.2項和2.1.4項下方法對樣品進(jìn)行前處理和進(jìn)樣分析,根據(jù)各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析,檢測含量結(jié)果以干基計,計算各成分含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果,桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、異槲皮苷平均含量分別為17.09,8.28,38.17,3.49 mg/g,RSD分別為2.08 %,3.60 %,0.48 %和0.68 %,表明方法重復(fù)性較好。

        2.4 待測溶液穩(wěn)定性試驗

        取杜仲葉樣品,按2.1.2項和2.1.4項下方法對樣品進(jìn)行前處理和進(jìn)樣分析,每6 h進(jìn)一次樣,持續(xù)24 h,記錄各成分的峰面積,并計算各成分峰面積RSD,桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、異槲皮苷峰面積RSD分別為0.82 %,0.13 %,0.10 %,0.42 %,表明樣品待測液在24 h內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

        2.5 加標(biāo)回收試驗

        稱取已測桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、異槲皮苷4種成分含量分別為3.04,0.93,2.77,0.46 mg/g的同一批次的杜仲葉樣品6份,每份約0.5 g,分別加入混合對照品溶液(按2.1.1 項下方法配制的桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸,異槲皮苷質(zhì)量濃度分別為1.49,0.93,1.30,0.70 mg/ml的混合對照品溶液)0.5 ml和70 %甲醇水溶液24.5 ml,按2.1.2項和2.1.4項下方法對樣品進(jìn)行前處理和進(jìn)樣分析,計算各成分的加標(biāo)回收率。結(jié)果表明,桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、異槲皮苷的加標(biāo)回收率分別為99.96 %,99.40 %,95.03 %,95.46 %,RSD分別為3.33 %,2.13 %,2.82 %,1.31 %。

        2.6 樣品檢測

        稱取1.3項下杜仲葉樣品約0.5 g,按2.1.2項和2.1.4項下方法對樣品進(jìn)行前處理和進(jìn)樣分析,含量結(jié)果以干基計,結(jié)果見表3。由表3可見,杜仲葉樣品中4種成分總體上含量高低依次為綠原酸、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸和異槲皮苷,綠原酸含量相對穩(wěn)定,含量為19.32~52.55 mg/g。桃葉珊瑚苷和京尼平苷酸采集時間不同含量差別較大,含量分別為2.87~40.79和1.17~24.98 mg/g。異槲皮苷的含量相對較少,含量為2.55~9.83 mg/g。在不同的采收時期,綠原酸和異槲皮苷含量相對穩(wěn)定,桃葉珊瑚苷和京尼平苷酸含量差別較大。綠原酸和異槲皮苷在11月份含量最高,桃葉珊瑚苷和京尼平苷酸在9月份含量最高。

        表3 杜仲葉樣品檢測結(jié)果表(n=3)

        3 結(jié)論

        本文建立了一種同時測定杜仲葉樣品中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、異槲皮苷4種成分的試驗方法,4種成分在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系;此法重復(fù)性好、回收率高、樣品前處理操作簡單,適合多批次樣品連續(xù)進(jìn)樣。對武陵山區(qū)種植杜仲基地采收樣品檢測結(jié)果表明,杜仲葉樣品中4種成分總體上含量高低依次為綠原酸、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸和異槲皮苷,桃葉珊瑚苷和京尼平苷酸在9月份含量最高,綠原酸和異槲皮苷在11月份含量最高。

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