黃繼紅

（湘西土家族苗族自治州食品藥品檢驗所，湖南 吉首 416000）

杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.）為杜仲科植物，《中華人民共和國藥典》2020年版一部記載，杜仲葉（杜仲科植物杜仲的干燥葉），具有補肝腎、強筋骨功能，并確定綠原酸為杜仲葉藥材的主要藥用有效成分，綠原酸含量不得少于0.08 %[1]。研究表明，杜仲葉中含有木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、黃酮類等多種化合物[2-5]，杜仲葉或其提取物具有抗氧化、抗炎殺菌、降血壓、降血脂、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老等作用[4-10]。本文建立了高效液相色譜法（HPLC）同時測定杜仲葉中綠原酸、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、異槲皮苷4種成分含量的分析方法，通過檢測武陵山區(qū)3處種植基地杜仲葉中不同采收時間4種活性成分含量數(shù)據(jù)，為分析不同提取物的最佳采收期提供技術(shù)和數(shù)據(jù)參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀（SPD-M20A光電二極管陣列紫外可見光檢測器，日本島津），KQ5200V型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司），TG16-II醫(yī)用離心機（湖南平凡科技），ML304T /02電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）]。

1.2 材料與試劑

桃葉珊瑚苷對照品（純度≥98 %，批號：MUST-21100811，成都曼思特）、京尼平苷酸對照品（純度≥98 %，批號：MUST-21062003，成都曼思特）、綠原酸（純度99.7 %，批號：21081161，壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）、異槲皮苷對照品（純度≥98 %，批號：MUST-21041613，成都曼思特）；甲醇、乙腈、磷酸，色譜純。

1.3 試驗樣品

武陵山區(qū)3處種植基地的新鮮杜仲葉，于2021年7～11月每月采集一批次，60 ℃低溫烘干，粉碎過篩后，陰涼干燥處保存。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 對照品溶液的配制 稱取適量桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸，異槲皮苷（精確至0.0001 g），加入70 %甲醇水溶液超聲溶解，定容，配制成桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、異槲皮苷濃度分別為1.02，1.06，1.05，1.07 mg/ml的混合對照品儲備溶液。

2.1.2 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；檢測器波長范圍：190～400 nm，檢測波長：桃葉珊瑚苷200 nm、京尼平苷酸238 nm、綠原酸326 nm、異槲皮苷354 nm；流動相：0.1 %磷酸水溶液（A）、乙腈（B），流速：1 ml/min；進(jìn)樣量：10 μl。

表1 不同時間段的流動相梯度

2.1.3 檢測波長的選擇 對照品經(jīng)HPLC分離和單個對照品以出峰時間定位后，對不同濃度的桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、異槲皮苷色譜峰在190～400 nm區(qū)間吸收光譜圖分析比較，并考慮樣品的實際檢測情況，對4種成分選取了各自適合的檢測波長：桃葉珊瑚苷200 nm、京尼平苷酸238 nm、綠原酸326 nm、異槲皮苷354 nm，對照品4種檢測波長比較見圖1。

圖1 對照品4種檢測波長比較圖

2.1.4 樣品前處理方法 稱取制備好的樣品約0.5 g置入50 ml離心管，加入25 ml 70 %甲醇水溶液，混勻，50 ℃超聲波提取30 min，冷卻至室溫，5000 r/min離心5 min，取上清適當(dāng)稀釋后過0.45 μm有機微孔濾膜，待測。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取2.1.1項混合對照品儲備溶液適量，用70 %甲醇水溶液稀釋成桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸，異槲皮苷質(zhì)量濃度分別為51，53，52.5，53.5 μg/ml的中間液，再用70 %甲醇水溶液稀釋成質(zhì)量濃度為中間液質(zhì)量濃度的1.0，0.4，0.2，0.1，0.04，0.02倍的6個不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。按2.1.2項條件進(jìn)樣分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，各成分在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系，且分離效果良好，線性關(guān)系結(jié)果見表2，混合對照品和杜仲葉樣品色譜圖（波長：200 nm）見圖2。

圖2 混合對照品和杜仲葉樣品液相色譜圖（波長：200nm）

表2 杜仲葉中4種成分標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系

2.3 重復(fù)性試驗

稱取同一批次的杜仲葉樣品6份，按2.1.2項和2.1.4項下方法對樣品進(jìn)行前處理和進(jìn)樣分析，根據(jù)各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，檢測含量結(jié)果以干基計，計算各成分含量相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果，桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、異槲皮苷平均含量分別為17.09，8.28，38.17，3.49 mg/g，RSD分別為2.08 %，3.60 %，0.48 %和0.68 %，表明方法重復(fù)性較好。

2.4 待測溶液穩(wěn)定性試驗

取杜仲葉樣品，按2.1.2項和2.1.4項下方法對樣品進(jìn)行前處理和進(jìn)樣分析，每6 h進(jìn)一次樣，持續(xù)24 h，記錄各成分的峰面積，并計算各成分峰面積RSD，桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、異槲皮苷峰面積RSD分別為0.82 %，0.13 %，0.10 %，0.42 %，表明樣品待測液在24 h內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.5 加標(biāo)回收試驗

稱取已測桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、異槲皮苷4種成分含量分別為3.04，0.93，2.77，0.46 mg/g的同一批次的杜仲葉樣品6份，每份約0.5 g，分別加入混合對照品溶液（按2.1.1 項下方法配制的桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸，異槲皮苷質(zhì)量濃度分別為1.49，0.93，1.30，0.70 mg/ml的混合對照品溶液）0.5 ml和70 %甲醇水溶液24.5 ml，按2.1.2項和2.1.4項下方法對樣品進(jìn)行前處理和進(jìn)樣分析，計算各成分的加標(biāo)回收率。結(jié)果表明，桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、異槲皮苷的加標(biāo)回收率分別為99.96 %，99.40 %，95.03 %，95.46 %，RSD分別為3.33 %，2.13 %，2.82 %，1.31 %。

2.6 樣品檢測

稱取1.3項下杜仲葉樣品約0.5 g，按2.1.2項和2.1.4項下方法對樣品進(jìn)行前處理和進(jìn)樣分析，含量結(jié)果以干基計，結(jié)果見表3。由表3可見，杜仲葉樣品中4種成分總體上含量高低依次為綠原酸、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸和異槲皮苷，綠原酸含量相對穩(wěn)定，含量為19.32～52.55 mg/g。桃葉珊瑚苷和京尼平苷酸采集時間不同含量差別較大，含量分別為2.87～40.79和1.17～24.98 mg/g。異槲皮苷的含量相對較少，含量為2.55～9.83 mg/g。在不同的采收時期，綠原酸和異槲皮苷含量相對穩(wěn)定，桃葉珊瑚苷和京尼平苷酸含量差別較大。綠原酸和異槲皮苷在11月份含量最高，桃葉珊瑚苷和京尼平苷酸在9月份含量最高。

表3 杜仲葉樣品檢測結(jié)果表（n=3）

3 結(jié)論

本文建立了一種同時測定杜仲葉樣品中桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、綠原酸、異槲皮苷4種成分的試驗方法，4種成分在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系；此法重復(fù)性好、回收率高、樣品前處理操作簡單，適合多批次樣品連續(xù)進(jìn)樣。對武陵山區(qū)種植杜仲基地采收樣品檢測結(jié)果表明，杜仲葉樣品中4種成分總體上含量高低依次為綠原酸、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸和異槲皮苷，桃葉珊瑚苷和京尼平苷酸在9月份含量最高，綠原酸和異槲皮苷在11月份含量最高。