鄭 艷,陸啟光

(1.安吉縣第三人民醫(yī)院 呼吸科,浙江 安吉 313301;2.嘉興市第二醫(yī)院 呼吸內(nèi)科,浙江 嘉興 314000)

肺癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率及死亡率較高,且每年發(fā)病率以26%左右的速度增長[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的主要病理類型之一,由于其癌細胞增殖緩慢,擴散及轉(zhuǎn)移發(fā)生較晚,且侵襲力強,多數(shù)患者確診時已屬中晚期[2]。手術聯(lián)合放化療是治療中晚期NSCLC患者的主要方法,鉑類藥物尤其是順鉑(cisplatin,DDP),是治療NSCLC的一線藥物,但長期使用鉑類藥物引起肺癌細胞產(chǎn)生的耐藥性是導致癌癥復發(fā)、治療失敗的主要原因[3]。腫瘤耐藥成為了臨床治療癌癥所面臨的巨大挑戰(zhàn),探究腫瘤耐藥靶點具有重要的臨床意義。

核糖體蛋白(ribosomal protein,RP)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的RNA結(jié)合蛋白,在細胞內(nèi)蛋白合成中發(fā)揮重要作用,并調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及細胞的增殖、凋亡和分化[4]。RP在多種腫瘤細胞中異常表達,并與人腫瘤細胞耐藥有關,但尚無RPS19參與調(diào)控NSCLC耐藥性的相關報道[5-6]。本研究分析RPS19蛋白在NSCLC患者和細胞中的表達,并初步探討RPS19與DDP耐藥性之間的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料及樣本收集 選取2019年6月—12月于安吉縣第三人民醫(yī)院東院呼吸科接受治療的NSCLC患者50例。納入標準:①國際肺癌TNM分期[7]為Ⅲ/Ⅳ期;②年齡18～80歲;③初次確診且未接受過其他放化療,擇期行手術治療;④卡氏(Karnofsky,KPS)評分>60分,預計生存期>3個月;⑤臨床資料詳實,患者及家屬知情同意。排除標準:①小細胞肺癌患者;②合并心、腦功能不全或其他部位惡性腫瘤者;③近1個月有創(chuàng)傷手術史或大咯血史;④合并傳染性疾病者;⑤肺功能先天性發(fā)育不全者。50例患者中,男32例、女18例,年齡39～78歲,平均(59.68±7.95)歲;腫瘤分期:Ⅲ期35例,Ⅳ期15例;病理類型:腺癌29例,鱗癌21例。術后收集50例患者的癌組織及癌旁組織樣本。研究已獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 治療方法 所有患者均接受局部切除手術治療,及術后多西他賽聯(lián)合順鉑常規(guī)化療方案:第1天靜脈滴注多西他賽75 mg/m2;第1～3天靜脈滴注順鉑25 mg/m2;化療期間每天靜脈滴注5-羥色胺受體拮抗藥物,預防消化道反應;化療前1天至化療后1天予以地塞米松口服,7.5 mg/次,2次/天。治療周期為21天,共治療2個周期。

1.3 樣本檢測 根據(jù)化療的療效將患者分為有效組與無效組,比較兩組癌組織與癌旁組織中RPS19的mRNA及蛋白相對表達量。療效判定標準[8]:化療后功能狀態(tài)(performance status,PS)評分≥3分為有效,PS評分<3分為無效。RPS19表達情況采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)法和蛋白免疫印跡(WB)法檢測。

1.4 體外實驗

1.4.1 細胞 人非小細胞肺癌耐順鉑株A549/DDP購自上海博古生物技術有限公司, si-RPS19質(zhì)粒、si-陰性對照(negative control,NC)序列購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.4.2 試劑與儀器 RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、鏈青霉素、青霉素購自美國Gibco公司,LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑及試劑盒、二喹啉甲酸(quinaldic acid,BCA)蛋白定量分析試劑盒、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)試劑盒購自美國Sigma公司,NIB900-FL型倒置熒光顯微鏡購自Leica公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)試劑盒購自日本Takara公司,ABI PRISM 7300型PCR儀購自Applied Biosystems公司,一抗、二抗購自Abcam公司,DDP,CCK-8試劑及試劑盒購自日本Dojind公司,Binding Buffer、Annexin V試劑及試劑盒、流式細胞儀購自美國BD公司。

1.4.3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人非小細胞肺癌耐順鉑株A549/DDP接種于RPMI-1640培養(yǎng)基中,細胞融合度約80%時進行傳代。取對數(shù)生長期細胞接種于6孔板,LipofectamineTM2000試劑盒轉(zhuǎn)染293T細胞,更換完全培養(yǎng)基后繼續(xù)孵育48 h,而后收集細胞上清,濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液。取100 μL慢病毒原液稀釋至5倍,每孔加入上述1 mL稀釋的慢病毒液,37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后加入濃度為5 μg/mL的聚凝胺,篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株。將si-RPS19質(zhì)粒、si-NC序列分別轉(zhuǎn)染至A549/DDP細胞,分為si-RPS19組(敲低RPS19)、si-NC組(序列打亂的無意義對照)和空白對照組(未作任何處理的細胞株A549/DDP)。

1.4.4 RPS19 mRNA表達的測定 以TRIzol法提取臨床樣本和轉(zhuǎn)染后A549/DDP細胞的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RPS19正向引物序列:GACAGGCACTCTGGAAATTG,反向引物序列:GCTCCTTCTTCTGCCTTGTTA;內(nèi)參基因GAPDH正向引物序列:TAAGGTGGTACCGATTAAGC,反向引物序列:ACCCTAAGGATAACTCGTATT。使用ABI PRISM 7300型PCR儀進行實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR),反應條件:94 ℃ 10 min,1個循環(huán);53 ℃ 30 s,74 ℃ 28 s,RPS19基因進行30個循環(huán),GAPDH基因進行25個循環(huán),最后72 ℃延伸2 min,RPS19 mRNA相對表達量以2-ΔΔCt表示。

1.4.5 RPS19蛋白表達的測定 RIPA裂解液提取臨床樣本和細胞的總蛋白,BCA法進行蛋白定量,總蛋白樣品常規(guī)變性后依次電泳、轉(zhuǎn)膜,5%奶粉封閉2 h,PBS洗膜3次,分別加入1∶1 000RPS19和GAPDH一抗4 ℃孵育過夜,PBS洗膜3次,再分別加入1∶5 000酶標二抗室溫孵育1 h,洗膜后加入ECL顯影劑,全自動電泳凝膠成像分析儀采集圖像,Image軟件分析灰度值。

1.4.6 各組細胞對不同濃度DDP的敏感性 取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的si-RPS19組、si-NC組和空白對照組細胞,經(jīng)胰酶消化、重懸后,以5.0×103個/孔接種于96孔板,每組設置5個復孔,傳代培養(yǎng)12 h。各組細胞依次加入不同濃度的DDP(0,100,100.5,101,101.5,102μg/mL)處理24 h,每孔加入CCK-8試劑10 μL,37 ℃含有5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后,于450 nm波長處用酶標儀測定光密度(OD)值,計算不同濃度DDP處理下各組細胞存活率,細胞存活率(%)=(D加藥-D空白對照組)/(D0 μg/mL-D空白對照組)×100%。繪制細胞生長曲線,根據(jù)曲線計算DDP對細胞的半抑制濃度(50% inhibitory concentration,IC50)。

1.4.7 流式細胞術檢測細胞凋亡率 將轉(zhuǎn)染的各組細胞接種在6孔板上孵育過夜,依次加入不同濃度的DDP(0,100,100.5,101,101.5,102μg/mL)處理24 h,收集上清及細胞,4 000 r/min、4 ℃離心5 min。使用預冷的PBS洗滌細胞2次后,加入400 μL 1×Binding Buffer與細胞孵育,在細胞懸浮液中加入5 μL Annexin V,輕輕混勻后于4 ℃避光孵育15 min,再加入10 μL PI,于4 ℃避光孵育20 min,采用流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。

1.4.8 WB法檢測凋亡相關蛋白的表達 RIPA裂解液提取si-RPS19組、si-NC組和空白對照組細胞總蛋白,經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后,5%奶粉封閉2 h,PBS洗膜三次,分別加入一抗、二抗孵育,取出條帶漂洗,閉光顯影,以GAPDH為內(nèi)參,采用Image軟件分析目的條帶的灰度值,測定凋亡相關蛋白Bax,Bcl-2,caspase-3,caspase-9的表達水平。

2 結(jié)果

2.1 臨床樣本RPS19 mRNA及蛋白表達情況 NSCLC患者癌組織中RPS19 mRNA及蛋白相對表達量均較癌旁組織升高;50例患者經(jīng)DDP化療后,36例有效,14例無效,無效組患者癌組織中的RPS19 mRNA及蛋白相對表達量均高于有效組;差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床樣本RPS19 mRNA及蛋白表達情況比較

2.2 轉(zhuǎn)染結(jié)果 人非小細胞肺癌耐順鉑株A549/DDP轉(zhuǎn)染48 h后,于熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光,轉(zhuǎn)染效率約為85%,見封三圖1。

圖1 各組RPS19蛋白免疫印跡圖

2.3 各組細胞RPS19 mRNA及蛋白表達情況 si-RPS19組RPS19 mRNA及蛋白相對表達量均較空白對照組、si-NC組降低(F=42.897、62.089),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)?？瞻讓φ战M與si-NC組的RPS19 mRNA及蛋白相對表達量,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

2.4 不同DDP濃度下各組A549/DDP細胞存活率及IC50值比較 如圖2所示,各組A549/DDP細胞的存活率隨DDP濃度的增加而下降。各個DDP濃度下,si-RPS19組A549/DDP細胞存活率均最低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);空白對照組與si-NC組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖2 不同DDP濃度下A549/DDP細胞存活率

2.5 不同DDP濃度下各組A549/DDP細胞凋亡情況比較 如表2所示,各組A549/DDP細胞凋亡率均隨DDP濃度的增加而升高,且si-RPS19組的A549/DDP細胞凋亡率最高(P<0.05);空白對照組與si-NC組在各DDP濃度下的細胞凋亡率比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 不同DDP濃度下A549/DDP細胞凋亡率比較

2.6 凋亡相關蛋白的表達情況比較 WB結(jié)果顯示:與空白對照組、si-NC組比較,si-RPS19組的Bax、caspase-3及caspase-9蛋白相對表達量升高,Bcl-2蛋白相對表達量降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);空白對照組與si-NC組的凋亡相關蛋白的相對表達量比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3、圖3。

圖3 各組凋亡相關蛋白的蛋白免疫印跡圖

表3 各組細胞Bax,Bcl-2,caspase-3,caspase-9蛋白表達情況比較

3 討論

NSCLC是在環(huán)境、煙酒、遺傳等多種因素作用下發(fā)生于支氣管黏膜上皮或肺泡上皮的惡性腫瘤,化療是NSCLC晚期患者延長生存期、改善生命質(zhì)量的首選治療方式[9]。對于NSCLC患者的一線治療通常采用鉑類藥物聯(lián)合其他化療藥或抗血管生成藥,其中順鉑已廣泛應用于各類腫瘤的臨床治療,主要通過誘導快速無序增長的癌細胞內(nèi)發(fā)生DNA-DNA或DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián),造成DNA結(jié)構(gòu)和功能損傷,進而抑制癌細胞生長[10]。但治療過程中癌細胞對順鉑產(chǎn)生的耐藥性使整體治療效果不盡人意,有研究[11]發(fā)現(xiàn),腫瘤的死亡患者中約90%與抗癌藥物的耐藥性有關,且細胞耐藥機制復雜,至今仍未清晰闡明,因此解決腫瘤耐藥是目前臨床腫瘤治療中的首要任務。

真核生物的核糖體由4種rRNA和80多種RPs構(gòu)成,是細胞內(nèi)mRNA翻譯成為蛋白的重要場所,任一組成部分的異常均能影響蛋白質(zhì)的合成,進而導致機體細胞生長發(fā)育、增殖、分化的調(diào)控異常[12]。RP是核糖體的重要組成部分,具有參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯、調(diào)控細胞增殖和凋亡、分化等功能,并與前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌等多種癌癥疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關,同時RP在腫瘤細胞的耐藥性方面也發(fā)揮著重要作用[13-15]。Huang等[16]研究發(fā)現(xiàn),維生素D可通過RPS3抑制脂質(zhì)運載蛋白2調(diào)節(jié)的核因子κB通路激活,從而促進口腔鱗狀細胞癌對順鉑的敏感性。RPS19是在先天性純紅細胞再生障礙性貧血研究中發(fā)現(xiàn)的一個RP,該類患者具有惡性腫瘤易感性,提示RPS19功能缺失可能與腫瘤發(fā)生有關,敲低RPS19能夠抑制腫瘤細胞的生長并激活P53蛋白活性[17]。本研究發(fā)現(xiàn),NSCLC患者癌組織中RPS19 mRNA及蛋白相對表達量均較癌旁組織升高,且無效組患者癌組織的RPS19 mRNA及蛋白相對表達量均高于有效組,由此可見RPS19可能參與腫瘤發(fā)生及順鉑耐藥性。也有研究[18]發(fā)現(xiàn),RPS19在乳腺癌和宮頸癌中顯著高表達且在凋亡細胞中顯著降低,并能與在腫瘤浸潤性骨髓細胞上表達的補體C5a受體1相互作用,通過減少腫瘤細胞中的RPS19或阻斷其與C5a受體1的相互作用,可抑制腫瘤的免疫應答。后續(xù)臨床可進一步探索RPS19在腫瘤免疫應答中發(fā)揮的作用。

胡軍等[19]研究發(fā)現(xiàn),RPS19在NSCLC細胞中高表達,通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路下調(diào)RPS19的表達,可抑制肺癌細胞的侵襲、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換。本研究結(jié)果顯示:si-RPS19組RPS19 mRNA及蛋白相對表達量較空白對照組、si-NC組降低,且在同一DDP濃度下,si-RPS19組A549/DDP細胞存活率最低、凋亡率最高,si-RPS19組IC50值低于空白對照組、si-NC組,3組Bax、caspase-3及caspase-9蛋白相對表達量比較,si-RPS19組最高,Bcl-2蛋白相對表達量比較,si-RPS19組最低?？梢?敲低RPS19表達能抑制A549/DDP細胞DDP的耐藥性,同時能促進A549/DDP細胞凋亡,降低IC50值,其機制可能與調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路有關,臨床可深入探討RPS19逆轉(zhuǎn)A549/DDP細胞對DDP的耐藥性的機制。

綜上所述,RPS19在NSCLC中表達升高且與DDP的耐藥性相關,調(diào)低RPS19的表達可抑制NSCLC細胞A549/DDP的增殖,并促進細胞凋亡,逆轉(zhuǎn)A549/DDP細胞對DDP的耐藥性。