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        簡易扁板海綿萜酚類成分的生物活性研究

        2023-11-07 06:26:52劉馨聯(lián)莊江超周心行湯紀航張勝元
        湖北農(nóng)業(yè)科學 2023年10期
        關(guān)鍵詞:報告基因熒光素酶海綿

        劉馨聯(lián),莊江超,周心行,湯紀航,張勝元,王 潔

        (浙江海洋大學食品與藥學學院,浙江舟山 316022)

        相較于陸生的動植物,海洋生物長期生活在高壓、高鹽、低溫和寡營養(yǎng)的環(huán)境中,有著獨特的代謝途徑,極大地增加了其產(chǎn)生奇特結(jié)構(gòu)的可能。海綿缺乏物理防護,但在海洋中卻很少被捕食也幾乎不被細菌分解,這與其體內(nèi)強大的化學防御機制有關(guān)。隨著海綿中大量生物活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn),海綿已成為海洋天然藥物的重要來源,對海綿生物活性物質(zhì)的研究已成為海洋藥物開發(fā)的熱點。

        簡易扁板海綿(Plakortis simplex)為尋常海綿綱(Demospongiae)同骨海綿目(Hamosclerophorida)多板海綿科(Plakinidae)動物,其次級代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)豐富多樣,包括聚酮類、生物堿類、呋喃類和萜類等,且大多具有顯著的生物活性,例如抗瘧、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等[1]。萜酚類化合物廣泛存在于海洋生物中,通常表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤、抗菌和抗瘧等活性[2-7],但在簡易扁板海綿中存在較少。試驗前期已從該海綿中發(fā)現(xiàn)了6 種新化合物,但因化合物量較少未做進一步的活性研究[8]。本次研究通過LC-MS 法和HPLC 法對該海綿中的萜酚類化合物進行追蹤富集和分離,運用MTT 法和熒光素酶雙報告基因檢測法評價萜酚類化合物的抗腫瘤活性和抗炎活性。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        海綿樣品于2007 年5 月采自中國南海西沙群島,由青島海洋研究所李錦和研究員鑒定為Plakortis simplex。標本(No. B-3)存放于上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院海洋藥物重點實驗室。人乳腺癌細胞MCF-7、人宮頸癌細胞Hela、人腎上皮細胞293T,均由廈門大學提供。

        9-順視黃酸(美國Sigma Chemical 公司);TNF-a(美國Peprotech 公司);Lipofectamine? 2000 Reagent(美國Invitrogen 公司);Dual-Luciferase?Reporter Assay System 10-Pack(美國Promega 公司);色譜級甲醇(美國Promptar 公司);氘代試劑CD3OD(劍橋同位素實驗室有限公司)。

        1.2 儀器與設備

        Waters Xevo G2-XS Q-Tof 液質(zhì)聯(lián)用儀(美國Waters 公司);Waters 1525/2998 型高效液相色譜儀(美國Waters 公司);YMC-Pack Pro C18色譜柱(250×10 mmI.D.S-5 μm,8 nm,日本YMC 公司);中壓色譜儀(Interchim puriflash 450 instruments,法國Interchim 公司);Agilent DD2-600 型核磁共振儀(美國Agilent 公司);Glomax20/20 化學發(fā)光檢測儀(美國Promega 公司);Model 680 酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 萜酚類化合物的追蹤分離 采用高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀分析海綿(Plakortis simplex)的正丁醇萃取物經(jīng)前期分離得到的各組分,在負離子模式下追蹤相對分子質(zhì)量為249.149 的分子離子峰,并進行組分富集得到組分H(4.3 g)。組分H 通過反相硅膠柱色譜(流速:10 mL/min,流動相:10%~100%甲醇水溶液)分離得到6 個組分:1—6。采用LC-MS 法分析發(fā)現(xiàn)組分2(0.55 g)和組分3(0.32 g)中含有相對分子質(zhì)量為249.149 的分子離子峰,組分2 經(jīng)高效液相色譜(流速:2.0 mL/min,流動相:40%甲醇水溶液)分離得到化合物4(4.5 mg)、3(6.1 mg)、6(3.8 mg)和5(3.6 mg);組分3 經(jīng)高效液相色譜(流速:2.0 mL/min,流動相:40%甲醇水溶液)分離得到化合物2(3.2 mg)、1(3.1 mg)、8(15.0 mg)和7(13.3 mg)。

        1.3.2 單體化合物的細胞毒活性評價 參考文獻[9],采用MTT 法對分離得到的化合物進行細胞毒活性評價。選用人乳腺癌細胞系MCF-7 和人宮頸癌細胞系Hela 進行活性評價,樣品終濃度為20 μmol/L。

        1.3.3 雙熒光素酶報告基因檢測化合物與RXRα 的相互作用 293T 細胞接種于培養(yǎng)皿中,待細胞密度為80%時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(pG5luc∶pBIND-RXRa-LBD∶lipo2000=10 μg∶3 μg∶20 μL),12 h 后消化細胞并接種到96 孔板,繼續(xù)培養(yǎng)12 h 待細胞貼壁后,分別用20 μmol/L 的樣品或9-順視黃酸單獨處理以及9-順視黃酸聯(lián)合20 μmol/L 的樣品處理細胞,每組重復2次。12 h 后收集細胞,并裂解,加入熒光素酶底物分別檢測螢火蟲素酶和海腎熒光素酶的活性,并計算螢火蟲熒光素酶的相對活性。

        1.3.4 雙熒光素酶報告基因檢測化合物對TNF-α誘導的NF-κB 的影響 293T 細胞接種于培養(yǎng)皿中,待細胞密度為80% 時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒(pGL4.32[luc2P/NF-κB-RE/Hygro]∶Rellina∶lipo2000=10 μg∶0.5 μg∶20 μL),12 h 后消化細胞并接種到96 孔板,繼續(xù)培養(yǎng)12 h 待細胞貼壁后,對照組不做處理,模型組加20 ng/mL 的TNF-α,陽性對照組加20 ng/mL 的TNFα 和0.5 μmol/L 的TPCA,試驗組加20 ng/mL 的TNFα 和20 μmol/L 的樣品,每組做2 個復孔。6 h 后收集細胞并裂解,加入熒光素酶底物分別檢測螢火蟲素酶和海腎熒光素酶的活性,并計算螢火蟲熒光素酶的相對活性。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

        從簡易扁板海綿的正丁醇萃取物中共分離8 個單體化合物(圖1),與前期分離得到的萜酚類化合物進行對比[8],化合物1—6 分別鑒定為Plakordiol A(1)、Plakordiol B(2)、Plakordiol C(3)、Plakordiol D(4)、(7R,10R)-Hydroxycurcudiol(5)、(7R,10S)-Hydroxycurcudiol(6)。

        圖1 萜酚類化合物1—8 的結(jié)構(gòu)

        化合物7:黃色油狀,易溶于甲醇。10%硫酸-香草醛顯色呈深藍色。ESIMS 給出準分子離子峰m/z233.14[M - H]-,分子式為C15H22O2,計算不飽和度為5。1H NMR(600 MHz,CD3OD)δH:6.94(1H,d,J= 7.8 Hz,H-5),6.60(1H,br d,J= 7.8 Hz,H-4),6.58(1H,br s,H-2),4.87(1H,br s,H-12),4.77(1H,br s,H-12),3.96(1H,t,J=6.6 Hz,H-10),3.10(1H,m,H-7),2.22(3H,s,H-15),1.63(3H,s,H-13),1.57(2H,m,H-8),1.50(1H,m,H-9),1.40(1H,m,H-9),1.17(3H,d,J= 7.2 Hz,H-14)。13C NMR(150 MHz,CD3OD)δC:155.6(C,C-1),148.8(C,C-11),137.1(C,C-3),131.4(C,C-6),127.6(CH,C-5),121.3(CH,C-4),116.7(CH,C-2),111.6(CH2,C-12),77.2(CH,C-10),34.4(CH2,C-8),34.0(CH2,C-9),32.9(CH,C-7),21.8(CH3,C-14),21.1(CH3,C-15),17.3(CH3,C-13)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻報道的(7R*,10R*)-Abolene 的核磁數(shù)據(jù)基本一致[10],確定該化合物為(7R*,10R*)-Abolene。

        化合物8:黃色油狀,易溶于甲醇。10%硫酸-香草醛顯色呈深藍色。ESIMS 給出準分子離子峰m/z233.14[M - H]-,分子式為C15H22O2,計算不飽和度為5。1H NMR(600 MHz,CD3OD)δH:6.95(1H,d,J= 7.8 Hz,H-5),6.60(1H,br d,J= 7.8 Hz,H-4),6.58(1H,br s,H-2),4.87(1H,br s,H-12),4.78(1H,br s,H-12),3.99(1H,t,J=6.6 Hz,H-10),3.13(1H,m,H-7),2.22(3H,s,H-15),1.65(1H,m,H-8),1.63(3H,s,H-13),1.53(1H,m,H-8),1.50(1H,m,H-9),1.40(1H,m,H-9),1.18(3H,d,J= 7.2 Hz,H-14)。13C NMR(150 MHz,CD3OD)δC:155.6(C,C-1),148.9(C,C-11),137.1(C,C-3),131.4(C,C-6),127.7(CH,C-5),121.3(CH,C-4),116.6(CH,C-2),111.6(CH2,C-12),76.7(CH,C-10),34.1(CH2,C-8),33.9(CH2,C-9),32.5(CH,C-7),21.8(CH3,C-14),21.1(CH3,C-15),17.6(CH3,C-13)。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻報道的(7R*,10S*)-Abolene 的核磁數(shù)據(jù)基本一致[10],確定該化合物為(7R*,10S*)-Abolene。

        2.2 細胞毒活性

        采用MTT 法對8 個單體化合物進行人乳腺癌細胞MCF-7 和人宮頸癌細胞Hela 細胞抑制活性評價,結(jié)果見圖2。在20 μmol/L 濃度下,8 個化合物均對MCF-7 細胞的生長表現(xiàn)出一定的抑制活性,尤其是化合物3 和4 的活性最強,細胞生長率分別為71%和73%;化合物1、3、4、7 和8 對Hela 細胞表現(xiàn)出較好的抑制活性。結(jié)果表明,化合物3 的細胞毒活性最強。

        圖2 化合物1—8 對MCF-7 和Hela 細胞的生長抑制活性

        2.3 對9-順視黃酸誘導的RXRα 轉(zhuǎn)錄活性的影響

        采用雙熒光素酶報告基因檢測化合物對9-順視黃酸誘導的類視黃醇X 受體α(RXRα)轉(zhuǎn)錄的影響,結(jié)果如圖3 所示。與模型組相比,化合物1 和化合物3 在20 μmol/L 濃度下可明顯抑制RXRα 的轉(zhuǎn)錄激活活性(P<0.05 或P<0.01),而化合物4 則促進9-順視黃酸激活RXRα 的轉(zhuǎn)錄活性(P<0.01)。結(jié)果表明,化合物3 的抑制活性最強,其可能為RXRα 的拮抗劑或誘導RXRα 四聚化,從而表現(xiàn)出抑制RXRα轉(zhuǎn)錄激活活性;而化合物4 可能和9-順視黃酸對RXRα 轉(zhuǎn)錄激活活性具有協(xié)同作用。

        圖3 化合物1—8 對9-順視黃酸誘導的RXRα 轉(zhuǎn)錄活性的影響

        2.4 對TNF-α 誘導的NF-κB 的影響

        采用雙熒光素酶報告基因檢測化合物對TNFα 誘導的NF-κB 激活的影響,結(jié)果如圖4 所示。與模型組相比,化合物1 在20 μmol/L 濃度下對TNF-α誘導的NF-κB 的激活表現(xiàn)出一定的抑制活性(P<0.05)。因此,化合物1 可通過抑制NF-κB 的激活而發(fā)揮一定的抗炎作用。

        圖4 化合物1—8 對TNF-α 誘導的NF-κB 的影響

        3 小結(jié)與討論

        采用LC-MS 法從簡易扁板海綿(Plakortis simplex)中高效追蹤萜酚類化合物,并運用HPLC 法分離得到8 個單體化合物,它們?yōu)? 對差向異構(gòu)體。采用MTT 法和熒光素酶雙報告基因檢測法檢測了萜酚類化合物的抗腫瘤活性和抗炎活性。結(jié)果表明,在20 μmol/L 濃度下,化合物3 表現(xiàn)出較好的細胞毒活性和抑制9-順視黃酸誘導的RXRα 轉(zhuǎn)錄激活活性;化合物4 促進9-順視黃酸激活RXRα 的轉(zhuǎn)錄活性,其與9-順視黃酸對RXRα 轉(zhuǎn)錄激活活性表現(xiàn)出一定的協(xié)同作用?;衔? 對TNF-α 誘導的NFκB 的激活表現(xiàn)出一定的抑制活性,具有潛在的抗炎活性。

        RXRα 在人體組織內(nèi)廣泛表達,參與了多種疾病的發(fā)生與發(fā)展,尤其是癌癥,目前RXRα 已作為癌癥藥物研發(fā)的一個重要靶點[11]。根據(jù)小分子化合物對RXRα 調(diào)控作用的不同,分為激動劑和拮抗劑,兩者均表現(xiàn)出抗腫瘤活性。9-順視黃酸是RXRα 的天然激動劑,通過雙熒光素酶報告基因檢測小分子對9-順視黃酸誘導的RXRα 轉(zhuǎn)錄的影響篩選潛在的抗腫瘤活性化合物。研究發(fā)現(xiàn),化合物3 抑制RXRα 轉(zhuǎn)錄激活活性,而化合物4 與9-順視黃酸對RXRα 轉(zhuǎn)錄激活活性發(fā)揮協(xié)同作用,兩者對人乳腺癌細胞MCF-7 均表現(xiàn)出一定的生長抑制活性。有趣的是,化合物3 和化合物4 互為差向異構(gòu)體,僅C-10 構(gòu)型不同,但兩者對RXRα 轉(zhuǎn)錄的影響卻相反,這表明化合物3 和4 均可與RXRα 蛋白結(jié)合,但對蛋白的調(diào)控作用不同,因此,兩者對RXRα 的調(diào)控機制和抗腫瘤作用機制有待進一步研究。

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