劉馨聯(lián)，莊江超，周心行，湯紀(jì)航，張勝元，王 潔

（浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江舟山 316022）

相較于陸生的動(dòng)植物，海洋生物長(zhǎng)期生活在高壓、高鹽、低溫和寡營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境中，有著獨(dú)特的代謝途徑，極大地增加了其產(chǎn)生奇特結(jié)構(gòu)的可能。海綿缺乏物理防護(hù)，但在海洋中卻很少被捕食也幾乎不被細(xì)菌分解，這與其體內(nèi)強(qiáng)大的化學(xué)防御機(jī)制有關(guān)。隨著海綿中大量生物活性物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)，海綿已成為海洋天然藥物的重要來(lái)源，對(duì)海綿生物活性物質(zhì)的研究已成為海洋藥物開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)。

簡(jiǎn)易扁板海綿（Plakortis simplex）為尋常海綿綱（Demospongiae）同骨海綿目（Hamosclerophorida）多板海綿科（Plakinidae）動(dòng)物，其次級(jí)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)豐富多樣，包括聚酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、呋喃類(lèi)和萜類(lèi)等，且大多具有顯著的生物活性，例如抗瘧、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等［1］。萜酚類(lèi)化合物廣泛存在于海洋生物中，通常表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤、抗菌和抗瘧等活性［2-7］，但在簡(jiǎn)易扁板海綿中存在較少。試驗(yàn)前期已從該海綿中發(fā)現(xiàn)了6 種新化合物，但因化合物量較少未做進(jìn)一步的活性研究［8］。本次研究通過(guò)LC-MS 法和HPLC 法對(duì)該海綿中的萜酚類(lèi)化合物進(jìn)行追蹤富集和分離，運(yùn)用MTT 法和熒光素酶雙報(bào)告基因檢測(cè)法評(píng)價(jià)萜酚類(lèi)化合物的抗腫瘤活性和抗炎活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海綿樣品于2007 年5 月采自中國(guó)南海西沙群島，由青島海洋研究所李錦和研究員鑒定為Plakortis simplex。標(biāo)本（No. B-3）存放于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院海洋藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。人乳腺癌細(xì)胞MCF-7、人宮頸癌細(xì)胞Hela、人腎上皮細(xì)胞293T，均由廈門(mén)大學(xué)提供。

9-順視黃酸（美國(guó)Sigma Chemical 公司）；TNF-a（美國(guó)Peprotech 公司）；Lipofectamine? 2000 Reagent（美國(guó)Invitrogen 公司）；Dual-Luciferase?Reporter Assay System 10-Pack（美國(guó)Promega 公司）；色譜級(jí)甲醇（美國(guó)Promptar 公司）；氘代試劑CD3OD（劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters Xevo G2-XS Q-Tof 液質(zhì)聯(lián)用儀（美國(guó)Waters 公司）；Waters 1525/2998 型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；YMC-Pack Pro C18色譜柱（250×10 mmI.D.S-5 μm，8 nm，日本YMC 公司）；中壓色譜儀（Interchim puriflash 450 instruments，法國(guó)Interchim 公司）；Agilent DD2-600 型核磁共振儀（美國(guó)Agilent 公司）；Glomax20/20 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀（美國(guó)Promega 公司）；Model 680 酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 萜酚類(lèi)化合物的追蹤分離 采用高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀分析海綿（Plakortis simplex）的正丁醇萃取物經(jīng)前期分離得到的各組分，在負(fù)離子模式下追蹤相對(duì)分子質(zhì)量為249.149 的分子離子峰，并進(jìn)行組分富集得到組分H（4.3 g）。組分H 通過(guò)反相硅膠柱色譜（流速：10 mL/min，流動(dòng)相：10%～100%甲醇水溶液）分離得到6 個(gè)組分：1—6。采用LC-MS 法分析發(fā)現(xiàn)組分2（0.55 g）和組分3（0.32 g）中含有相對(duì)分子質(zhì)量為249.149 的分子離子峰，組分2 經(jīng)高效液相色譜（流速：2.0 mL/min，流動(dòng)相：40%甲醇水溶液）分離得到化合物4（4.5 mg）、3（6.1 mg）、6（3.8 mg）和5（3.6 mg）；組分3 經(jīng)高效液相色譜（流速：2.0 mL/min，流動(dòng)相：40%甲醇水溶液）分離得到化合物2（3.2 mg）、1（3.1 mg）、8（15.0 mg）和7（13.3 mg）。

1.3.2 單體化合物的細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià) 參考文獻(xiàn)［9］，采用MTT 法對(duì)分離得到的化合物進(jìn)行細(xì)胞毒活性評(píng)價(jià)。選用人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7 和人宮頸癌細(xì)胞系Hela 進(jìn)行活性評(píng)價(jià)，樣品終濃度為20 μmol/L。

1.3.3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)化合物與RXRα 的相互作用 293T 細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度為80%時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（pG5luc∶pBIND-RXRa-LBD∶lipo2000=10 μg∶3 μg∶20 μL），12 h 后消化細(xì)胞并接種到96 孔板，繼續(xù)培養(yǎng)12 h 待細(xì)胞貼壁后，分別用20 μmol/L 的樣品或9-順視黃酸單獨(dú)處理以及9-順視黃酸聯(lián)合20 μmol/L 的樣品處理細(xì)胞，每組重復(fù)2次。12 h 后收集細(xì)胞，并裂解，加入熒光素酶底物分別檢測(cè)螢火蟲(chóng)素酶和海腎熒光素酶的活性，并計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶的相對(duì)活性。

1.3.4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)化合物對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB 的影響 293T 細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞密度為80% 時(shí)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（pGL4.32［luc2P/NF-κB-RE/Hygro］∶Rellina∶lipo2000=10 μg∶0.5 μg∶20 μL），12 h 后消化細(xì)胞并接種到96 孔板，繼續(xù)培養(yǎng)12 h 待細(xì)胞貼壁后，對(duì)照組不做處理，模型組加20 ng/mL 的TNF-α，陽(yáng)性對(duì)照組加20 ng/mL 的TNFα 和0.5 μmol/L 的TPCA，試驗(yàn)組加20 ng/mL 的TNFα 和20 μmol/L 的樣品，每組做2 個(gè)復(fù)孔。6 h 后收集細(xì)胞并裂解，加入熒光素酶底物分別檢測(cè)螢火蟲(chóng)素酶和海腎熒光素酶的活性，并計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶的相對(duì)活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

從簡(jiǎn)易扁板海綿的正丁醇萃取物中共分離8 個(gè)單體化合物（圖1），與前期分離得到的萜酚類(lèi)化合物進(jìn)行對(duì)比［8］，化合物1—6 分別鑒定為Plakordiol A（1）、Plakordiol B（2）、Plakordiol C（3）、Plakordiol D（4）、（7R，10R）-Hydroxycurcudiol（5）、（7R，10S）-Hydroxycurcudiol（6）。

圖1 萜酚類(lèi)化合物1—8 的結(jié)構(gòu)

化合物7：黃色油狀，易溶于甲醇。10%硫酸-香草醛顯色呈深藍(lán)色。ESIMS 給出準(zhǔn)分子離子峰m/z233.14［M - H］-，分子式為C15H22O2，計(jì)算不飽和度為5。1H NMR（600 MHz，CD3OD）δH：6.94（1H，d，J= 7.8 Hz，H-5），6.60（1H，br d，J= 7.8 Hz，H-4），6.58（1H，br s，H-2），4.87（1H，br s，H-12），4.77（1H，br s，H-12），3.96（1H，t，J=6.6 Hz，H-10），3.10（1H，m，H-7），2.22（3H，s，H-15），1.63（3H，s，H-13），1.57（2H，m，H-8），1.50（1H，m，H-9），1.40（1H，m，H-9），1.17（3H，d，J= 7.2 Hz，H-14）。13C NMR（150 MHz，CD3OD）δC：155.6（C，C-1），148.8（C，C-11），137.1（C，C-3），131.4（C，C-6），127.6（CH，C-5），121.3（CH，C-4），116.7（CH，C-2），111.6（CH2，C-12），77.2（CH，C-10），34.4（CH2，C-8），34.0（CH2，C-9），32.9（CH，C-7），21.8（CH3，C-14），21.1（CH3，C-15），17.3（CH3，C-13）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的（7R*，10R*）-Abolene 的核磁數(shù)據(jù)基本一致［10］，確定該化合物為（7R*，10R*）-Abolene。

化合物8：黃色油狀，易溶于甲醇。10%硫酸-香草醛顯色呈深藍(lán)色。ESIMS 給出準(zhǔn)分子離子峰m/z233.14［M - H］-，分子式為C15H22O2，計(jì)算不飽和度為5。1H NMR（600 MHz，CD3OD）δH：6.95（1H，d，J= 7.8 Hz，H-5），6.60（1H，br d，J= 7.8 Hz，H-4），6.58（1H，br s，H-2），4.87（1H，br s，H-12），4.78（1H，br s，H-12），3.99（1H，t，J=6.6 Hz，H-10），3.13（1H，m，H-7），2.22（3H，s，H-15），1.65（1H，m，H-8），1.63（3H，s，H-13），1.53（1H，m，H-8），1.50（1H，m，H-9），1.40（1H，m，H-9），1.18（3H，d，J= 7.2 Hz，H-14）。13C NMR（150 MHz，CD3OD）δC：155.6（C，C-1），148.9（C，C-11），137.1（C，C-3），131.4（C，C-6），127.7（CH，C-5），121.3（CH，C-4），116.6（CH，C-2），111.6（CH2，C-12），76.7（CH，C-10），34.1（CH2，C-8），33.9（CH2，C-9），32.5（CH，C-7），21.8（CH3，C-14），21.1（CH3，C-15），17.6（CH3，C-13）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道的（7R*，10S*）-Abolene 的核磁數(shù)據(jù)基本一致［10］，確定該化合物為（7R*，10S*）-Abolene。

2.2 細(xì)胞毒活性

采用MTT 法對(duì)8 個(gè)單體化合物進(jìn)行人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 和人宮頸癌細(xì)胞Hela 細(xì)胞抑制活性評(píng)價(jià)，結(jié)果見(jiàn)圖2。在20 μmol/L 濃度下，8 個(gè)化合物均對(duì)MCF-7 細(xì)胞的生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的抑制活性，尤其是化合物3 和4 的活性最強(qiáng)，細(xì)胞生長(zhǎng)率分別為71%和73%；化合物1、3、4、7 和8 對(duì)Hela 細(xì)胞表現(xiàn)出較好的抑制活性。結(jié)果表明，化合物3 的細(xì)胞毒活性最強(qiáng)。

圖2 化合物1—8 對(duì)MCF-7 和Hela 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制活性

2.3 對(duì)9-順視黃酸誘導(dǎo)的RXRα 轉(zhuǎn)錄活性的影響

采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)化合物對(duì)9-順視黃酸誘導(dǎo)的類(lèi)視黃醇X 受體α（RXRα）轉(zhuǎn)錄的影響，結(jié)果如圖3 所示。與模型組相比，化合物1 和化合物3 在20 μmol/L 濃度下可明顯抑制RXRα 的轉(zhuǎn)錄激活活性（P＜0.05 或P＜0.01），而化合物4 則促進(jìn)9-順視黃酸激活RXRα 的轉(zhuǎn)錄活性（P＜0.01）。結(jié)果表明，化合物3 的抑制活性最強(qiáng)，其可能為RXRα 的拮抗劑或誘導(dǎo)RXRα 四聚化，從而表現(xiàn)出抑制RXRα轉(zhuǎn)錄激活活性；而化合物4 可能和9-順視黃酸對(duì)RXRα 轉(zhuǎn)錄激活活性具有協(xié)同作用。

圖3 化合物1—8 對(duì)9-順視黃酸誘導(dǎo)的RXRα 轉(zhuǎn)錄活性的影響

2.4 對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的NF-κB 的影響

采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)化合物對(duì)TNFα 誘導(dǎo)的NF-κB 激活的影響，結(jié)果如圖4 所示。與模型組相比，化合物1 在20 μmol/L 濃度下對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB 的激活表現(xiàn)出一定的抑制活性（P＜0.05）。因此，化合物1 可通過(guò)抑制NF-κB 的激活而發(fā)揮一定的抗炎作用。

圖4 化合物1—8 對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的NF-κB 的影響

3 小結(jié)與討論

采用LC-MS 法從簡(jiǎn)易扁板海綿（Plakortis simplex）中高效追蹤萜酚類(lèi)化合物，并運(yùn)用HPLC 法分離得到8 個(gè)單體化合物，它們?yōu)? 對(duì)差向異構(gòu)體。采用MTT 法和熒光素酶雙報(bào)告基因檢測(cè)法檢測(cè)了萜酚類(lèi)化合物的抗腫瘤活性和抗炎活性。結(jié)果表明，在20 μmol/L 濃度下，化合物3 表現(xiàn)出較好的細(xì)胞毒活性和抑制9-順視黃酸誘導(dǎo)的RXRα 轉(zhuǎn)錄激活活性；化合物4 促進(jìn)9-順視黃酸激活RXRα 的轉(zhuǎn)錄活性，其與9-順視黃酸對(duì)RXRα 轉(zhuǎn)錄激活活性表現(xiàn)出一定的協(xié)同作用?；衔? 對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的NFκB 的激活表現(xiàn)出一定的抑制活性，具有潛在的抗炎活性。

RXRα 在人體組織內(nèi)廣泛表達(dá)，參與了多種疾病的發(fā)生與發(fā)展，尤其是癌癥，目前RXRα 已作為癌癥藥物研發(fā)的一個(gè)重要靶點(diǎn)［11］。根據(jù)小分子化合物對(duì)RXRα 調(diào)控作用的不同，分為激動(dòng)劑和拮抗劑，兩者均表現(xiàn)出抗腫瘤活性。9-順視黃酸是RXRα 的天然激動(dòng)劑，通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)小分子對(duì)9-順視黃酸誘導(dǎo)的RXRα 轉(zhuǎn)錄的影響篩選潛在的抗腫瘤活性化合物。研究發(fā)現(xiàn)，化合物3 抑制RXRα 轉(zhuǎn)錄激活活性，而化合物4 與9-順視黃酸對(duì)RXRα 轉(zhuǎn)錄激活活性發(fā)揮協(xié)同作用，兩者對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7 均表現(xiàn)出一定的生長(zhǎng)抑制活性。有趣的是，化合物3 和化合物4 互為差向異構(gòu)體，僅C-10 構(gòu)型不同，但兩者對(duì)RXRα 轉(zhuǎn)錄的影響卻相反，這表明化合物3 和4 均可與RXRα 蛋白結(jié)合，但對(duì)蛋白的調(diào)控作用不同，因此，兩者對(duì)RXRα 的調(diào)控機(jī)制和抗腫瘤作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。