張 露，徐林菊，彭春彥，王佩欣，謝作樺，謝 星，賈曉燕，涂宗財,3,*

（1.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，江西 南昌 330022；2.江西德上制藥股份有限公司，江西 樟樹 331200；3.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室，江西 南昌 330047）

糖基化反應(yīng)是普遍存在于食物加工儲存過程中還原糖羰基和蛋白質(zhì)游離氨基之間的羰氨縮合反應(yīng)，會形成一系列含氮和含氧雜環(huán)的異質(zhì)熒光產(chǎn)物，如5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural，5-HMF）、丙烯酰胺、活性自由基和晚期糖基化產(chǎn)物（advanced glycosylation end products，AGEs）等[1]。研究發(fā)現(xiàn)一些糖基化產(chǎn)物會對細(xì)胞或人體產(chǎn)生多種危害，如體內(nèi)過多的5-HMF可促進(jìn)腸道隱性病灶的發(fā)展[2]；食物中的丙烯酰胺攝入過多會加速細(xì)胞凋亡和促進(jìn)炎癥反應(yīng)，其代謝產(chǎn)物環(huán)氧丙酰胺也會通過攻擊DNA造成機(jī)體損傷[3]；AGEs在體內(nèi)的積累會增加糖尿病、腎病、動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生概率[4]，因此，減緩非酶糖基化的反應(yīng)進(jìn)程和抑制有害糖基化產(chǎn)物的生成對提高食品安全，促進(jìn)人體健康具有重要意義。

目前，人工合成的糖基化抑制劑氨基胍對非酶糖基化具有較好抑制效果，但其毒副作用強(qiáng)，會引起胃腸功能紊亂、肝功能異常、貧血等癥狀，已被臨床上禁止使用[5]。多酚是天然抗糖基化劑的優(yōu)質(zhì)來源，具有高效、低毒和副作用小等特點(diǎn)，是目前的研究熱點(diǎn)。據(jù)報道，多酚可通過清除自由基、影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)、捕獲甲基乙二醛等多種方式抑制糖基化過程以及糖基化產(chǎn)物的形成[6]。如：Wu Chihao等[7]發(fā)現(xiàn)槲皮素、山柰酚、異鼠李素和楊梅素可有效抑制卵清蛋白-果糖體系的糖基化反應(yīng)，屏蔽卵清蛋白（ovalbumin，OVA）的糖基化位點(diǎn)，減少5-HMF等有害產(chǎn)物的形成。Jia Li等[8]發(fā)現(xiàn)狹葉沙棗花提取物及其主要成分丁香苷可與OVA自發(fā)結(jié)合，改變OVA的構(gòu)象，減少其與果糖的結(jié)合位點(diǎn)，表現(xiàn)出顯著的糖基化抑制效果。槲皮素-3-O-葡萄糖苷（quercetin-3-O-β-D-glucuronide，Q3G）是槲皮素的同系化合物，由于其葡萄糖苷部分α鍵的伸長使其生物利用度和安全性均優(yōu)于蘆丁及槲皮素[9]。前期研究發(fā)現(xiàn)，Q3G通過與牛α-乳白蛋白（bovineα-lactalbumin，α-La）相互作用，改變其構(gòu)象，顯著減少AGEs的形成，然而，其抑制機(jī)制尚不明確，需要進(jìn)一步的探究[10]。

本實驗以α-L a-果糖為糖基化模型，以Q3G為抑制劑，通過檢測褐變程度和游離氨基、果糖胺、5-HMF等的含量，并利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析糖化導(dǎo)致的α-La交聯(lián)，考察Q3G對非酶糖基化的抑制活性；然后，利用分子對接技術(shù)分析Q3G與α-La之間的相互作用關(guān)系，并運(yùn)用超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-quadrupoleorbitrap tandem mass spectrometry，UPLC-Q-Orbitrap MS/MS）技術(shù)探究Q3G對α-La糖基化位點(diǎn)的影響，旨在揭示Q3G對非酶糖基化的抑制機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Q3G、L-賴氨酸（L-lysine，Lys）上海源葉生物科技有限公司；氨基胍（aminoguanidine，AG）、尿素、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、碘乙酰胺（iodoacetamide，IAA）美國Bio-Rad公司；乙腈、甲醇、甲酸（均為色譜級）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；α-La 美國Sigma公司；三氟乙酸、鄰苯二甲醛（o-phthaladehyde，OPA）、胰蛋白酶、糖化血清蛋白檢測試劑盒、果糖及其他試劑（均為分析級）北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Synergy H1多功能酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；1260液相色譜儀 美國Agilent Technologies Inc科技公司；UPLC-Q-Orbitrap MS/MS儀 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 糖基化體系制備

參照文獻(xiàn)[10]方法構(gòu)建α-La糖基化體系。取1 mL 20 mg/mLα-La（pH 7.4，200 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）含0.2%疊代鈉）、1 mL 20 mg/mL果糖（溶于PBS）和100 μL不同濃度樣品于試管中混勻，55 ℃反應(yīng)24 h后快速冷卻到室溫，-4 ℃冰箱保存用于后續(xù)分析。以AG為陽性對照品，無水乙醇和PBS代替反應(yīng)體系的Q3G和果糖為控制組和空白組。

1.3.2 游離氨基測定

參照劉俊等[11]的方法測定樣品中游離氨基含量。取50 μL適宜濃度樣品與1 mL OPA混勻，避光反應(yīng)2 min后，取200 μL反應(yīng)液于96 孔酶標(biāo)板上，采用酶標(biāo)儀測定其在340 nm波長處的吸光度，以PBS代替樣品為空白對照。配制0～0.8 mg/mL的Lys標(biāo)準(zhǔn)品溶液用于制作Lys標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝1.6304x＋0.1323，R2＝0.9989。結(jié)果以Lys當(dāng)量（mg/mL）表示。

1.3.3 果糖胺含量測定

采用糖化血清蛋白試劑盒測定樣品中果糖胺的含量，詳細(xì)方法參照試劑盒說明書。

1.3.4 褐變程度測定

參考Tu Zongcai等[12]的方法測定樣品的褐變程度。取一定量5 倍稀釋后的樣品于96 孔酶標(biāo)板上，采用酶標(biāo)儀測定樣品在294 nm波長處的褐變程度，以PBS代替樣品作為空白對照。實驗結(jié)果以A294nm表示。

1.3.5 5-HMF含量的測定

參照李軍等[13]的方法測定樣品中5-HMF的含量。取1 mL樣品與100 μL 6 mol/L鹽酸于試管中，沸水浴反應(yīng)15 min，冷卻至室溫后，4000 r/min離心20 min，收集上清液，過0.22 μm濾膜，采用配備有Phenomenex C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）的UPLC儀進(jìn)行定量分析。色譜條件如下：流動相：A為0.1%的甲酸溶液，B為純甲醇；流速：0.6 mL/min；柱溫：25 ℃；紫外檢測波長：285 nm；進(jìn)樣量：10 μL。采用30% B對樣品等度洗脫20 min。配制1、2、2.5、5 μg/mL和7.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液用于制作5-HMF的標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線y＝129.85x＋330.94，R2＝0.998。實驗結(jié)果表示為μg/mL。

1.3.6 SDS-PAGE分析

參照劉俊等[11]的方法進(jìn)行SDS-PAGE分析。制備5%濃縮膠和12%分離膠，并調(diào)節(jié)樣品蛋白質(zhì)量濃度至1 mg/mL，將蛋白質(zhì)溶液與樣品緩沖液以3∶1（V/V）的比例混合，沸水浴5 min。取10 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，再用考馬斯亮藍(lán)染色液染色0.5 h，脫色24 h，拍照分析。

1.3.7 分子對接

從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（protein data bank，PDB）獲取α-La的3D結(jié)構(gòu)（PDB編號：1F6S），從NCBI網(wǎng)站下載Q3G的三維結(jié)構(gòu)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5280804），再采用AutoDock Tools 1.5.6對α-La和Q3G的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化處理，生成.pdb文件，用于后續(xù)分子對接。利用Discovery Studio 2017軟件擬合配體與氨基酸殘基之間的相互作用關(guān)系，參數(shù)如下：對接盒子中心坐標(biāo)（X，Y，Z：46.76，99.312，12.307），盒子大小為60 ?×60 ?×60 ?，格點(diǎn)間距0.375 ?，對接次數(shù)設(shè)為100，采用拉馬克遺傳算法進(jìn)行擬合，并選擇具有最低結(jié)合能的構(gòu)象作為模型用于后續(xù)分析。

1.3.8 糖基化位點(diǎn)鑒定

1.3.81 樣品的水解

參考ZhangLu等[14]的方法，使用SDT緩沖液（4% SDS、100 mmol/L Tris-HCl、1.0 mmol/L DTT，pH 7.4）、50 mmol/L IAA溶液（溶于UA緩沖液：8.0 mol/L尿素、150 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0）和碳酸氫銨緩沖液（100 mmol/L，pH 8.5）對糖基化α-La溶液進(jìn)行變性、還原和烷基化處理。然后用胰蛋白酶在37 ℃水解糖蛋白16 h，并用50%三氟乙酸溶液終止水解。最后將水解產(chǎn)物于14000 r/min離心10 min，收集過濾的蛋白水解肽用于UPLC-Q-Orbitrap MS/MS分析。

1.3.82 UPLC-Q-Orbitrap MS/MS分析

采用3000RSLCnano液相色譜系統(tǒng)對蛋白質(zhì)水解肽進(jìn)行分離。流動相A和流動相B分別為含0.1%甲酸的超純水和含0.1%甲酸的乙腈組成。洗脫程序為：0～6 min，96% A、4% B；6～50 min，96%～75% A、4%～25%B；50～58 min，75%～60% A、25%～40% B；58～61min，60%～15% A、40%～85% B；61～66 min，15% A、85% B；66～73 min，96% A、4% B。流速300 nL/min；進(jìn)樣量2.0 μL。

采用UPLC-Q-Orbitrap MS/MS獲取肽段的MS和MS/MS數(shù)據(jù)。MS參數(shù)為：負(fù)離子模式，質(zhì)量掃描范圍：m/z300～1800；裂解模式：電子轉(zhuǎn)移解離（electron transfer dissociation，ETD）和高能碰撞解離；MS分辨率：60000；自動增益控制為：4×105；最大注射時間：50 ms；歸一化碰撞能量：30 eV。MS/MS參數(shù)：分辨率15000；自動增益控制：4×105；最大注射時間：50 ms；歸一化碰撞能量：30 eV。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗重復(fù)3 次，采用IBM SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以±s表示。通過單因素方差分析評價樣品之間的差異顯著性（P＜0.05，差異顯著）；采用OriginPro 2017對數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖（OriginLab Corp，USA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離氨基含量

美拉德反應(yīng)誘導(dǎo)的糖基化主要發(fā)生在Lys殘基的ε-氨基上，而在組氨酸的咪唑基團(tuán)、色氨酸的吲哚基團(tuán)、精氨酸（Arg）殘基的胍基和蛋白質(zhì)的N端上發(fā)生的程度較低，因此，Lys殘基上游離氨基的數(shù)量可反映糖基化的程度[15]。如圖1所示，Q3G顯著提高了糖基化過程中游離氨基的含量，呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)，且效果強(qiáng)于陽性對照品AG。當(dāng)添加Q3G濃度為3 mmol/L時，體系中的游離氨基質(zhì)量濃度最高，達(dá)0.693 mg/mL，約為控制組（0.521 mg/mL）的1.33 倍。以上結(jié)果表明Q3G阻止了α-La游離氨基參與糖基化反應(yīng)，減緩了糖基化反應(yīng)的進(jìn)程，可能的原因是Q3G通過清除活性自由基減少了游離氨基的氧化。Dias等[16]通過熒光分析測定氨基酸氧化的標(biāo)記物也發(fā)現(xiàn)槲皮素和蘆丁有同樣的效果，與本研究一致。

圖1 Q3G和AG對糖基化過程中游離氨基含量的影響Fig.1 Effects of Q3G and AG on the content of free aminos in α-La/fructose glycosylation system

2.2 果糖胺分析

果糖胺是非酶糖基化早期標(biāo)志物，通過測定其含量可考察Q3G對非酶糖基化早期反應(yīng)的抑制能力。如圖2所示，Q3G顯著抑制了糖基化過程中果糖胺的形成，且存在濃度依賴性。當(dāng)Q3G添加濃度為1、2 mmol/L和3 m m o l/L 時，果糖胺濃度分別為1.69、1.21、1.26 mmol/L，顯著低于控制組（2.09 mmol/L）和AG組（P＜0.05）。同時，添加2 mmol/L與3 mmol/L Q3G的反應(yīng)體系中果糖胺含量無顯著差異（P＞0.05），表明添加2 mmol/L的Q3G對果糖胺生成的抑制作用已達(dá)到峰值。以上結(jié)果表明Q3G能延緩糖基化早期反應(yīng)的進(jìn)程，這可能是由于Q3G參與螯合金屬離子，降低了糖化蛋白的氧化作用[17]；同時，Q3G可能通過與α-La形成絡(luò)合物，影響了游離氨基對還原糖羰基的可及性，進(jìn)而減少了果糖胺的形成[18]。

圖2 AG和Q3G對糖基化過程中果糖胺濃度的影響Fig.2 Effects of AG and Q3G on the concentration of fructosamine in α-La/fructose glycosylation system

2.3 褐變程度分析

糖基化反應(yīng)初期產(chǎn)物進(jìn)一步裂解氧化，產(chǎn)生一系列小分子，這些小分子是褐色色素形成的主要前體物質(zhì)，通過測定294 nm波長處的吸光度反映其含量，并體現(xiàn)樣品褐變程度[19]。如圖3所示，控制組、添加1、2 mmol/L和3 mmol/L Q3G實驗組的吸光度分別為1.1、1.026、1.096、1.104，Q3G的添加改變了反應(yīng)體系在294 nm波長處的吸光度，含1 mmol/L Q3G實驗組效果最好，其吸光度顯著低于控制組；含3 mmol/L Q3G實驗組的吸光度與控制組和3 mmol/L AG組（1.107）無顯著差異（P＞0.05）。以上結(jié)果說明Q3G顯著抑制了糖基化導(dǎo)致的褐變，這可能是由于Q3G通過自由基清除活性減緩了初期產(chǎn)物的氧化裂解[20-21]。Zhang Lu等[14]也報道，槲皮素、山柰酚、異鼠李素和楊梅素等黃酮醇化合物能緩解OVA-果糖糖基化引起的褐變，且呈劑量依賴性。另外，多酚的鄰苯二酚基團(tuán)會氧化成醌導(dǎo)致褐變，這可能是高濃度Q3G導(dǎo)致褐變程度加深的原因[22]。

圖3 Q3G和AG對糖基化過程中褐變程度的影響Fig.3 Effects of Q3G and AG on browning degree in α-La/fructose glycosylation system

2.4 5-HMF含量的測定

5-HMF是還原糖通過異構(gòu)和脫水產(chǎn)生的呋喃化合物，是糖基化反應(yīng)中期的標(biāo)志性產(chǎn)物[23]，如圖4所示，添加1、2、3 mmol/L的Q3G后，體系中5-HMF質(zhì)量濃度由165.28 μg/mL降至111.64、145.09 μg/mL和158.34 μg/mL；添加1 mmol/L Q3G的α-La-果糖糖基化體系中5-HMF含量最低，顯著低于相同添加量的AG（116.26 μg/mL）（P＜0.05）。然而，隨著Q3G濃度的升高，5-HMF含量呈現(xiàn)升高的趨勢。當(dāng)Q3G濃度低于2 mmol/L時，其能顯著減少5-HMF的形成。代楊艷[24]報道，茶多酚顯著降低了糖基化過程中5-HMF的生成，與本研究結(jié)果相似。此外，前期研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Q3G濃度為36.58 μmol/L時，其對AGEs的抑制率可達(dá)74.66%[10]，表明Q3G能顯著延緩?fù)砥谔腔磻?yīng)的進(jìn)行，造成中期產(chǎn)物如5-HMF等的積累。

圖4 Q3G和AG對糖基化過程中5-HMF生成的影響Fig.4 Effects of Q3G and AG on the generation of 5-HMF in α-La/fructose glycosylation system

2.5 SDS-PAGE分析結(jié)果

α-La由123 個氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量大約為14.2 kDa，糖基化會導(dǎo)致蛋白質(zhì)交聯(lián)而使得其分子質(zhì)量增大如圖5所示，控制組在14.4 kDa略下方和31 kDa處各有一明顯條帶，表明糖基化會引發(fā)α-La的交聯(lián)。卜單等[15]也發(fā)現(xiàn)糖化α-La在SDS-PAGE中存在相似的條帶。添加Q3G之后，31 kDa處蛋白條帶與控制組相比明顯變淺，當(dāng)Q3G濃度為2 mmol/L和3 mmol/L時，31 kDa處條帶的顏色差異不明顯，但顯著淺于AG組。以上結(jié)果說明Q3G能抑制糖化導(dǎo)致的α-La交聯(lián)，添加量為2 mmol/L時的抑制效果最好。Wu Chihao等[7]也通過SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)，槲皮素、兒茶素、蘆丁等化合物也能顯著減輕糖基化引起的蛋白交聯(lián)。

圖5 Q3G和AG對糖化α-La交聯(lián)的影響Fig.5 Effects of Q3G and AG on cross-linking degree of glycated α-La

2.6 分子對接分析

分子對接常用于研究小分子化合物和蛋白的相互作用機(jī)制。經(jīng)過100 次模擬之后，選用結(jié)合能量最低（-8.51 kcal/mol）最穩(wěn)定的模型進(jìn)行后續(xù)的分析（圖6A）。從對接結(jié)果可以看出，Q3G可進(jìn)入α-La的疏水口袋中，通過疏水作用力、范德華力和氫鍵與其氨基酸殘基進(jìn)行結(jié)合。由圖6B、C可知，Q3G和α-La的氨基酸殘基Glu49、Gln54、Lys58、Tyr103、Ala106形成了5 個氫鍵，與氨基酸殘基Thr33、Asn44、Ser47、Phe53、Asn56、Ile59、Trp60形成了范德華力，并和氨基酸殘基Trp104、Leu105形成疏水相互作用。Zhang Yuanyuan等[25]也發(fā)現(xiàn)Ser-47、Glu-49、Gln-54、Asn-56、Tyr-103、Trp-104、Leu-105、Ala-106、Thr-33等氨基酸殘基是α-La的活性位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，小分子化合物受氫鍵、范德華力和疏水相互作用驅(qū)動，能自發(fā)與蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定絡(luò)合物，并影響其構(gòu)象[10,26]。比如：牡荊素是一類經(jīng)典的黃酮類化合物，與蛋白質(zhì)，如牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）結(jié)合時，氨基酸殘基Glu424、Leu112、Asp111和Thr518與牡荊素的B環(huán)或其他羥基形成氫鍵穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而阻止BSA與果糖的反應(yīng)產(chǎn)物形成[27]。因此，Q3G可能是通過與α-La的活性位點(diǎn)結(jié)合形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，影響其空間結(jié)構(gòu)變化，進(jìn)而影響了果糖與α-La的反應(yīng)，達(dá)到抑制糖基化的早、中和晚期產(chǎn)物形成的效果。

圖6 Q3G與α-La結(jié)合的最優(yōu)三維構(gòu)型（A）、Q3G與α-La氨基酸殘基相互作用的三維（B）和二維（C）示意圖Fig.6 Optimal 3D docking conformation of α-La with Q3G (A),and 3D (B) and 2D (C) schematic diagram of Q3G interacting with the amino residues of α-La

2.7 糖基化位點(diǎn)鑒定

為更好地闡明Q3G對α-La-果糖糖基化的抑制機(jī)制，采用UPLC-Q-Orbitrap MS/MS技術(shù)研究Q3G對α-La糖基化位點(diǎn)的影響。糖化的多肽可通過對比其糖化前后的質(zhì)量偏移進(jìn)行確定。Lys、Arg和N末端的氨基是蛋白質(zhì)的潛在糖化位點(diǎn)，而胰酶不會破壞Lys、Arg的糖基化修飾，因此，將C系列和Z系列離子與已發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)組中記錄的離子匹配可對糖基化位點(diǎn)進(jìn)行表征。果糖相對分子質(zhì)量為180，當(dāng)一分子果糖連接到Lys上時，C（n）和C（n-1）之間或Z（m-n）和Z（m-n＋1）之間的質(zhì)量偏移為162＋128，而Arg為162＋156（其中m為特定肽段中氨基酸殘基的數(shù)目，n為Lys/Arg的位置）。當(dāng)多肽所帶電荷為＋1、＋2、＋3、＋4時，單糖基化肽段質(zhì)荷比（Δm/z）分別增加162.0528、81.0264、54.0176和40.5132；而雙糖基化肽段m/z分別增加324.1056、162.0528、108.0352和81.0264。如圖7A、B所示，未糖基化肽段109～122（ALCSEKLDQWLCEK）和115～123（LDQWLCEKL）的m/z峰值分別為593.95713＋和602.80592＋，糖化之后其m/z分別增加了54.0116和81.0263，表明肽段109～122和115～123均被一分子果糖糖化。肽段95～108（ILDKVGINYWLAHK）的m/z由418.25444＋增加至458.75444＋，可推斷該肽段結(jié)合了一分子果糖，Lys98和Lys108是其潛在的糖化位點(diǎn)，利用肽譜（圖7C）分析發(fā)現(xiàn)，C4＋的m/z為649，C3＋的m/z為359，表明C4位（Lys98）發(fā)生糖基化。同理，C14或Z1位未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)規(guī)律，即Lys108不是糖基化位點(diǎn)。參照其鑒定規(guī)律，從添加Q3G前后糖化α-La中分別鑒定出6 個和5 個糖基化位點(diǎn)（表1）。Zhang Lu等[28]通過質(zhì)譜鑒定也發(fā)現(xiàn)了α-La的糖基化位點(diǎn)Lys62、Lys93、Lys98和Lys114。

表1 胰酶消化后檢測到的糖基化多肽Table 1 Glycosylated peptides detected after trypsin digestion

圖7 單個糖化肽109～122和113～123的MS譜（A和B）和單個糖化肽95～108的ETD MS/MS譜圖（m/z 458.75444＋）（C）Fig.7 MS spectra of single glycosylated peptides 109–122 and 113–123(A and B),and ETD MS/MS spectra of single glycosylated peptide 95–108 (m/z 458.75444+) (C)

已有研究證明，糖基化位點(diǎn)的增加和減少與黃酮化合物誘導(dǎo)蛋白質(zhì)Lys殘基周圍的構(gòu)象結(jié)構(gòu)和微環(huán)境的變化有關(guān)[29]。Zhang Lu等[28]報道，槲皮素可以阻止糖基化誘導(dǎo)的BSA結(jié)構(gòu)的展開，改變Lys殘基的微環(huán)境，從而使BSA糖基化位點(diǎn)減少了一個。如圖8所示，受影響的糖基化位點(diǎn)Lys108、Lys93和Lys98位于Q3G所在的疏水口袋內(nèi)，說明Q3G可能通過穩(wěn)定α-La構(gòu)象并影響Lys殘基的微環(huán)境，導(dǎo)致α-La的糖基化活性位點(diǎn)減少了一個，達(dá)到延緩糖基化進(jìn)程和減少有害糖基化產(chǎn)物形成的效果。

圖8 α-La（A）和Q3G-α-La（B）的糖基化位點(diǎn)示意圖Fig.8 Schematic diagram of glycated sites of α-La (A) and Q3G-α-La (B)

3 結(jié)論

以Q3G為研究對象，通過構(gòu)建α-La-果糖糖基化模型，考察Q3G的非酶糖基化抑制作用及其機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Q3G的添加能顯著增加游離氨基含量，且3 mmol/L Q3G可將游離氨基質(zhì)量濃度提高0.172 mg/mL。同時，Q3G能抑制果糖胺及5-HMF的產(chǎn)生，緩解糖基化導(dǎo)致的褐變及α-La交聯(lián)；其中，2 mmol/L Q3G對果糖胺和交聯(lián)α-La的抑制作用最佳。低濃度的Q3G對5-HMF和褐變程度的抑制效果最好，且隨著Q3G濃度升高而有所減弱，但是Q3G抑制效果顯著強(qiáng)于AG。另外，Q3G能緩解糖化α-La的交聯(lián)，且添加量為2 mmol/L時效果最好。分子模擬研究發(fā)現(xiàn)Q3G能通過氫鍵、疏水相互作用和范德華力與α-La的活性氨基酸殘基Glu49、Gln54、Lys58、Tyr103、Ala106、Thr33、Asn44、Ser47、Phe53、Asn56、Ile59、Trp60、Trp104、Leu105作用，改變其疏水口袋內(nèi)的微環(huán)境，從而影響氨基酸殘基與果糖的結(jié)合，抑制非酶糖基化反應(yīng)。同時，UPLC-Q-Orbitrap MS/MS分析也發(fā)現(xiàn)Q3G屏蔽了α-La的糖基化位點(diǎn)Lys93和Lys108，新增了糖基化位點(diǎn)Lys98，達(dá)到延緩非酶糖基化和減少有害糖基化產(chǎn)物形成的效果。綜上，Q3G具有很強(qiáng)的抗糖基化能力，可作為抗糖基化劑或者功能食品配料用于預(yù)防糖尿病并發(fā)癥。然而，Q3G是否能夠添加到食品中發(fā)揮抗糖化作用還有待進(jìn)一步研究。下一步工作計劃通過動物實驗驗證Q3G對體內(nèi)AGEs形成的抑制效果以及對糖尿病并發(fā)癥的預(yù)防作用。